このプロトコルは、マウスにおける固定液灌流の簡単な方法を提供し、多額の投資なしにCNS組織の組織学的研究を可能にする。ここで提示された重力灌流法の主な利点は、輸液装置が容易に入手可能な部品で構成できることである。この手順を実演するのは、Xin Jie Chen博士の研究室のMD-PhD学生であるArnav Ranaです。
まず、鋭利なカミソリの刃を使用して、2本の500ミリリットルの洗浄ボトルから内側のストローをキャップのネジの内側に切り取ってトリミングします。各バッファーボトルの底に4×4センチメートルの正方形の穴をあけ、次に各ボトルの底に別の小さな穴を開けて、曲がったステンレス製のマイクロヘラを通過させます。次に、マイクロヘラにS字型の曲がりを作成し、バッファボトルを吊るすためのフックとして使用できるようにします。
曲がったマイクロヘラをバッファーボトルの適切な開口部に挿入します。次に、長さ25センチメートルの2本のチューブを外側のボトルストロー出口にしっかりと接続し、これらのチューブの端をYコネクタと結合してから、長さ2メートルのチューブをYコネクタの自由端に接合します。1ミリリットルのシリンジからプランジャーを取り外した後、最初にカミソリの刃でプラスチックを採点し、次にシリンジプラスチックを鋭くスナップして、シリンジを先端から約6センチメートル離して切断する。
シリンジの切断面をプラスチックチューブの自由端に十分な深さまで挿入し、しっかりとしたシールを確保します。次に、1 つのバッファー ボトルを PFA としてラベル付けし、もう 1 つを PBS としてラベル付けします。ボトルの開口部から約1/3の長さを測定し、この時点でボトルの円周の周りに線を引き、灌流液の適切な充填レベルを示します。
大きなペーパークリップをまっすぐにした後、チューブの円周の周りに収まることができるループを作成し、このループをチューブの周りにシリンジのすぐ近くに配置し、適切なサイズの発泡スチロールブロックをガラストレイに置き、ペーパークリップの端を発泡スチロールブロックに入れてチューブを貼り付け、ペーパータオルを使用して、 ガラストレイの前端を約 2 cm 持ち上げます。1リットルのビーカーを蒸留水ですすぎた後、約800ミリリットルの18ミリオームの分子生物学グレードの水で満たします。ビーカーを電子レンジで3分間または水温が摂氏65度に達するまで加熱し、その後、ヒュームフードに保管された加熱または攪拌プレートの上に置きます。
次に、攪拌棒を蒸留水ですすぎ、ビーカーに入れます。スターラーを起動し、ホットプレートを中火に回し、水温が摂氏70度を超えないようにします。サージカルマスク、手袋、および白衣を着用した後、40グラムのPFA粉末を測定し、それを加熱水に加え、次いでトランスファーピペットを使用して、溶液に数滴の5モル水酸化ナトリウムを加える。
粉末を完全に溶解させる。粉末が完全に溶解していない場合は、必要に応じて水酸化ナトリウムをさらに加えます。すべてのPFAがほぼ溶解したら、攪拌と加熱を停止し、すぐに100ミリリットルの10x PBSを加え、18ミリオームの分子生物学グレードの水を使用してビーカーを1リットルのマークまで補充します。
ビーカーをプラスチックラップで覆い、溶液が室温に達するまでマイナス20°Cの冷凍庫に入れます。適切な標準物質を使用してpHメーターを較正した後、ビーカーを攪拌プレート上に置いた状態で溶液のpHを測定する。pHが7.4に達するまで塩酸を加える。
pHが低すぎる場合は、5モルの水酸化ナトリウムを加えてpHを上げます。次に、真空フラスコを真空に接続し、フラスコ内にろ紙を入れたクリーンセラミックブフナー漏斗を置きます。真空をオンにした後、4%PFA溶液を充填したトランスファーピペットを使用してろ紙を濡らし、次いで、すべての溶液が濾過されるまで濾紙上に溶液をゆっくりと注ぐ。
ろ過後、使用時まで溶液を摂氏4度の光で保護された容器に保管してください。ヒュームフードに、発泡スチロール解剖ブロックをガラストレイに入れます。解剖ブロックに、手術中にマウスを拘束するための5〜6本の短い針と、灌流チューブを支えるための2本の長い針があることを確認してください。
次に、灌流装置を蒸留水ですすいでください。すべての水が排水されたら、灌流する動物の1メートル上に豊富なボトルを吊り下げ、分子生物学グレードの水で希釈した10x PBSを使用して非滅菌の1x PBSを調製します。止血装置を使用して灌流装置のメインラインをクランプし、PFAラインを別の止血剤でクランプします。
バッファー容器にPBSを充填した後、灌流装置のシリンジ端部をビーカーに入れ、廃バッファーを回収し、メインラインを閉塞する止血剤を除去する。PBSがラインを通って流れる間、チューブの壁を激しく叩いて閉じ込められた空気を取り除きます。バッファとメインラインからすべての空気が取り除かれたら、メインラインにヘモスタットを配置して流れを遮断します。
次に、PFAラインから止血剤を除去し、PFAライン内の気泡を叩き出しながら、PBSをPFAボトルまで逆行的に流動させる。PBSがボトルの開口部のすぐ上に見えるまでPFAラインにPBSを入れ続け、次にPFAラインを止水で塞いでPFAボトルへのPBSの流れを止めます。次に、バタフライ注入針を灌流シリンジに接続し、メインライン止血剤を開いてPBSをラインを通してフラッシュし、灌流シリンジから気泡を除去する。
気泡が取り除かれたら、メインライン止血剤を閉じます。PBS ボトルが約 1/3 PBS でいっぱいになっていることを確認します。必要に応じて、PBS をメインラインからフラッシュするか、PBS をバッファ ボトルにフル容量の 1/3 まで充填します。
PBS、PFA、およびメインラインからすべての気泡が除去されたら、PFAボトルに4%PFA溶液を室温で充填し、ボトルの黒いマークまで充填します。次に、まず必要な器具を水で洗浄し、次に70%エタノールで洗浄して、生存しない手術の準備をします。麻酔をかけたC57 black 6Jマウスを発泡スチロールブロックに固定した後、皮膚鉗子で腹部皮膚を持ち上げ、大きなはさみで腹壁を切断して手術を開始します。
腹部切開を肝臓に向かって優位に続け、次に肝臓を前腹壁から切り離し、横隔膜に向かって優位に初期切開を続ける。切開部が横隔膜に到達したら、細かく解剖するはさみを使用して、横隔膜に穴を開け、マウスの右側の肋骨を右腋窩のほぼ半分に切り込み、横隔膜の左側を通って左腋窩までほぼ完全に同様の、しかしより長い切開を行う。胸壁を反射し、発泡スチロールブロックに固定します。
左心室を特定した後、細かく湾曲した鉗子を使用して、軽い圧力で心臓を安定させ、PBSが針を通って流れるようにメインライン止血剤を開き、直ちに左心室を針で突き刺す。針が心室に0.5センチメートル以内に挿入されていることを確認してください。次に、2本の大きな18ゲージの針で発泡スチロールで作られたXの上にバタフライチューブを置きます。
肝臓から出る下大静脈を特定し、細かく解剖するハサミを使用してトランセクトします。下大静脈から流出した液体が無血になるまでPBS灌流を続け、その後迅速に働き、PBSラインを止血剤で閉塞し、PFAラインを開く。尾部がカールし始めるまで、PFA が数分間灌流するのを許します。
尾がカールし始めたら、50分のタイマーを開始します。50分後、止血で本線を閉塞し、左心室から針を引き抜く。次に、マウスを4°CのPFA溶液の標識容器に一晩置く。
高品質の灌流は、肝臓、脊髄および深部中枢神経系構造に血液がないことによって示される。脳内で観察される血液は頭蓋骨と硬膜の間に位置しているため、質の悪い灌流の問題や示唆にはなりません。この灌流法に続くα-シヌクレインの検出は、リン酸化α-シヌクレインが、ヒトA53Tα-シヌクレインを発現する7ヶ月齢の無症候性マウスと比較して、15.5ヶ月齢の症候性マウスにおいて有意に高い蓄積を示す。
この結果は、脊髄の前角およびこれらのマウスの中脳における細胞病理学の富化を記載する報告と一致している。胸腔にアクセスするときに腹部器官が切断されないことが重要です。さらに、灌流針は左心室内に深く置きすぎてはならない。
