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January 21st, 2022
DOI :
January 21st, 2022
•0:04
Introduction
0:46
Construction of Perfusion Apparatus and Dissection Platform
2:40
Preparation of the Paraformaldehyde Solution
4:58
Transcardial “Pump-Free” Perfusion
9:18
Results: Histological Analysis Following Gravity-Fed Perfusion
10:09
Conclusion
Transcript
यह प्रोटोकॉल चूहों में फिक्सेटिव छिड़काव की एक सरल विधि प्रदान करता है जो महत्वपूर्ण निवेश के बिना सीएनएस ऊतकों के हिस्टोलॉजिकल अध्ययन की अनुमति देगा। यहां प्रस्तुत गुरुत्वाकर्षण छिड़काव विधि का मुख्य लाभ यह है कि प्रोफ्यूजन उपकरण का निर्माण आसानी से उपलब्ध घटकों के साथ किया जा सकता है। प्रक्रिया का प्रदर्शन डॉ शिन जी चेन की प्रयोगशाला के एमडी-पीएचडी छात्र अर्णव राणा करेंगे।
शुरू करने के लिए, एक तेज रेजर ब्लेड का उपयोग करके, टोपी पर पेंच के आंतरिक पक्ष में फ्लश करके दो 500 मिलीलीटर धोने की बोतलों से आंतरिक तिनके को ट्रिम करें। प्रत्येक बफर बोतल के तल में चार-बाय-चार-सेंटीमीटर वर्ग छेद काटें, फिर एक तुला स्टेनलेस स्टील माइक्रो स्पैटुला के पारित होने की अनुमति देने के लिए प्रत्येक बोतल के तल में एक और छोटा छेद काट लें। अगला, माइक्रोस्पुतुला में एक एस-आकार का मोड़ बनाएं ताकि उन्हें बफर बोतलों को लटकाने के लिए हुक के रूप में इस्तेमाल किया जा सके।
बफर बोतलों में उपयुक्त उद्घाटन में तुला माइक्रो स्पैटुला डालें। अगला, बाहरी बोतल पुआल आउटलेट के साथ दो 25 सेंटीमीटर लंबी ट्यूबों को कसकर कनेक्ट करें और वाई कनेक्टर के साथ इन ट्यूबों के सिरों में शामिल हों, फिर वाई कनेक्टर के मुक्त छोर पर 2 मीटर लंबी ट्यूबिंग में शामिल हों। 1 मिलीलीटर सिरिंज से सवार को हटाने के बाद, सिरिंज को टिप से लगभग 6 सेंटीमीटर दूर काट लें, पहले एक रेजर ब्लेड के साथ प्लास्टिक को स्कोर करके और फिर सिरिंज प्लास्टिक को तेजी से स्नैप करें।
सिरिंज के कट चेहरे को पर्याप्त गहराई तक प्लास्टिक ट्यूबिंग के मुक्त छोर में डालें और एक तंग सील सुनिश्चित करें। अगला, एक बफर बोतल को पीएफए के रूप में लेबल करें और दूसरे को पीबीएस के रूप में लेबल करें। बोतल खोलने से दूर लंबाई के लगभग 1/3 को मापें और इत्र समाधानों के उचित भरने के स्तर को निरूपित करने के लिए इस बिंदु पर बोतल परिधि के चारों ओर एक रेखा खींचें।
एक बड़े पेपरक्लिप को सीधा करने के बाद, एक लूप बनाएं जो ट्यूबिंग की परिधि के चारों ओर फिट हो सकता है और इस लूप को ट्यूबिंग के चारों ओर रख सकता है, बस सिरिंज के समीपस्थ, फिर ग्लास ट्रे में एक उचित आकार का स्टायरोफोम ब्लॉक रखें, ट्यूबिंग चिपकाने और पेपर तौलिया का उपयोग करने के लिए स्टायरोफोम ब्लॉक में पेपरक्लिप के सिरों को रखें, ग्लास ट्रे के सामने के छोर को लगभग 2 सेंटीमीटर तक बढ़ाएं। आसुत जल के साथ 1 लीटर बीकर को धोने के बाद, इसे 18 मिलीओहम आणविक-जीव विज्ञान-ग्रेड पानी के लगभग 800 मिलीलीटर से भरें। बीकर को माइक्रोवेव में तीन मिनट के लिए गर्म करें या जब तक पानी का तापमान 65 डिग्री सेल्सियस तक न पहुंच जाए, तब इसे एक हीटिंग या एक धुएं के हुड में रखी सरगर्मी प्लेट पर रखें।
इसके बाद, आसुत जल के साथ एक सरगर्मी रॉड कुल्ला और इसे बीकर में रखें। हलचल शुरू करें और गर्म प्लेट को मध्यम गर्मी तक घुमाएं, यह सुनिश्चित करें कि पानी का तापमान 70 डिग्री सेल्सियस से ऊपर न जाए। सर्जिकल मास्क, दस्ताने और लैब कोट पहनने के बाद, 40 ग्राम पीएफए पाउडर को मापें और इसे गर्म पानी में जोड़ें, फिर एक हस्तांतरण पिपेट का उपयोग करके, समाधान में 5-दाढ़ सोडियम हाइड्रॉक्साइड की कुछ बूंदें जोड़ें।
पाउडर को पूरी तरह से घुलने दें। यदि पाउडर पूरी तरह से भंग नहीं हुआ है, तो आवश्यकतानुसार अधिक सोडियम हाइड्रॉक्साइड जोड़ें। एक बार जब सभी पीएफए लगभग भंग हो जाते हैं, तो सरगर्मी और हीटिंग को रोक दें और तुरंत 10 एक्स पीबीएस के 100 मिलीलीटर जोड़ें, फिर बीकर को 1-लीटर के निशान तक ऊपर उठाने के लिए 18 मिलीओहम आणविक-जीव विज्ञान-ग्रेड पानी का उपयोग करें।
बीकर को प्लास्टिक की चादर से ढक दें और इसे शून्य से 20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में रखें जब तक कि समाधान कमरे के तापमान तक न पहुंच जाए। उचित मानकों का उपयोग करके पीएच मीटर को कैलिब्रेट करने के बाद, समाधान के पीएच को मापें जबकि बीकर एक सरगर्मी प्लेट पर है। पीएच 7.4 तक पहुंचने तक हाइड्रोक्लोरिक एसिड जोड़ें।
यदि पीएच बहुत कम है, तो पीएच बढ़ाने के लिए 5-दाढ़ सोडियम हाइड्रॉक्साइड जोड़ें। अगला, वैक्यूम फ्लास्क को वैक्यूम से कनेक्ट करें और फ्लास्क में फिल्टर पेपर के साथ एक साफ सिरेमिक बुचनर फ़नल रखें। वैक्यूम को चालू करने के बाद, 4% पीएफए समाधान से भरे स्थानांतरण पिपेट का उपयोग करके फिल्टर पेपर को गीला करें, फिर धीरे-धीरे समाधान को फिल्टर पेपर पर डालें जब तक कि सभी समाधान फ़िल्टर न हो जाएं।
फ़िल्टरिंग के बाद, उपयोग होने तक समाधान को 4 डिग्री सेल्सियस पर हल्के संरक्षित कंटेनर में स्टोर करें। धुएं के हुड में, एक ग्लास ट्रे में एक स्टायरोफोम विदारक ब्लॉक रखें। सुनिश्चित करें कि विदारक ब्लॉक में सर्जरी के दौरान माउस को रोकने के लिए पांच से छह छोटी सुइयां हैं और छिड़काव टयूबिंग का समर्थन करने के लिए दो लंबी सुइयां हैं।
अगला, आसुत जल के साथ छिड़काव उपकरण कुल्ला। सभी पानी निकलने के बाद, जानवर से एक मीटर ऊपर की बोतलों को लटकाएं, फिर आणविक-जीव विज्ञान-ग्रेड-पानी के साथ पतला 10x पीबीएस का उपयोग करके गैर-बाँझ 1x पीबीएस तैयार करें। एक हेमोस्टैट का उपयोग करके छिड़काव तंत्र की मुख्य रेखा को क्लैंप करें, फिर पीएफए लाइन को एक और हेमोस्टैट के साथ दबाएं।
पीबीएस के साथ बफर कंटेनर भरने के बाद, अपशिष्ट बफर इकट्ठा करने और मुख्य लाइन को रोकने वाले हेमोस्टैट को हटाने के लिए एक बीकर में छिड़काव तंत्र के सिरिंज छोर को रखें। जबकि पीबीएस लाइन के माध्यम से बहती है, फंसी हुई हवा को हटाने के लिए ट्यूब की दीवारों पर सख्ती से टैप करें। एक बार जब सभी हवा बफर और मुख्य लाइनों से हटा दी जाती है, तो मुख्य लाइन पर एक हेमोस्टैट रखकर प्रवाह को रोक दें।
अगला, पीएफए लाइन से हेमोस्टैट को हटा दें, जिससे पीएफएस पीएफए लाइन में किसी भी बुलबुले को टैप करते समय पीएफए बोतल तक प्रतिगामी तरीके से प्रवाहित हो सके। पीएफए लाइन में पीबीएस को अनुमति देना जारी रखें जब तक कि इसे बोतल के उद्घाटन के ठीक ऊपर नहीं देखा जा सकता है, फिर पीएफए बोतल में पीबीएस के प्रवाह को रोकने के लिए हेमोस्टैट के साथ पीएफए लाइन को रोकें। अगला, तितली जलसेक सुई को छिड़काव सिरिंज से कनेक्ट करें और लाइन के माध्यम से पीबीएस फ्लश करने और छिड़काव सिरिंज से बुलबुले को हटाने के लिए मुख्य लाइन हेमोस्टैट खोलें।
बुलबुले को हटाने के बाद, मुख्य-लाइन हेमोस्टैट को बंद करें। सुनिश्चित करें कि पीबीएस की बोतल अब पीबीएस से लगभग 1/3 भरी हुई है। यदि आवश्यक हो, तो मुख्य लाइन के माध्यम से पीबीएस फ्लश करें या अपनी पूरी क्षमता के 1/3 तक बफर बोतल में अधिक पीबीएस भरें।
एक बार जब सभी बुलबुले पीबीएस, पीएफए और मुख्य लाइनों से हटा दिए जाते हैं, तो बोतल पर काले निशान तक कमरे के तापमान पर 4% पीएफए समाधान के साथ पीएफए बोतल भरें। अगला, पहले पानी के साथ और फिर 70% इथेनॉल के साथ आवश्यक उपकरणों को साफ करके गैर-उत्तरजीविता सर्जरी के लिए तैयार करें। स्टायरोफोम ब्लॉक के लिए एक संवेदनाहारी सी 57 काले 6 जे माउस को सुरक्षित करने के बाद, त्वचा संदंश के साथ पेट की त्वचा को उठाकर और बड़ी कैंची के साथ पेट की दीवार के माध्यम से काटकर सर्जरी शुरू करें।
यकृत की ओर पेट की कटौती को बेहतर ढंग से जारी रखें, फिर यकृत को पूर्वकाल पेट की दीवार से अलग करें और डायाफ्राम की ओर प्रारंभिक चीरा जारी रखें। जब चीरा डायाफ्राम तक पहुंचता है, तो ठीक-विदारक कैंची का उपयोग करके, डायाफ्राम में एक छेद करें और माउस के दाईं ओर पसलियों के माध्यम से लगभग आधे रास्ते में दाईं ओर काट लें, फिर डायाफ्राम के बाईं ओर लगभग सभी तरह से एक समान, लेकिन लंबा चीरा बनाएं बाईं ओर लगभग सभी तरह से बाईं एक्सिला। छाती की दीवार को प्रतिबिंबित करें और इसे स्टायरोफोम ब्लॉक में पिन करें।
बाएं वेंट्रिकल की पहचान करने के बाद, ठीक घुमावदार संदंश का उपयोग करके, दिल को हल्के दबाव के साथ स्थिर रखें, फिर पीबीएस को सुई के माध्यम से प्रवाहित करने की अनुमति देने के लिए मुख्य-लाइन हेमोस्टैट खोलें और तुरंत सुई के साथ बाएं वेंट्रिकल को छेद दें। सुनिश्चित करें कि सुई वेंट्रिकल में 0.5 सेंटीमीटर से अधिक नहीं डाली जाती है। अगला, दो बड़े 18-गेज सुइयों के साथ स्टायरोफोम में बने एक्स पर तितली ट्यूबिंग को आराम दें।
अवर वेना कावा की पहचान करें क्योंकि यह यकृत से बाहर निकलता है और ठीक-विदारक कैंची का उपयोग करके इसे ट्रांसेक्ट करता है। पीबीएस छिड़काव जारी रखें जब तक कि अवर वेना कावा से बाहर बहने वाला तरल रक्त मुक्त न हो जाए, फिर जल्दी से काम करें, पीबीएस लाइन को हेमोस्टैट के साथ रोकें और पीएफए लाइन खोलें। पीएफए को कुछ मिनटों के लिए छिड़कने दें जब तक कि पूंछ कर्ल करना शुरू न कर दे।
एक बार जब पूंछ कर्ल करना शुरू कर देती है, तो 50 मिनट का टाइमर शुरू करें। 50 मिनट के बाद, हेमोस्टैट के साथ मुख्य रेखा को रोकें और सुई को बाएं वेंट्रिकल से वापस लें। अगला, माउस को रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर पीएफए समाधान के लेबल वाले कंटेनर में रखें।
उच्च गुणवत्ता वाले छिड़काव को यकृत, रीढ़ की हड्डी और गहरी केंद्रीय तंत्रिका तंत्र संरचनाओं में रक्त की अनुपस्थिति से संकेत मिलता है। मस्तिष्क में मनाया जाने वाला रक्त खोपड़ी और ड्यूरा मेटर के बीच स्थित है और इसलिए खराब गुणवत्ता वाले छिड़काव के समस्याग्रस्त या विचारोत्तेजक नहीं है। इस छिड़काव विधि के बाद अल्फा-सिन्यूक्लिन का पता लगाने से पता चलता है कि फॉस्फोरिलेटेड अल्फा-सिन्यूक्लिन मानव ए 53 टी अल्फा-सिन्यूक्लिन को व्यक्त करने वाले सात महीने के स्पर्शोन्मुख चूहों के सापेक्ष 15.5 महीने के रोगसूचक चूहों में काफी अधिक जमा होता है।
यह परिणाम रीढ़ की हड्डी के पूर्वकाल सींग और इन चूहों के मिडब्रेन में साइटोपैथोलॉजी के संवर्धन का वर्णन करने वाली रिपोर्टों के अनुरूप है। यह महत्वपूर्ण है कि वक्ष गुहा तक पहुंचने पर पेट के अंगों को नहीं काटा जाता है। इसके अलावा, छिड़काव सुई को बाएं वेंट्रिकल के भीतर बहुत गहराई से नहीं रखा जाना चाहिए।
माउस केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण के लिए एक सुविधाजनक गुरुत्वाकर्षण खिलाया छिड़काव विधि प्रस्तुत की जाती है। पार्किंसंस रोग के माउस मॉडल में फॉस्फोराइलेटेड α-सिन्यूक्लिन का इम्यूनोफ्लोरोसेंट डिटेक्शन प्रदर्शित किया जाता है। यह काम ट्रांसकार्डियल छिड़काव, विच्छेदन, ऊतक ठंड / एम्बेडिंग, और जमे हुए सेक्शनिंग चरणों का भी व्यापक रूप से वर्णन करता है।
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