6.7K Views
•
10:37 min
•
January 21st, 2022
DOI :
January 21st, 2022
•0:04
Introduction
0:46
Construction of Perfusion Apparatus and Dissection Platform
2:40
Preparation of the Paraformaldehyde Solution
4:58
Transcardial “Pump-Free” Perfusion
9:18
Results: Histological Analysis Following Gravity-Fed Perfusion
10:09
Conclusion
Transcript
Denne protokol giver en simpel metode til fiksativ perfusion hos mus, der tillader den histologiske undersøgelse af CNS-væv uden betydelige investeringer. Den største fordel ved tyngdekraftsperfusionsmetoden, der præsenteres her, er, at overflodsapparatet kan konstrueres med let tilgængelige komponenter. Demonstration af proceduren vil være Arnav Rana, en MD-ph.d.-studerende fra Dr.Xin Jie Chens laboratorium.
Til at begynde med skal du bruge et skarpt barberblad til at trimme de indre sugerør fra to 500 ml vaskeflasker ved at skære dem flush til indersiden af skruen på hætten. Skær et firkantet hul på fire gange fire centimeter i bunden af hver bufferflaske, og skær derefter et andet lille hul i bunden af hver flaske for at tillade passage af en bøjet mikrospatel i rustfrit stål. Lav derefter en S-formet bøjning i mikrospatlerne, så de kan bruges som kroge til ophængning af bufferflaskerne.
Indsæt de bøjede mikrospatler i de passende åbninger i bufferflaskerne. Tilslut derefter to 25 centimeter lange rør med de ydre flaskestråudtag og tilslut enderne af disse rør sammen med Y-stikket, og tilslut derefter den 2 meter lange slange til den frie ende af Y-stikket. Når stemplet er fjernet fra en 1 milliliter sprøjte, skal du skære sprøjten ca. 6 centimeter væk fra spidsen ved først at score plasten med et barberblad og derefter knække sprøjteplasten skarpt.
Indsæt sprøjtens afskårne overflade i den frie ende af plastrøret til en tilstrækkelig dybde, og sørg for en tæt tætning. Mærk derefter den ene bufferflaske som PFA og den anden som PBS. Mål ca. 1/3 af længden væk fra flaskeåbningen, og tegn en linje rundt om flaskeomkredsen på dette tidspunkt for at angive det passende påfyldningsniveau for perfusatopløsningerne.
Efter at have rettet en stor papirclips, skal du oprette en løkke, der kan passe rundt om slangens omkreds og placere denne løkke rundt om slangen, bare proximal til sprøjten, og læg derefter en passende størrelse styrofoamblok i glasbakken, læg enderne af papirclipsen i styrofoamblokken for at fastgøre slangen og bruge et papirhåndklæde, hæv forenden af glasbakken med ca. 2 centimeter. Efter skylning af et 1-liters bægerglas med destilleret vand fyldes det med ca. 800 ml 18 milliohms molekylærbiologisk vand. Bægerglasset opvarmes i en mikrobølgeovn i tre minutter, eller indtil vandtemperaturen når 65 grader Celsius, og anbring det derefter på en varmeplade eller en omrøringsplade, der opbevares i en røghætte.
Skyl derefter en omrøringsstang med destilleret vand og læg den i bægerglasset. Start omrøreren, og drej kogepladen op til medium varme, så vandtemperaturen ikke går over 70 grader Celsius. Efter at have båret en kirurgisk maske, handsker og laboratoriefrakke måles 40 gram PFA-pulver og tilsættes det i det opvarmede vand, og derefter tilsættes et par dråber 5-molært natriumhydroxid til opløsningen ved hjælp af en overførselspipette.
Lad pulveret opløses helt. Hvis pulveret ikke er helt opløst, tilsættes mere natriumhydroxid efter behov. Når alle PFA næsten er opløst, skal du stoppe omrøringen og opvarmningen og straks tilsætte 100 ml 10x PBS og derefter bruge 18 milliohms molekylærbiologisk vand til at fylde bægerglasset op til 1-liters mærket.
Bægerglasset dækkes med plastfolie, og det anbringes i en fryser på minus 20 grader Celsius, indtil opløsningen når stuetemperatur. Efter kalibrering af en pH-måler ved hjælp af passende standarder måles opløsningens pH, mens bægerglasset er på en omrøringsplade. Der tilsættes saltsyre, indtil pH-værdien når 7,4.
Hvis pH er for lav, tilsættes 5-molært natriumhydroxid for at øge pH. Tilslut derefter en vakuumkolbe til vakuum, og læg en ren keramisk Buchner-tragt med filterpapir i kolben. Når vakuummet er tændt, skal du fugte filterpapiret med en overføringspipette fyldt med 4% PFA-opløsningen og derefter langsomt hælde opløsningen på filterpapiret, indtil hele opløsningen er filtreret.
Efter filtrering opbevares opløsningen i en lysbeskyttet beholder ved 4 grader Celsius indtil brug. I røghætten skal du placere en isopor dissekeringsblok i en glasbakke. Sørg for, at dissekeringsblokken har fem til seks korte nåle til at fastholde musen under operationen og to lange nåle til at understøtte perfusionsrøret.
Skyl derefter perfusionsapparatet med destilleret vand. Når alt vandet er drænet, skal du hænge overflodsflaskerne en meter over dyret, der skal perfunderes, og derefter forberede ikke-steril 1x PBS ved hjælp af 10x PBS fortyndet med molekylærbiologisk vand. Klem perfusionsapparatets hovedlinje ved hjælp af en hæmostat, og klem derefter PFA-linjen med en anden hæmostat.
Når bufferbeholderen er fyldt med PBS, anbringes sprøjteenden af perfusionsapparatet i et bægerglas for at opsamle affaldsbufferen, og hovedledningen fjernes. Mens PBS strømmer gennem linjen, skal du trykke kraftigt på rørets vægge for at fjerne fanget luft. Når al luft er fjernet fra bufferen og hovedledningerne, skal du lukke strømmen ved at placere en hæmostat på hovedledningen.
Fjern derefter hæmostaten fra PFA-linjen, så PBS'en kan strømme retrograd op til PFA-flasken, mens du tapper eventuelle bobler i PFA-linjen. Fortsæt med at tillade PBS i PFA-linjen, indtil den kan ses lige over åbningen af flasken, og okkluder derefter PFA-linjen med en hæmostat for at stoppe strømmen af PBS ind i PFA-flasken. Tilslut derefter sommerfuglinfusionsnålen til perfusionssprøjten, og åbn hovedlinjehæmostaten for at skylle PBS gennem linjen og fjerne bobler fra perfusionssprøjten.
Når boblerne er fjernet, skal du lukke hovedlinjeblødningen. Sørg for, at PBS-flasken nu er ca. 1/3 fuld af PBS. Skyl om nødvendigt PBS gennem hovedledningen eller fyld mere PBS i bufferflasken indtil 1/3 af dens fulde kapacitet.
Når alle bobler er fjernet fra PBS, PFA og hovedledningerne, fyldes PFA-flasken med 4% PFA-opløsning ved stuetemperatur op til det sorte mærke på flasken. Forbered dig derefter på ikke-overlevelseskirurgi ved først at rengøre de nødvendige instrumenter med vand og derefter med 70% ethanol. Efter at have sikret en bedøvet C57 sort 6J mus til styrofoamblokken, skal du begynde operationen ved at løfte maveskindet med hudtang og skære gennem bugvæggen med stor saks.
Fortsæt abdominal snit overlegent mod leveren, fjern derefter leveren fra den forreste abdominalvæg og fortsæt det indledende snit overlegent mod membranen. Når snittet når membranen, skal du ved hjælp af findiskerende saks lave et hul i membranen og skære gennem ribbenene på musens højre side cirka halvvejs til højre axilla, og lav derefter et lignende, men længere snit gennem venstre side af membranen næsten helt til venstre axilla. Reflekter brystvæggen og fastgør den til styrofoamblokken.
Efter at have identificeret venstre ventrikel ved hjælp af finbuede pincet, hold hjertet stabilt med let tryk, åbn derefter hovedlinjehæmostaten for at lade PBS strømme gennem nålen og straks gennembore venstre ventrikel med nålen. Sørg for, at nålen ikke indsættes mere end 0,5 centimeter i ventriklen. Hvil derefter sommerfuglslangen på et X lavet i styrofoam med to store 18-gauge nåle.
Identificer den ringere vena cava, når den forlader leveren og transect den ved hjælp af fin dissekerende saks. Fortsæt PBS-perfusion, indtil væsken, der strømmer ud af den ringere vena cava, er blodfri, og arbejd derefter hurtigt, okkluder PBS-linjen med en hæmostat og åbn PFA-linjen. Lad PFA'en gennembløde i et par minutter, indtil halen begynder at krølle.
Når halen begynder at krølle, skal du starte en 50-minutters timer. Efter 50 minutter skal du lukke hovedlinjen med en hæmostat og trække nålen ud af venstre ventrikel. Placer derefter musen i en mærket beholder med PFA-opløsning ved 4 grader Celsius natten over.
Perfusion af høj kvalitet er indikeret ved fravær af blod i leveren, rygmarven og dybe centralnervesystemstrukturer. Blodet observeret i hjernen er placeret mellem kraniet og dura mater og er derfor ikke problematisk eller tyder på perfusion af dårlig kvalitet. Påvisning af alfa-synuclein efter denne perfusionsmetode viser, at phosphoryleret alfa-synuclein akkumuleres signifikant højere hos 15,5 måneder gamle symptomatiske mus i forhold til syv måneder gamle asymptomatiske mus, der udtrykker humant A53T alfa-synuclein.
Dette resultat er i overensstemmelse med rapporter, der beskriver en berigelse af cytopatologi i rygmarvens forreste horn og mellemhjernen hos disse mus. Det er vigtigt, at ingen abdominale organer skæres, når de får adgang til brysthulen. Desuden må perfusionsnålen ikke placeres for dybt inde i venstre ventrikel.
En bekvem tyngdekraftsfodret perfusionsmetode til histologisk analyse af musens centralnervesystem præsenteres. Immunofluorescerende påvisning af phosphoryleret α-synuclein er demonstreret i en musemodel af Parkinsons sygdom. Dette arbejde beskriver også omfattende transkardieperfusion, dissektion, vævsfrysning / indlejring og frosne sektioneringstrin.
Explore More Videos
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved