Name: measurement of oxygen consumption rate in acute striatal slices from adult mice
Uploaded: 2022-06-08T12:40:00
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Agradecemos a Wangchen Tsering e Pamela Walter por sua leitura crítica e edição deste manuscrito. Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e Derrame (NINDS) (NS054773 a C.J. L. e NS098393 a H.Z.) e pelo Departamento de Neurociência da Universidade Thomas Jefferson (Startup Funds to H.Z.).

Todos os procedimentos, incluindo o trabalho animal, foram conduzidos de acordo com as diretrizes nacionais e internacionais e foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso de Animais da Universidade Thomas Jefferson. Foram utilizados camundongos FVB/NTac masculinos de 3 a 14 meses. As etapas a seguir foram realizadas em um ambiente não estéril, mas deve-se tomar cuidado para manter tudo o mais limpo possível.
NOTA: O método aqui apresentado foi estabelecido e utilizado na pesquisa relatad...

<ol>
	<li>Hauser, D. N., Hastings, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+and+oxidative+stress+in+Parkinson's+disease+and+monogenic+parkinsonism.">Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in Parkinson's disease and monogenic parkinsonism.</a> Neurobiology of Disease. 51, 35-42 (2013).</li><li>Swerdlow, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+and+mitochondrial+cascades+in+Alzheimer's+disease.">Mitochondria and mitochondrial cascades in Alzheimer's disease.</a> Journal of Alzheimer's Disease: JAD. 62 (3), 1403-1416 (2018).</li><li>Lou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+consumption+deficit+in+Huntington+disease+mouse+brain+under+metabolic+stress.">Oxygen consumption deficit in Huntington disease mouse brain under metabolic stress.</a> Human Molecular Genetics. 25 (13), 2813-2826 (2016).</li><li>Amo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+membrane+potential+decrease+caused+by+loss+of+PINK1+is+not+due+to+proton+leak,+but+to+respiratory+chain+defects.">Mitochondrial membrane potential decrease caused by loss of PINK1 is not due to proton leak, but to respiratory chain defects.</a> Neurobiology of Disease. 41 (1), 111-118 (2011).</li><li>Clark, I. 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A., Kitada, T., Shen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+PINK1+causes+mitochondrial+functional+defects+and+increased+sensitivity+to+oxidative+stress.">Loss of PINK1 causes mitochondrial functional defects and increased sensitivity to oxidative stress.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (32), 11364-11369 (2008).</li><li>Gispert, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkinson+phenotype+in+aged+PINK1-deficient+mice+is+accompanied+by+progressive+mitochondrial+dysfunction+in+absence+of+neurodegeneration.">Parkinson phenotype in aged PINK1-deficient mice is accompanied by progressive mitochondrial dysfunction in absence of neurodegeneration.</a> PLoS One. 4 (6), 5777 (2009).</li><li>Heeman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+PINK1+affects+mitochondrial+metabolism,+calcium+homeostasis+and+energy+maintenance.">Depletion of PINK1 affects mitochondrial metabolism, calcium homeostasis and energy maintenance.</a> Journal of Cell Science. 124, 1115-1125 (2011).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pink1+regulates+the+oxidative+phosphorylation+machinery+via+mitochondrial+fission.">Pink1 regulates the oxidative phosphorylation machinery via mitochondrial fission.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12920-12924 (2011).</li><li>Villeneuve, L. M., Purnell, P. R., Boska, M. D., Fox, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+expression+of+Parkinson's+disease-related+mitochondrial+abnormalities+in+PINK1+knockout+rats.">Early expression of Parkinson's disease-related mitochondrial abnormalities in PINK1 knockout rats.</a> Molecular Neurobiology. 53 (1), 171-186 (2016).</li><li>Morais, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PINK1+loss-of-function+mutations+affect+mitochondrial+complex+I+activity+via+NdufA10+ubiquinone+uncoupling.">PINK1 loss-of-function mutations affect mitochondrial complex I activity via NdufA10 ubiquinone uncoupling.</a> Science. 344 (6180), 203-207 (2014).</li><li>Morais, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkinson's+disease+mutations+in+PINK1+result+in+decreased+Complex+I+activity+and+deficient+synaptic+function.">Parkinson's disease mutations in PINK1 result in decreased Complex I activity and deficient synaptic function.</a> EMBO Molecular Medicine. 1 (2), 99-111 (2009).</li><li>Mookerjee, S. A., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+intracellular+rates+of+glycolytic+and+oxidative+ATP+production+and+consumption+using+extracellular+flux+measurements.">Quantifying intracellular rates of glycolytic and oxidative ATP production and consumption using extracellular flux measurements.</a> The Journal of Biological Chemistry. 292 (17), 7189-7207 (2017).</li><li>Ferrick, D. 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N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+high-throughput+assay+for+respiration+in+isolated+brain+microvessels+reveals+impaired+mitochondrial+function+in+the+aged+mice.">A novel high-throughput assay for respiration in isolated brain microvessels reveals impaired mitochondrial function in the aged mice.</a> Geroscience. 40 (4), 365-375 (2018).</li><li>Sperling, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+respiration+in+isolated+murine+brain+mitochondria:+implications+for+mechanistic+stroke+studies.">Measuring respiration in isolated murine brain mitochondria: implications for mechanistic stroke studies.</a> Neuromolecular Medicine. 21 (4), 493-504 (2019).</li><li>Picard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+structure+and+function+are+disrupted+by+standard+isolation+methods.">Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods.</a> PLoS One. 6 (3), 18317 (2011).</li><li>Schuh, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+microplate-based+respirometry+for+hippocampal+slices+and+analysis+of+respiratory+capacity.">Adaptation of microplate-based respirometry for hippocampal slices and analysis of respiratory capacity.</a> Journal of Neuroscience Research. 89 (12), 1979-1988 (2011).</li><li>Zhi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+PINK1+causes+age-dependent+decrease+of+dopamine+release+and+mitochondrial+dysfunction.">Loss of PINK1 causes age-dependent decrease of dopamine release and mitochondrial dysfunction.</a> Neurobiology of Aging. 75, 1-10 (2019).</li><li>Fried, N. T., Moffat, C., Seifert, E. L., Oshinsky, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+mitochondrial+analysis+in+acute+brain+sections+from+adult+rats+reveals+mitochondrial+dysfunction+in+a+rat+model+of+migraine.">Functional mitochondrial analysis in acute brain sections from adult rats reveals mitochondrial dysfunction in a rat model of migraine.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 307 (11), 1017-1030 (2014).</li><li>Qi, G., Mi, Y., Yin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+brain+metabolic+function+ex+vivo+with+acute+mouse+slice+punches.">Characterizing brain metabolic function ex vivo with acute mouse slice punches.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100559 (2021).</li><li>Underwood, E., Redell, J. B., Zhao, J., Moore, A. N., Dash, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+assessing+tissue+respiration+in+anatomically+defined+brain+regions.">A method for assessing tissue respiration in anatomically defined brain regions.</a> Scientific Reports. 10 (1), 13179 (2020).</li></ol>

O método que desenvolvemos permitiu que um analisador XF fosse usado para medir OCR em fatias estriais de camundongos adultos durante um período de tempo de 4 h. Este método fornece uma nova maneira de medir bioenergésicos celulares em socos extirpados de estruturas cerebrais anatomicamente definidas. Como as amostras de tecido que estão sendo analisadas são bastante pequenas, os parâmetros metabólicos de áreas cerebrais específicas envolvidas em uma doença podem ser investigados. Além disso, o uso de fatias ...

A disfunção mitocondrial tem sido implicada em várias doenças neurológicas, incluindo a doença de Parkinson (DP), doença de Huntington e doença de Alzheimer 1,2,3. Modelos PD como camundongos e ratos pink1 knockout (KO) exibem função mitocondrial prejudicadafunção 4,5,6,7,8,9,10,11. Mitocôndrias isoladas do estrias (STR) ou cérebro inteiro do camundongo PINK1 KO envelhecem exibem defeitos no complexo I 7,10,12,13. Medir diretamente a taxa de consumo de oxigênio (OCR) é um dos métodos mais comuns para avaliar a função mitocondrial, uma vez que o OCR está associado à produção de ATP, a principal função das mitocôndrias14. Portanto, medir o OCR em modelos de doenças ou amostras/tecidos derivados do paciente pode ajudar a investigar como a disfunção mitocondrial leva à doença.
Atualmente, existem várias maneiras de medir o OCR mitocondrial, incluindo o eletrodo Clark e outros eletrodos O2, corante fluorescente O2, e o analisador de fluxo extracelular 15,16,17,18,19. Como vantagem, os métodos baseados em eletrodos O2 permitem que vários substratos sejam facilmente adicionados. No entanto, são insuficientes para medir simultaneamente várias amostras. Comparado aos métodos tradicionais baseados em eletrodos O2, o analisador de fluxo extracelular, uma ferramenta comumente usada para OCR em culturas celulares ou mitocôndrias purificadas, oferece melhor throughput 15,18,20. No entanto, todos esses métodos são geralmente aplicados para medir o OCR em mitocôndrias isoladas ou culturas celulares 6,16,17,19,20,21. O isolamento das mitocôndrias causa danos inadvertidos, e mitocôndrias extraídas ou culturas celulares são menos relevantes fisiologicamente do que as fatias cerebrais intactas22. Mesmo quando microeletrodos são usados em fatias, eles são menos sensíveis e mais difíceis de operar do que em células cultivadas23.
Para enfrentar esses desafios, desenvolvemos um método utilizando o analisador de fluxo extracelular XF24, que permite a análise de múltiplos parâmetros metabólicos a partir de fatias cerebrais estriais agudas de camundongos24. Esta técnica fornece quantificação contínua direta da respiração mitocondrial através do OCR. Em suma, pequenas seções de fatias cerebrais striatais são colocadas em poços da placa de ilhota, e o analisador usa biosensores à base de oxigênio e prótons fluorescentes para medir a taxa de acidificação OCR e extracelular, respectivamente 17,21,25.
Uma das características únicas do analisador são os quatro poços de injeção, que permitem a medição contínua do OCR enquanto injetam sequencialmente até quatro compostos ou reagentes; isso permite a medição de vários parâmetros de respiração celular, como OCR mitocondrial basal, OCR ligado a ATP e OCR mitocondrial máximo. Os compostos injetados durante as medições para o protocolo aqui mostrado foram concentrações de trabalho de piruvato de 10 mM na primeira solução bem (porta A), 20 μM de oligomicina na segunda solução bem (porta B), 10 μM cianeto de carbonil 4-(trifluorometoxy) fenilhidrazone (FCCP) no terceiro poço (porta C), e 20 μM antimicina A no quarto poço (porta D), com base em Fried et al.25. Deve-se notar que essas concentrações foram concentrações de trabalho, e soluções de estoque de 10x, 11x, 12x e 13x foram injetadas nas portas de solução A a D, respectivamente. O objetivo de utilizar cada solução foi o seguinte: 1) O piruvato foi necessário, pois, sem ela, a adição de FCCP teria uma resposta OCR reduzida causada por uma limitação dos substratos disponíveis; 2) A oligomicina inibe a synthase ATP e permite a medição da respiração ligada ao ATP; 3) A FCCP desacoplula a oxidação da fosforilação e permite a medição da capacidade mitocondrial máxima; 4) A antimicina inibe o complexo III na cadeia de transporte de elétrons e, portanto, permite a medição do OCR não ligado às mitocôndrias.
A concentração de oligomicina utilizada foi determinada com base nas seguintes razões: 1) A dose recomendada de oligomicina para a maioria dos tipos de células (mitocôndrias isoladas ou culturas celulares) é de 1,5 μM. Pela experiência, geralmente 3x-10x da dose de células dissociadas é usado para os experimentos de fatia, uma vez que pode haver um gradiente, e a penetração da solução nas fatias leva tempo. Portanto, a concentração deve estar na faixa de 5 μM a 25 μM. 2) Foi selecionada uma concentração de 20 μM com base em Fried et al.25. Maiores concentrações não foram tentadas devido à toxicidade não específica da oligomicina. 3) No relatório de Underwood et al.26, os autores fizeram um experimento de titulação para oligomicina e descobriram que as doses em 6,25, 12,5, 25 e 50 μg/mL resultaram em inibição semelhante. A maior concentração de oligomicina (50 μg/mL) não inibiu mais, mas apresentou maior variância. 4) Em nossa observação, o fator determinante parece ser a capacidade penetrante da oligomicina. É difícil para a oligomicina penetrar no tecido, e é por isso que leva pelo menos 7 a 8 ciclos para chegar ao planalto, a resposta máxima. Desde que atinja o planalto, a inibição é assumida como máxima.
Um dos principais desafios técnicos da adaptação do analisador de fluxo extracelular para medir OCR em fatias estriais é prevenir a hipóxia tecidual. Como o tampão não foi oxigenado durante toda a duração das medições (cerca de 4h), a hipóxia foi um problema central. Isso é especialmente verdadeiro para amostras de tecido mais espessas, onde o oxigênio não pode se difundir em todas as amostras. Para superar esse problema, as fatias foram seccionadas com 150 μm de espessura, para que o oxigênio ambiente pudesse penetrar no meio das fatias cerebrais. Além disso, 4 mg/mL de soro bovino albumina (BSA) foi adicionado ao buffer de fluido cerebrospinal artificial pré-oxigenado (ACSF), o que facilitou a determinação do OCR máximo, como sugerido anteriormente23. Examinamos se as células estavam vivas. Primeiro, hoechst 33258 (10 μM) e iodeto de propidium (10 μM) foram usados para examinar se as células eram saudáveis nessas condições. Em seguida, examinamos se os neurônios espinhosos médios eram funcionalmente saudáveis usando a gravação de grampo de remendo. Avaliamos ainda se os terminais de dopamina (DA) nas fatias estriais eram funcionalmente saudáveis, medindo a liberação de DA usando voltammemetria de varredura rápida. Os resultados mostraram que as fatias estriais que não estavam oxigenadas (grupo ACSF/BSA) eram tão saudáveis quanto o grupo de controle oxigenado24.
Em seguida, testamos diferentes combinações de espessura de fatia e tamanho do soco para determinar as condições ideais de fatia striatal para o ensaio de respiração de fluxo. Foram utilizadas fatias estriais dorsais com espessuras diferentes (150 μm e 200 μm) e tamanhos de perfuração (1,0 mm, 1,5 mm e 2,0 mm de diâmetro) para análise de OCR utilizando o analisador. As fatias striatais de 150 μm de espessura com um tamanho de soco de 1,5 mm de diâmetro tiveram a maior eficiência de acoplamento e OCRs dentro de uma faixa ideal para o analisador24.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Accumet AB150 pH benchtop meter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-636-AB150</td>
			<td>To measure pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A from streptomyces sp.</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A8674</td>
			<td>To inhibit complex III of the mitochondria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A6003</td>
			<td>To make modified artificial cerebrospinal fluid (BSA-ACSF)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C2920</td>
			<td>To uncouple mitochondrial respiration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G8270</td>
			<td>To make artificial cerebrospinal fluid (ACSF)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D8418</td>
			<td>To dissovle compounds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>H3375</td>
			<td>To make artificial cerebrospinal fluid (ACSF)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidified non-CO2 incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-683-230D</td>
			<td>To hydrate plates at 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>O4876</td>
			<td>To inhibit mitochondrial ATP synthase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td></td>
			<td>sealing film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3616</td>
			<td>To inhibit complex I of the mitochondria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF Calibrant Solution 500 mL</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>103681-100</td>
			<td>Solution for seahorse calibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF Extracellular Flux Analyzer</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>Equipment used to analyze oxygen consumption rate, old generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe24 Extracellular Flux Analyzer</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>Equipment used to analyze oxygen consumption rate, new generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF24 FluxPaks</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>101174-100</td>
			<td>Package of flux analyzer sensor cartridges, tissue culture plates, capture screens,&#160; calibrant solution and calibration plates; assay kit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P2256</td>
			<td>To prevent any substrate-limiting constraints of substrate supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel biopsy punches</td>
			<td>Miltex</td>
			<td></td>
			<td>Device used to punch slices</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell culture dish, 35 x 10 mm</td>
			<td>Eppendrof</td>
			<td>0030700102</td>
			<td>Used for slice punch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200</td>
			<td>To slice brain tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Thermo Scientific Precision</td>
			<td>282-115</td>
			<td>To heat buffer and solutions</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of oxygen consumption rate in acute striatal slices from adult mice

Mitocôndrias desempenham um papel importante na produção de ATP celular, regulação reativa de espécies de oxigênio e controle de concentração de Ca2+ . A disfunção mitocondrial tem sido implicada na patogênese de múltiplas doenças neurodegenerativas, incluindo a doença de Parkinson (DP), a doença de Huntington e a doença de Alzheimer. Para estudar o papel das mitocôndrias em modelos dessas doenças, podemos medir a respiração mitocondrial via taxa de consumo de oxigênio (OCR) como proxy para a função mitocondrial. OCR já foi medido com sucesso em culturas celulares, bem como mitocôndrias isoladas. No entanto, essas técnicas são menos fisiologicamente relevantes do que medir OCR em fatias cerebrais agudas. Para superar essa limitação, os autores desenvolveram um novo método utilizando um analisador Seahorse XF para medir diretamente o OCR em fatias estriatais agudas de camundongos adultos. A técnica é otimizada com foco no estriato, uma área cerebral envolvida na DP e na doença de Huntington. O analisador realiza um ensaio de célula viva usando uma placa de 24 poços, o que permite a medição cinética simultânea de 24 amostras. O método usa pedaços circulares de fatias cerebrais estriatais como amostras. Demonstramos a eficácia desta técnica identificando um OCR basal inferior em fatias estriais de um modelo de rato de DP. Este método será de amplo interesse para pesquisadores que trabalham no campo da DP e da doença de Huntington.

O primeiro passo deste estudo foi otimizar a espessura da fatia e o tamanho do soco usado para extirver uma seção do estriato da fatia (Figura 3A). Uma fatia com 150 μm de espessura e um tamanho de soco de 1,5 mm deu os melhores resultados determinados pela eficiência do acoplamento (Figura 3B-C). Como mostrado na Figura 3B, o OCR é relativamente estável por 5 h com menos de 10% de execução....

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Measurement of Oxygen Consumption Rate in Acute Striatal Slices from Adult Mice

A taxa de consumo de oxigênio (OCR) é um proxy comum para a função mitocondrial e pode ser usada para estudar diferentes modelos de doenças. Desenvolvemos um novo método usando um analisador Seahorse XF para medir diretamente o OCR em fatias estriatais agudas de camundongos adultos que é mais fisiologicamente relevante do que outros métodos.

Medição da taxa de consumo de oxigênio em fatias estriatais agudas de camundongos adultos

Mitochondria play an important role in cellular ATP production, reactive oxygen species regulation, and Ca2+ concentration control. Mitochondrial ...

Desenvolvemos um novo método usando um analisador XF de cavalo marinho para medir diretamente a taxa de consumo de oxigênio. Mas proxy comum para função mitocondrial em fatia de slide aguda de camundongos adultos. Este método mede um celular por energia em perfurações de estruturas cerebrais anatomicamente definidas.O uso de fatias agudas imita mais de perto o ambiente celular fisiológico que não pode ser alcançado das formas isoladas de células mitocondriais ou culturais. Este método será de amplo interesse para pesquisadores que trabalham no campo da doença de Parkinson e da doença de Huntington. Para começar, abra o kit de ensaio de fluxo extracelular e remova o cartucho do sensor e a placa de utilidade.Em seguida, coloque o cartucho do sensor de lado e não toque nos sensores. Em seguida, adicione 600 microliters de solução calibrada a cada parede da placa de utilidade. Coloque o cartucho do sensor em cima da placa do utilitário e submerse os sensores na solução calibrada, garantindo que o entalhe triangular do utilitário e da placa do cartucho do sensor estejam corretamente alinhados.Depois, sele o kit de ensaio de fluxo extracelular com filme de vedação para evitar a evaporação da solução calibrada e, em seguida, coloque-o em uma incubadora Celsius de 37 graus não suplementada com dióxido de carbono ou oxigênio, durante a noite. Abra a micro placa de captura do ilhó e tire a placa do ilhó para sentar o tecido. Em seguida, aqueça um volume apropriado de tampão de fluido espinhal cerebral artificial modificado pré-oxigenado para 37 graus Celsius em um tubo de 50 mililitros.Em seguida, adicione BSA a uma concentração final de quatro miligramas por mililitro para preparar o tampão de respiração. Adicione 625 microliters de tampão de respiração a cada poço da placa de ilhós cuidadosamente, evitando sacudir a placa, garantindo que não haja bolhas de ar no tampão de cada poço. Disseque imediatamente o cérebro em 10 mililitros de solução de corte pré-oxigenada gelada.Em seguida, utilizando uma seção vibratome coronal striatal fatias, seguindo a instrução do fabricante a uma espessura de 150 micrômetros em solução de corte pré-oxigenado gelado. Em seguida, recupere as fatias em 50 mililitros de fluido cerebral cerebral artificial oxigenado. E mantê-los em solução por até 30 minutos em temperatura ambiente.Após a recuperação, transfira as fatias para uma placa de Petri de 35 por 10 milímetros com cinco milímetros de tampão de respiração. O uso de um soco de biópsia de aço inoxidável cria um pedaço circular de tecido na área desejada do cérebro fatiado pressionando suavemente o soco enquanto mantém a fatia no buffer. Em seguida, remova o resto do tecido, levante o soco e remova o pedaço circular de tecido no tampão.Em seguida, corte a extremidade de uma ponta de pipeta de um mililitro para fazer um furo com um ponto-cinco a dois pontos-zero milímetro de diâmetro e use-o para segurar e transferir a fatia perfurada para o topo da tela de captura. Sucção um pedaço de tecido cerebral perfurado e coloque cuidadosamente o tecido sobre o lado da malha da tela de captura, um pedaço circular de plástico com a malha presa a um lado. Usando um tecido de papel seque suavemente a tela de captura e remova a umidade, que permite que o tecido fique pegajoso e preso ao centro da malha.Em seguida, segure a tela de captura de lado cortado com pinças e coloque-a em um dos poços da placa de ilhó incubadora. Em seguida, incubar a placa de ilhó a 37 graus Celsius em uma incubadora por pelo menos 30 minutos para permitir a temperatura e o equilíbrio do pH antes de executar o ensaio. Diluir os compostos desejados e modificado fluido cerebral cerebral sem BSA para a concentração final de estoque da concentração de trabalho para os portos A a D, respectivamente.Precarreça suavemente 75 microliters dos compostos diluídos nas portas de injeção apropriadas do cartucho do sensor, colocando as pontas no meio das portas de injeção em um ângulo de 45 graus com a ponta contra a parede da porta de injeção, pois a inserção completa pode causar vazamento composto através da porta. Depois, retire cuidadosamente as pontas das portas sem criar bolhas de ar e não toque em nenhuma parte do cartucho para evitar aliviar bolhas de ar. Em seguida, inspecione visualmente as portas de injeção para mesmo carregar, garantindo que todo o líquido esteja na porta e que não haja gotas residuais em cima do cartucho.Depois de colocar o cartucho do sensor na placa do utilitário coloque-o em uma incubadora por 30 minutos para permitir que ele aqueça até 37 graus Celsius enquanto manuseia cuidadosamente apenas segurando a placa de utilidade e movendo o mínimo possível. Primeiro carregue o modelo de ensaio no software e, em seguida, pressione o botão de partida verde. Em seguida, carregue o cartucho do sensor na placa do utilitário na bandeja do instrumento, garantindo que a placa fique correta e esteja plana, carregando o cartucho de sensor cheio de drogas no analisador para calibração.Depois, siga as instruções na tela para calibrar. E equilibre os sensores. Uma vez feito o passo de equilíbrio, remova a placa de calibração e substitua-a pela placa de ilhó contendo as fatias de malha e tecido.Em seguida, meça a taxa de consumo de oxigênio em cada poço da placa, usando os protocolos de ensaio descritos no manuscrito. A seguir, analise os dados de medição da taxa de consumo de oxigênio e os dados de eficiência de acoplamento. As taxas de consumo de oxigênio para diferentes espessuras e tamanhos de perfuração de fatias no grupo controle mostraram respiração basal estável ao longo de toda a medição e foram proporcionais ao volume da fatia.Além disso, as taxas de consumo de oxigênio foram relativamente estáveis por cinco horas, com menos de 10% de retração. A eficiência do acoplamento mitocondrial foi comparada e a fatia na espessura de 150 micrômetros e um tamanho de soco de 1,5 milímetros mostraram a maior eficiência de acoplamento. As taxas de consumo de oxigênio foram medidas para grupos jovens e antigos de pink1 nocaute e seus camundongos de tipo selvagem com correspondência etária.A taxa de consumo de oxigênio basal foi semelhante tanto nos grupos de nocaute quanto de tipo selvagem para camundongos jovens. No entanto, diminuiu para os ratos nocaute no antigo grupo. No entanto, a disfunção mitocondrial nos camundongos eliminatórios foi observada para a faixa etária jovem, indicada pela diminuição da eficiência de acoplamento causada pelo nocaute de Pink1.As etapas críticas deste protocolo incluem preparar fatias cerebrais, transferi-las para o topo da tela de captura, colocar slides em poços e mantê-los conectados à tela de captura durante as medições.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Acute Hippocampal Slices from Rats and Transgenic Mice for the Study of Synaptic Alterations during Aging and Amyloid Pathology

Preparação de fatias do hipocampo aguda de ratos e camundongos transgênicos para o Estudo das Alterações Synaptic durante o envelhecimento e amilóide Patologia

The rodent hippocampal slice preparation is perhaps the most broadly used tool for investigating mammalian synaptic function and plasticity. The ...

Neurociência

Presynaptic Dopamine Dynamics in Striatal Brain Slices with Fast-scan Cyclic Voltammetry

Pré-sináptica de dopamina Dynamics em fatias de cérebro estriado com Fast-scan voltametria cíclica

Extensive research has focused on the neurotransmitter dopamine because of its importance in the mechanism of action of drugs of abuse (e.g. cocaine and ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

Lapso de tempo de imagem de migração neuroblastos em fatias agudas do cérebro anterior Rato Adulto

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Preparation of Acute Subventricular Zone Slices for Calcium Imaging

Preparação de fatias agudas zona subventricular for Imaging Cálcio

The subventricular zone (SVZ) is one of the two neurogenic zones in the postnatal brain. The SVZ contains densely packed cells, including neural ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Dois registros eletrofisiológicos de sinapticamente evocadas Respostas astroglial e neuronal em fatias hipocampais agudas

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

Imagens intracelular Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Sinais em estriado astrócitos de ratos adultos, através de indicadores de cálcio geneticamente codificados

Astrocytes display spontaneous intracellular Ca2+ concentration fluctuations ([Ca2+]i) and in several settings respond to neuronal excitation with ...

Investigation of Synaptic Tagging/Capture and Cross-capture using Acute Hippocampal Slices from Rodents

Investigação de Synaptic Tagging / Captura e-captura Cruz usando aguda fatias do hipocampo de roedores

Synaptic tagging and capture (STC) and cross-tagging are two important mechanisms at cellular level that explain how synapse-specificity and associativity ...

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

Prepara frescas fatias da retina de adultos do Zebrafish para Ex Vivo experimentos de imagem

The retina is a complex tissue that initiates and integrates the first steps of vision. Dysfunction of retinal cells is a hallmark of many blinding ...

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

Avaliação da indução de depressão em longo prazo em fatias Cerebelares adultas

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...