En gravitationsmatad transkardiell perfusionsmetod för histologisk analys av musens centrala nervsystem

Detta protokoll ger en enkel metod för fixativ perfusion hos möss som möjliggör histologisk studie av CNS-vävnader utan betydande investeringar. Den största fördelen med gravitationsperfusionsmetoden som presenteras här är att överflödsapparaten kan konstrueras med lättillgängliga komponenter. Demonstrerar proceduren kommer att vara Arnav Rana, en MD-doktorand från Dr.Xin Jie Chens laboratorium.

Börja med att använda ett vasst rakblad och trimma de inre sugrören från två 500-milliliter tvättflaskor genom att skära dem jämnt till insidan av skruven på locket. Skär ett fyrkantigt hål fyra gånger fyra centimeter i botten av varje buffertflaska och skär sedan ytterligare ett litet hål i botten av varje flaska för att tillåta passage av en böjd mikrospatel i rostfritt stål. Skapa sedan en S-formad böjning i mikrospatlarna så att de kan användas som krokar för att hänga buffertflaskorna.

För in de böjda mikrospatlarna i lämpliga öppningar i buffertflaskorna. Anslut sedan två 25 centimeter långa rör med de yttre flaskstråuttagen och anslut ändarna på dessa rör tillsammans med Y-kontakten och anslut sedan den 2 meter långa slangen till den fria änden av Y-kontakten. När du har tagit bort kolven från en 1 milliliter spruta, skär sprutan cirka 6 centimeter från spetsen genom att först göra plasten med ett rakblad och sedan knäppa sprutaplasten kraftigt.

Sätt in sprutans skurna yta i den fria änden av plaströret till ett tillräckligt djup och se till att det tätar tätt. Märk sedan en buffertflaska som PFA och den andra som PBS. Mät ungefär 1/3 av längden bort från flasköppningen och dra en linje runt flaskans omkrets vid denna punkt för att ange lämplig fyllningsnivå för perfusatlösningarna.

Efter att ha rätat ut ett stort gem, skapa en slinga som kan passa runt slangens omkrets och placera denna ögla runt slangen, bara proximal mot sprutan, placera sedan ett lämpligt storlek frigolitblock i glasbrickan, placera ändarna på gemen i styrofoamblocket för att fästa slangen och använd en pappershandduk, höj glasbrickans främre ände med cirka 2 centimeter. Efter sköljning av en 1-liters bägare med destillerat vatten, fyll den med cirka 800 ml 18 milliohms vatten av molekylärbiologisk kvalitet. Värm bägaren i en mikrovågsugn i tre minuter eller tills vattentemperaturen når 65 grader Celsius och placera den sedan på en värme- eller omrörningsplatta som förvaras i en dragskåp.

Skölj sedan en omrörningsstav med destillerat vatten och lägg den i bägaren. Starta omröraren och vrid upp värmeplattan till medelvärme, så att vattentemperaturen inte går över 70 grader Celsius. Efter att ha använt en kirurgisk mask, handskar och labbrock, mät 40 gram PFA-pulver och tillsätt det i det uppvärmda vattnet, tillsätt sedan några droppar 5-molär natriumhydroxid till lösningen med en överföringspipett.

Låt pulvret lösas upp helt. Om pulvret inte har lösts helt, tillsätt mer natriumhydroxid efter behov. När all PFA nästan har lösts upp, stoppa omrörningen och uppvärmningen och tillsätt omedelbart 100 ml 10x PBS, använd sedan 18 milliohms molekylärbiologiskt vatten för att fylla på bägaren till 1-litersmärket.

Täck bägaren med plastfolie och lägg den i en frys på minus 20 grader Celsius tills lösningen når rumstemperatur. Efter kalibrering av en pH-mätare med lämpliga standarder, mät lösningens pH medan bägaren ligger på en omrörningsplatta. Tillsätt saltsyra tills pH når 7,4.

Om pH är för lågt, tillsätt 5-molär natriumhydroxid för att öka pH. Anslut sedan en vakuumkolv till vakuum och placera en ren keramisk Buchner-tratt med filterpapper i kolven. När du har slagit på vakuumet, våt filterpapperet med en överföringspipett fylld med 4% PFA-lösningen och häll sedan långsamt lösningen på filterpapperet tills all lösning har filtrerats.

Efter filtrering, förvara lösningen i en ljusskyddad behållare vid 4 grader Celsius tills den används. Placera ett frigolitdissekeringsblock i dragskåpet i en glasbricka. Se till att dissekeringsblocket har fem till sex korta nålar för att hålla fast musen under operationen och två långa nålar för att stödja perfusionsslangen.

Skölj sedan perfusionsapparaten med destillerat vatten. När allt vatten har tömts, häng överflödsflaskorna en meter över djuret som ska perfuseras och förbered sedan icke-steril 1x PBS med 10x PBS utspädd med molekylärbiologiskt vatten. Kläm fast perfusionsapparatens huvudlinje med användning av en hemostat och kläm sedan fast PFA-linjen med en annan hemostat.

Efter att ha fyllt buffertbehållaren med PBS, placera sprutänden på perfusionsapparaten i en bägare för att samla upp avfallsbuffert och ta bort hemostaten som täcker huvudledningen. Medan PBS flyter genom linjen, knacka kraftigt på rörets väggar för att ta bort instängd luft. När all luft har avlägsnats från bufferten och huvudledningarna, ockludera flödet genom att placera en hemostat på huvudledningen.

Ta sedan bort hemostaten från PFA-linjen, så att PBS kan flöda på ett retrograd sätt upp till PFA-flaskan medan du knackar ut eventuella bubblor i PFA-linjen. Fortsätt att tillåta PBS i PFA-linjen tills den kan ses strax ovanför flaskans öppning och ockludera sedan PFA-linjen med en hemostat för att stoppa flödet av PBS i PFA-flaskan. Anslut sedan fjärilsinfusionsnålen till perfusionssprutan och öppna huvudlinjens hemostat för att spola PBS genom linjen och ta bort bubblor från perfusionssprutan.

När bubblorna har tagits bort stänger du huvudlinjens hemostat. Se till att PBS-flaskan nu är ungefär 1/3 full av PBS. Spola vid behov PBS genom huvudledningen eller fyll mer PBS i buffertflaskan tills 1/3 av dess fulla kapacitet.

När alla bubblor har tagits bort från PBS-, PFA- och huvudledningarna fyller du PFA-flaskan med 4% PFA-lösning vid rumstemperatur upp till det svarta märket på flaskan. Förbered dig sedan på icke-överlevnadskirurgi genom att rengöra de nödvändiga instrumenten först med vatten och sedan med 70% etanol. Efter att ha säkrat en sövd C57 svart 6J-mus till frigolitblocket, börja operationen genom att lyfta bukhuden med hudtång och skära genom bukväggen med en stor sax.

Fortsätt bukskärningen överlägset mot levern, lossa sedan levern från den främre bukväggen och fortsätt det första snittet överlägset mot membranet. När snittet når membranet, med hjälp av findissekerande sax, gör ett hål i membranet och skär genom revbenen på musens högra sida ungefär halvvägs till höger axilla, gör sedan ett liknande, men längre snitt genom membranets vänstra sida nästan hela vägen till vänster axilla. Reflektera bröstväggen och fäst den på frigolitblocket.

Efter att ha identifierat vänster ventrikel, med hjälp av finböjda pincett, håll hjärtat stadigt med lätt tryck och öppna sedan huvudlinjens hemostat så att PBS kan strömma genom nålen och omedelbart genomborra vänster ventrikel med nålen. Se till att nålen sätts in högst 0,5 centimeter i ventrikeln. Vila sedan fjärilsslangen på ett X tillverkat i frigolit med två stora 18-gauge nålar.

Identifiera den underlägsna vena cava när den lämnar levern och transektera den med hjälp av findissekerande sax. Fortsätt PBS-perfusion tills vätskan som strömmar ut ur den underlägsna vena cava är blodfri, arbeta sedan snabbt, ockludera PBS-linjen med en hemostat och öppna PFA-linjen. Låt PFA perfuse i några minuter tills svansen börjar krulla.

När svansen börjar krulla, börja en 50-minuters timer. Efter 50 minuter, ockludera huvudlinjen med en hemostat och dra ut nålen från vänster ventrikel. Placera sedan musen i en märkt behållare med PFA-lösning vid 4 grader Celsius över natten.

Högkvalitativ perfusion indikeras av frånvaron av blod i levern, ryggmärgen och djupa centrala nervsystemet strukturer. Blodet som observeras i hjärnan ligger mellan skallen och dura mater och är därför inte problematiskt eller tyder på perfusion av dålig kvalitet. Detektion av alfa-synuklein efter denna perfusionsmetod visar att fosforylerat alfa-synuklein ackumuleras signifikant högre hos 15,5 månader gamla symptomatiska möss i förhållande till sju månader gamla asymptomatiska möss som uttrycker humant A53T alfa-synuklein.

Detta resultat överensstämmer med rapporter som beskriver en anrikning av cytopatologi i ryggmärgs främre horn och mellanhjärnan hos dessa möss. Det är viktigt att inga bukorgan skärs när man kommer åt brösthålan. Dessutom får perfusionsnålen inte placeras för djupt i vänster kammare.