Human lever mikrofysiologisk system til vurdering af lægemiddelinduceret levertoksicitet in vitro

Protokollen beskriver, hvordan man vurderer lægemiddelinduceret leverskade in vitro ved hjælp af et mikrofysiologisk system, der kan opretholde meget funktionelt og metabolisk aktivt levermikrovæv i op til fire uger. Denne tilgang er en humanspecifik cellekulturmodel til nøjagtigt at detektere lægemiddelinduceret leverskadeansvar for nye forbindelser, hvilket er mere forudsigeligt end enklere 2D-kulturer eller endnu mere komplekse 3D-kulturer. Denne teknik kan bruges som en del af et batteri af prækliniske sikkerhedstest for at afgøre, om en forbindelse er sikker at starte klinisk udvikling.

En lang række modaliteter kan testes. Begynd at oprette levermikrofysiologisk system ved at forbinde controlleren til dockingstationens hus i en cellekulturinkubator. Sørg for, at der tilsættes frisk tørremiddel i tørremiddelbeholderen bag på controlleren.

Når du har tændt controlleren ved at trykke på bådens vippekontakt, skal du vente i fem minutter på, at systemet stabiliserer sig og når trykket. Fjern hver plade fra emballagen. Derefter primes hver brønd ved at tilføje 500 mikroliter forvarmet såning avanceret DMEM-medium til reservoirsiden.

Placer føreren på dockingstationen i inkubatoren. Når du er færdig, skal du vælge det primære program på controllerskærmen, indtil væsken kommer gennem filterstøtterne. For at dække overfladekanalen skal du fylde alle brøndene med 1,1 ml såning avanceret DMEM-medium.

Når chaufførerne er placeret med plader i en inkubator ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid, skal du tilslutte dockingstationen og køre inkubationsprogrammet. Optø hætteglas med PHH'er og HJC'er ved at holde hætteglassene i et 37 grader Celsius vandbad, indtil der kun er en lille isskive tilbage. Når det er optøet, pipetteres forsigtigt maksimalt to hætteglas PHH'er direkte i et rør med forvarmet kryopræserveret hepatocytgendannelsesmedium, CHRM-medier.

Brug derefter en milliliter CHRM til at vaske de resterende celler fra kryotubet. Pipetter HKC'erne forsigtigt fra kryotuben til 10 ml iskold såning avanceret DMEM-medium i et 50 milliliter centrifugerør. Senere centrifugeres begge celletyper separat ved stuetemperatur ved 100 gange G i 10 minutter.

Efter centrifugering fjernes supernatanten og genophænges PHH'erne i varmt såning avanceret DMEM-medium og HKC'er i iskold såning avanceret DMEM-medium ved hjælp af en milliliter pr. hætteglas med cellerne, der tilsættes røret. Suspender cellerne igen med en blid vuggende handling, og læg dem derefter på is. Når de er suspenderet, skal du tælle cellerne og registrere levedygtigheden.

Cellelevedygtigheden skal være over 85 %Afbryd derefter føreren fra dockingstationen, og placer føreren i det mikrobiologiske sikkerhedsskab eller MBSC. Derefter aspireres medierne ovenfra stilladset til stoppunktet, kanalen og reservoiret, hvilket efterlader et dødt volumen på 0,2 ml i kulturbrønden og når lige over stilladset. Tilsæt 400 mikroliter såning af avanceret DMEM-medium i brøndkammeret, før du returnerer føreren til dockingstationen i inkubatoren, og kør medieskiftprogrammet i tre minutter.

Efter tre minutter skal du frakoble føreren fra dockingstationen og placere føreren tilbage i MBSC. Aspirer medierne fra ovenstående stillads ned til stoppunktet og ved reservoirenden af hver brønd, efterfulgt af genophængning af PHH'erne ved forsigtigt at vippe røret og tilføje det krævede volumen af cellesuspensionen til hver kulturbrønd. Pipetter forsigtigt cellesuspensionen, så cellerne spredes jævnt over pladestilladset.

Suspender forsigtigt HKC'er igen, og tilsæt cellesuspensionerne til hver kulturbrønd. Når alle brøndene indeholder begge celletyper, skal du placere det mikrofysiologiske system eller MPS-driveren på dockingstationen i inkubatoren uden fysisk at forbinde for at stå i en time. Når en time er gået, skal du slutte føreren til dockingstationen og køre frøprogrammet.

Når programmet automatisk holder pause på to minutter, skal du fjerne driveren fra inkubatoren og langsomt tilføje 1.000 mikroliter af det såede avancerede DMEM-medium til kanalen for at opnå et samlet volumen på 1,4 ml. Senere skal du flytte pladerne til inkubatoren og køre resten af frøprogrammet i otte timer. På dag fire skal du sætte programmet på controlleren på pause og frakoble føreren og pladen fra dockingstationen.

Overfør dem til en MBSC. Brug en pipette til manuelt at indsamle ca. en milliliter medier fra hver brønd til opløselig biomarkøranalyse uden at forstyrre cellekulturen ved at røre ved stilladset. Mærk de indsamlede medier som dag fire prøver, og kør laktatdehydrogenase og urinstofassays som kvalitetskontrol for at sikre, at såning har været vellykket.

Doser derefter hver brønd i henhold til pladeplanen ved at udføre medieændringen. Når du er færdig, skal du returnere føreren til dockingstationen i inkubatoren og køre inkubationsprogrammet. På dag seks skal du frakoble føreren og pladen fra dockingstationen og overføre til en MBSC.

Brug en pipette til at indsamle ca. en milliliter medier fra hver brønd, og mærk som 48 timer efter dosisprøver, og opbevar prøverne ved minus 80 grader Celsius til senere assays. På dag otte skal du fjerne stilladserne fra pladerne ved hjælp af en pincet og placere stilladserne i en 24 brøndplade indeholdende 500 mikroliter DPBS uden calcium og magnesium i hver brønd uden at forstyrre mikrovævet. Tag snapshots af hvert stillads under et omvendt lysmikroskop ved 10 gange forstørrelse.

På dag fire, før lægemiddeldoseringen, blev der udført en kvalitetskontrol af dannede levermikrovæv med LDH-frigivelse og urinstofsyntese. På dag otte blev flere sundheds- og levermålinger såsom albumin, urinstof, CYP tre A fire, ATP vurderet for at bekræfte høje niveauer af leverfunktionalitet og reproducerbarhed i mikrovævene. Kontrastfasemikroskopi og IF-farvning i levermikrotissuet afslørede den jævne fordeling af HKC'er i PHH-mikrovævene.

Den akutte eksponering af levermikrotvævene for troglitazon forårsagede toksicitet, som blev påvist ved alaninaminotransferase eller ALAT, og LDH-frigivelse og en hurtig reduktion i albumin- og urinstofproduktionen. ATP-indholdet og CYP tre A fire aktivitet bekræftede toksiciteten forårsaget af troglitazon, og EC50-værdierne var meget sammenlignelige med andre endepunkter. De lysfeltmikroskopibilleder, der er taget efter otte dages kultur i MPS, afslører et sundt levermikrotissue, ensartet sået i hele stilladset i køretøjets kontrol.

Vævsdød eller nedbrydning blev set i replikaterne behandlet med positiv kontrol og troglitazon. Desuden blev levertoksicitet efter eksponering for pioglitazon også undersøgt. Ingen LDH- eller ALT-frigivelse blev detekteret, men en mild reduktion i albumin- og urinstofproduktion blev observeret efter 48 timer.

En mindre reduktion i ATP-indholdet blev observeret ved høje pioglitazonkoncentrationer. EC50-værdier blev genereret ud fra dosisresponskurverne. Mikroskopi afslørede let mikrovævsændring efter 96 timers eksponering for pioglitazon ved de to højeste testede koncentrationer.

I undersøgelsen er brugen af celler med god kvalitet og levedygtighed over 85% afgørende for at generere yderst funktionelle og sunde 3D-mikrovæv i det mikrofysiologiske system. Efter denne procedure kan vi vurdere adenin- og lægemiddelinteraktioner og lægemiddelinduceret leverskade på sygdomsmodeller såsom ikke-alkoholisk Delta hepatitis eller ikke-alkoholisk fedtleversygdomsmodel, der bruger tredobbelt kultur af leverparenkymale og ikke-parenkymale celler.