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January 31st, 2022
DOI :
January 31st, 2022
•0:05
Introduction
0:53
Microphysiological System (MPS) Set-Up and Priming (Day -1)
2:14
Seeding Liver Cells into MPS on Day 0
6:00
Media Collection, Media Change and Drug Dosing (Days 4 and 6), and Ending the Experiment (Day 8)
7:52
Results: Assessment of Liver Microtissues After the Treatment with Various Drugs
10:22
Conclusion
Transcript
Le protocole décrit comment évaluer les lésions hépatiques induites par les médicaments in vitro à l’aide d’un système microphysiologique capable de maintenir des microtissus hépatiques hautement fonctionnels et métaboliquement actifs jusqu’à quatre semaines. Cette approche est un modèle de culture cellulaire spécifique à l’homme pour détecter avec précision le risque de lésions hépatiques induites par les médicaments pour les nouveaux composés, ce qui est plus prédictif que les cultures 2D plus simples ou même les cultures 3D plus complexes. Cette technique peut être utilisée dans le cadre d’une batterie de tests de sécurité précliniques pour déterminer si un composé est sûr pour commencer le développement clinique.
Une grande variété de modalités peuvent être testées. Commencez à configurer le système microphysiologique du foie en connectant le contrôleur à la maison de la station d’accueil dans un incubateur de culture cellulaire. Assurez-vous que du déshydratant frais est ajouté dans le pot déshydratant situé à l’arrière du contrôleur.
Après avoir allumé le contrôleur en appuyant sur l’interrupteur du culbuteur du bateau, attendez cinq minutes que le système se stabilise et atteigne la pression. Retirez chaque assiette de l’emballage. Ensuite, amorcez chaque puits en ajoutant 500 microlitres de milieu DMEM avancé d’ensemencement préchauffé du côté du réservoir.
Placez le pilote sur la station d’accueil dans l’incubateur. Lorsque vous avez terminé, sélectionnez le programme principal sur l’écran du contrôleur jusqu’à ce que le fluide traverse les supports de filtre. Pour couvrir le canal de surface, remplissez tous les puits avec 1,1 millilitre de milieu DMEM avancé d’ensemencement.
Après avoir placé les pilotes avec des plaques dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone, connectez la station d’accueil et exécutez le programme d’incubation. Décongeler les flacons de PHH et de HJC en les maintenant dans un bain-marie de 37 degrés Celsius jusqu’à ce qu’il ne reste qu’un petit morceau de glace. Une fois décongelé, pipeter doucement un maximum de deux flacons de PHH directement dans un tube de milieu de récupération des hépatocytes cryoconservé préchauffé, milieu CHRM.
Utilisez ensuite un millilitre de CHRM pour laver les cellules restantes du cryotube. Pipeter doucement les HKC du cryotube dans 10 millilitres de milieu DMEM avancé à ensemencement glacé dans un tube centrifuge de 50 millilitres. Plus tard, centrifugez les deux types de cellules séparément à température ambiante à 100 fois G pendant 10 minutes.
Après centrifugation, retirer le surnageant et remettre en suspension les PHH dans un milieu DMEM avancé à semis chaud et des HKC dans un milieu DMEM avancé à ensemencement à froid glacé en utilisant un millilitre par flacon des cellules ajoutées au tube. Re-suspendre les cellules avec une action de balancement douce, puis placer sur la glace. Lorsqu’elles sont suspendues, comptez les cellules et notez la viabilité.
La viabilité de la cellule doit être supérieure à 85%Ensuite, déconnectez le pilote de la station d’accueil et placez le pilote dans l’enceinte de sécurité microbiologique ou MBSC. Ensuite, aspirez le média au-dessus de l’échafaudage jusqu’au point d’arrêt, au canal et au réservoir, laissant un volume mort de 0,2 millilitre dans le puits de culture, atteignant juste au-dessus de l’échafaudage. Ajoutez 400 microlitres de milieu DMEM avancé d’ensemencement dans la chambre du puits avant de remettre le pilote sur la station d’accueil de l’incubateur et d’exécuter le programme de changement de média pendant trois minutes.
Après trois minutes, déconnectez le pilote de la station d’accueil et replacez-le dans le MBSC. Aspirer le média de l’échafaudage ci-dessus jusqu’au point d’arrêt et à l’extrémité du réservoir de chaque puits, puis remettre les PHH en remettant en suspension le tube en secouant doucement le tube et en ajoutant le volume requis de suspension cellulaire à chaque puits de culture. Pipeter soigneusement la suspension cellulaire, en assurant une dispersion uniforme des cellules à travers l’échafaudage de plaque.
Re-suspendre délicatement les HKC et ajouter les suspensions cellulaires à chaque puits de culture. Une fois que tous les puits contiennent les deux types de cellules, placez le système microphysiologique ou le pilote MPS sur la station d’accueil dans l’incubateur sans connexion physique pour rester debout pendant une heure. Une fois une heure écoulée, connectez le pilote à la station d’accueil et exécutez le programme de démarrage.
Lorsque le programme s’arrête automatiquement à deux minutes, retirez le pilote de l’incubateur et ajoutez lentement 1 000 microlitres du milieu DMEM avancé d’ensemencement au canal pour atteindre un volume total de 1,4 millilitres. Plus tard, déplacez les plaques vers l’incubateur et exécutez le reste du programme de semences pendant huit heures. Le quatrième jour, mettez le programme en pause sur le contrôleur et déconnectez le conducteur et la plaque de la station d’accueil.
Transférez-les dans un CSMB. Utilisez une pipette pour prélever manuellement environ un millilitre de média dans chaque puits pour l’analyse des biomarqueurs solubles sans perturber la culture cellulaire en touchant l’échafaudage. Étiqueter les milieux collectés comme échantillons du quatrième jour et effectuer des tests de lactate déshydrogénase et d’urée comme contrôle de la qualité pour s’assurer que l’ensemencement a été réussi.
Ensuite, dosez chaque puits selon le plan de plaque en effectuant le changement de milieu. Une fois terminé, remettez le pilote sur la station d’accueil dans l’incubateur et exécutez le programme d’incubation. Le sixième jour, débranchez le conducteur et la plaque de la station d’accueil et transférez-les dans un CSMB.
Utilisez une pipette pour prélever environ un millilitre de fluide dans chaque puits, étiquetez les échantillons 48 heures après la dose et stockez les échantillons à moins 80 degrés Celsius pour des dosages ultérieurs. Le huitième jour, retirez les échafaudages des plaques à l’aide d’une pince à épiler et placez les échafaudages dans une plaque de 24 puits contenant 500 microlitres de DPBS sans calcium ni magnésium dans chaque puits sans perturber le microtissu. Prenez les instantanés de chaque échafaudage sous un microscope à lumière inversée à un grossissement 10 fois.
Le quatrième jour, avant l’administration du médicament, un contrôle de la qualité des microtissus hépatiques formés a été effectué avec libération de LDH et synthèse d’urée. Au huitième jour, plusieurs paramètres de santé et hépatiques tels que l’albumine, l’urée, le CYP trois A quatre, l’ATP ont été évalués pour confirmer des niveaux élevés de fonctionnalité hépatique et de reproductibilité dans les microtissus. La microscopie en phase de contraste et la coloration IF dans les microtissus hépatiques ont révélé la distribution uniforme des HKC dans les microtissus PHH.
L’exposition aiguë des microtissus hépatiques à la troglitazone a provoqué une toxicité, qui a été détectée par l’alanine aminotransférase ou ALT, et la libération de LDH et une réduction rapide de la production d’albumine et d’urée. La teneur en ATP et l’activité du CYP trois A quatre ont confirmé la toxicité causée par la troglitazone, et les valeurs de CE50 étaient très comparables à celles d’autres paramètres. Les images de microscopie en fond clair prises après huit jours de culture dans le MPS révèlent un microtissu hépatique sain, uniformément ensemencé dans tout l’échafaudage de la commande du véhicule.
La mort ou la dégradation des tissus a été observée dans les répétitions traitées avec un contrôle positif et la troglitazone. De plus, la toxicité hépatique à la suite d’une exposition à la pioglitazone a également été étudiée. Aucune libération de LDH ou d’ALT n’a été détectée, mais une légère réduction de la production d’albumine et d’urée a été observée après 48 heures.
Une légère réduction de la teneur en ATP a été observée à des concentrations élevées de pioglitazone. Les valeurs de CE50 ont été générées à partir des courbes dose-réponse. La microscopie a révélé une légère altération microtissulaire après 96 heures d’exposition à la pioglitazone aux deux concentrations testées les plus élevées.
Dans l’étude, l’utilisation de cellules ayant une bonne qualité et une viabilité supérieure à 85% est essentielle pour générer des microtissus 3D hautement fonctionnels et sains dans le système microphysiologique. Après cette procédure, nous pouvons évaluer les interactions adénine et médicamenteuse et les lésions hépatiques induites par les médicaments sur des modèles de maladie tels que l’hépatite Delta non alcoolique ou le modèle de stéatose hépatique non alcoolique qui utilise une triple culture de cellules parenchymateuses et non parenchymateuses hépatiques.
Les lésions hépatiques d’origine médicamenteuse (DILI) sont une cause majeure d’échec médicamenteux. Un protocole a été développé pour prédire avec précision la responsabilité DILI d’un composé à l’aide d’un système microphysiologique du foie (MPS). Le modèle hépatique utilise la coculture de cellules hépatiques primaires et des paramètres translationnellement pertinents pour évaluer les réponses cellulaires au traitement.
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