Name: rapid golgi stain for dendritic spine visualization in hippocampus and prefrontal cortex
Uploaded: 2021-12-03T14:00:00
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Ce travail a été soutenu par Sacred Heart University Undergraduate Research InitiativeGrants.

Toutes les procédures expérimentales sont approuvées par le Sacred Heart University Institutional Animal Care and Use Committee et sont conformes au NIH Guide for the Care and Use of Animals.
1. Isolement et infiltration du tissu cérébral
<ol><li>Prémélanger les solutions A et B du kit de coloration Golgi 24 h avant utilisation et conserver dans des bouteilles sombres et/ou dans l’obscurité. Faire environ 80 mL de solution A et B mélange qui est suffisant pour cha...

<ol>
	<li>Pannese, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Golgi+Stain:+invention,+diffusion+and+impact+on+neurosciences.">The Golgi Stain: invention, diffusion and impact on neurosciences.</a> Journal of the History of the Neurosciences. 8 (2), 132-140 (1999).</li><li>Bentivoglio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Original+Histological+Slides+of+Camillo+Golgi+and+His+Discoveries+on+Neuronal+Structure.">The Original Histological Slides of Camillo Golgi and His Discoveries on Neuronal Structure.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 13, 3 (2019).</li><li>Swanson, L. W., Newman, E., Araque, A., Dubinsky, J. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gonadal+steroids+regulate+dendritic+spine+density+in+hippocampal+pyramidal+cells+in+adulthood.">Gonadal steroids regulate dendritic spine density in hippocampal pyramidal cells in adulthood.</a> Journal of Neuroscience. 10 (4), 1286-1291 (1990).</li><li>Woolley, C. S., Gould, E., Frankfurt, M., McEwen, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naturally+occurring+fluctuation+in+dendritic+spine+density+on+adult+hippocampal+pyramidal+neurons.">Naturally occurring fluctuation in dendritic spine density on adult hippocampal pyramidal neurons.</a> Journal of Neuroscience. 10 (12), 4035-4039 (1990).</li><li>Frankfurt, M., Salas-Ramirez, K., Friedman, E., Luine, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cocaine+alters+dendritic+spine+density+in+cortical+and+subcortical+brain+regions+of+the+postpartum+and+virgin+female+rat.">Cocaine alters dendritic spine density in cortical and subcortical brain regions of the postpartum and virgin female rat.</a> Synapse. 65 (9), 955-961 (2011).</li><li>Frankfurt, M., Luine, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolving+role+of+dendritic+spines+and+memory:+Interaction(s)+with+estradiol.">The evolving role of dendritic spines and memory: Interaction(s) with estradiol.</a> Hormones Behavior. 74, 28-36 (2015).</li><li>Bowman, R. E., Luine, V., Khandaker, H., Villafane, J. J., Frankfurt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adolescent+bisphenol-A+exposure+decreases+dendritic+spine+density:+role+of+sex+and+age.">Adolescent bisphenol-A exposure decreases dendritic spine density: role of sex and age.</a> Synapse. 68 (11), 498-507 (2014).</li><li>Bowman, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bisphenol-A+exposure+during+adolescence+leads+to+enduring+alterations+in+cognition+and+dendritic+spine+density+in+adult+male+and+female+rats.">Bisphenol-A exposure during adolescence leads to enduring alterations in cognition and dendritic spine density in adult male and female rats.</a> Hormones Behavior. 69, 89-97 (2015).</li><li>Eilam-Stock, T., Serrano, P., Frankfurt, M., Luine, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bisphenol-A+impairs+memory+and+reduces+dendritic+spine+density+in+adult+male+rats.">Bisphenol-A impairs memory and reduces dendritic spine density in adult male rats.</a> Behavioral Neuroscience. 126 (1), 175-185 (2012).</li><li>Inagaki, T., Frankfurt, M., Luine, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen-induced+memory+enhancements+are+blocked+by+acute+bisphenol+A+in+adult+female+rats:+role+of+dendritic+spines.">Estrogen-induced memory enhancements are blocked by acute bisphenol A in adult female rats: role of dendritic spines.</a> Endocrinology. 153 (7), 3357-3367 (2012).</li><li>Jacome, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gonadal+Hormones+Rapidly+Enhance+Spatial+Memory+and+Increase+Hippocampal+Spine+Density+in+Male+Rats.">Gonadal Hormones Rapidly Enhance Spatial Memory and Increase Hippocampal Spine Density in Male Rats.</a> Endocrinology. 157 (4), 1357-1362 (2016).</li><li>Frankfurt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bisphenol-A:+a+plastic+manufacturing+compound+disrupts+critical+brain+structures+and+impairs+memory.">Bisphenol-A: a plastic manufacturing compound disrupts critical brain structures and impairs memory.</a> Research Features. , (2021).</li><li>Wallace, M., Luine, V., Arellanos, A., Frankfurt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovariectomized+rats+show+decreased+recognition+memory+and+spine+density+in+the+hippocampus+and+prefrontal+cortex.">Ovariectomized rats show decreased recognition memory and spine density in the hippocampus and prefrontal cortex.</a> Brain Research. 1126 (1), 176-182 (2006).</li><li>Wallace, M., Frankfurt, M., Arellanos, A., Inagaki, T., Luine, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+recognition+memory+and+decreased+prefrontal+cortex+spine+density+in+aged+female+rats.">Impaired recognition memory and decreased prefrontal cortex spine density in aged female rats.</a> Annals of the New York Academy of Science. 1097, 54-57 (2007).</li><li>Bowman, R. E., Hagedorn, J., Madden, E., Frankfurt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+adolescent+Bisphenol-A+exposure+on+memory+and+spine+density+in+ovariectomized+female+rats:+Adolescence+vs+adulthood.">Effects of adolescent Bisphenol-A exposure on memory and spine density in ovariectomized female rats: Adolescence vs adulthood.</a> Hormones Behavior. 107, 26-34 (2019).</li><li>Novaes, L. S., Dos Santos, N. B., Perfetto, J. G., Goosens, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+enrichment+prevents+acute+restraint+stress-induced+anxiety-related+behavior+but+not+changes+in+basolateral+amygdala+spine+density.">Environmental enrichment prevents acute restraint stress-induced anxiety-related behavior but not changes in basolateral amygdala spine density.</a> Psychoneuroendocrinology. 98, 6-10 (2018).</li><li>Trzesniewski, J., Altmann, S., J&#228;ger, L., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+Purkinje+cell+size+is+compatible+with+near+normal+morphology+and+function+of+the+cerebellar+cortex+in+a+mouse+model+of+spinocerebellar+ataxia.">Reduced Purkinje cell size is compatible with near normal morphology and function of the cerebellar cortex in a mouse model of spinocerebellar ataxia.</a> Experimental Neurology. 311, 205-212 (2019).</li><li>Zemmar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrocyte-+and+Neuron-Specific+Nogo-A+Restrict+Dendritic+Branching+and+Spine+Density+in+the+Adult+Mouse+Motor+Cortex.">Oligodendrocyte- and Neuron-Specific Nogo-A Restrict Dendritic Branching and Spine Density in the Adult Mouse Motor Cortex.</a> Cerebral Cortex. 28 (6), 2109-2117 (2018).</li></ol>

Le présent protocole décrit une méthode d’imprégnation de Golgi qui permet un traitement simultané rapide de nombreuses sections. Il s’agit d’une amélioration par rapport aux5 méthodes plus intensives en main-d’œuvre décrites précédemment et donne systématiquement des neurones imprégnés pour l’analyse. En outre, il y a moins d’exposition aux produits chimiques toxiques utilisés dans l’imprégnation de Golgi. La partie la plus difficile du processus consiste à faire en...

La méthode d’utilisation du dichromate de potassium et du nitrate d’argent pour marquer les neurones a été décrite pour la première fois par Camillo Golgi 1,2 et ensuite utilisée par Santiago Ramon y Cajal pour produire un immense corpus de travaux différenciant les sous-types neuronaux et gliaux. Un livre récemment publié avec ses illustrations est maintenant disponible3. Suite aux études de Ramon y Cajal, qui ont été publiées il y a plus de 100 ans, très peu d’imprégnation Golgi a été utilisée. L’imprégnation de Golgi est un processus laborieux qui permet la visualisation tridimensionnelle des neurones avec un microscope optique. Il y a eu de nombreuses modifications de la méthode Golgi au fil des ans pour rendre la méthode plus facile et la coloration plus cohérente4. En 1984, Gabbott et Somogyi5 ont décrit la procédure d’imprégnation golgi à section unique qui a permis un traitement plus rapide. Cette méthode d’imprégnation de Golgi nécessite une perfusion avec 4% de paraformaldéhyde et 1,5% d’acide picrique, post-fixation suivie d’une coupe vibratome dans un bain de dichromate de potassium à 3%. Les sections sont montées sur des lames de verre, les quatre coins des couvercles collés de sorte que lorsqu’ils sont immergés dans du nitrate d’argent, la diffusion est progressive. Les couvercles sont ensuite enlevés, les sections sont déshydratées et finissent par glisser définitivement avec un support de montage. Cette technique a été utilisée avec succès pour marquer les neurones et la glie 6,7,8 dans l’hippocampe. La méthode rapide de Golgi décrite ici est une amélioration car il y a beaucoup moins d’exposition au dichromate de potassium et au nitrate d’argent et aucun paraformaldéhyde et acide picrique ne sont utilisés. De plus, bien que les cellules imprégnées à l’aide de modifications de la méthode Gabbott et Somogyi5 puissent être analysées, les sections étaient souvent surexposées ou sous-exposées ou tombaient des lames pendant l’étape de déshydratation et généralement, plusieurs expériences devaient être regroupées pour avoir suffisamment de cellules pour l’analyse.
Le présent protocole décrit l’utilisation du kit de coloration golgi (voir Tableau des matériaux) pour étiqueter les dendrites et les épines dendritiques dans l’hippocampe et le cortex préfrontal médian (mPFC) du rat. Les avantages de cette méthode par rapport aux précédentes sont qu’elle est rapide, qu’il y a moins d’exposition aux produits chimiques nocifs pour le chercheur et qu’il y a une coloration constante des neurones. Le protocole décrit ci-dessous a été utilisé avec des modifications mineures pour évaluer la densité de la colonne vertébrale dendritique dans l’hippocampe et le mPFC du rat dans de nombreuses études 9,10,11,12,13,14,15.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cardboard slides trays</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-587-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 24 x 60mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FD Rapid GolgiStain kit</td>
			<td>FD Neurotechnologies</td>
			<td>PK 401</td>
			<td>Stable at RT in the dark for months; Golgi staining kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing Spray</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-022524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HISTO-CLEAR</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-899-90147</td>
			<td>clearing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NCSS Software</td>
			<td>Kaysville, UT, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SP-15-100</td>
			<td>mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Microscope slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Tek CTYO OCT Compound</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-373-65</td>
			<td>Used to mount brains on cryostat chuck</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid golgi stain for dendritic spine visualization in hippocampus and prefrontal cortex

L’imprégnation golgi, utilisant le kit de coloration Golgi avec des adaptations mineures, est utilisée pour imprégner les épines dendritiques dans l’hippocampe du rat et le cortex préfrontal médian. Cette technique est une amélioration marquée par rapport aux méthodes précédentes d’imprégnation de Golgi car les produits chimiques prémélangés sont plus sûrs à utiliser, les neurones sont toujours bien imprégnés, il y a beaucoup moins de débris de fond et, pour une région donnée, il existe des écarts extrêmement faibles dans la densité de la colonne vertébrale entre les expériences. De plus, les cerveaux peuvent être accumulés après un certain point et conservés congelés jusqu’à un traitement ultérieur. En utilisant cette méthode, toute région du cerveau d’intérêt peut être étudiée. Une fois tachée et recouverte glissée, la densité de la colonne vertébrale dendritique est déterminée en comptant le nombre d’épines pour une longueur de dendrite et exprimée en densité de colonne vertébrale par dendrite de 10 μm.

En utilisant la méthode rapide de Golgi, les cellules sont toujours bien imprégnées de sorte qu’il y a beaucoup de cellules à analyser. Il s’agit d’une nette amélioration par rapport aux méthodes précédentes où les expériences devaient être regroupées pour disposer de suffisamment de données pour l’analyse. Par conséquent, plus d’échantillons peuvent être traités à la fois et les cerveaux peuvent être conservés congelés jusqu’au traitement. Des exemples de cellules imprégnées de Golgi d...

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Rapid Golgi Stain for Dendritic Spine Visualization in Hippocampus and Prefrontal Cortex

Le protocole décrit une modification de la méthode rapide de Golgi, qui peut être adaptée à n’importe quelle partie du système nerveux, pour colorer les neurones de l’hippocampe et du cortex préfrontal médian du rat.

Coloration rapide de Golgi pour la visualisation de la colonne vertébrale dendritique dans l’hippocampe et le cortex préfrontal

Golgi impregnation, using the Golgi staining kit with minor adaptations, is used to impregnate dendritic spines in the rat hippocampus and medial ...

Bien que relativement simple, la technique d’imprégnation de Golgi comporte des étapes délicates et le fait de ne pas les faire correctement entraîne des cellules impropres à l’analyse. Cette technique permet un marquage rapide et reproductible des neurones imprégnés de Golgi. Et de plus, la petite erreur-type de la moyenne permet de comparer les expériences.La partie la plus difficile de cette technique est de couper les sections de cryostat, car il y a une consistance et une fixation inhabituelles, et donc les obtenir sur la glissière à plat est un peu un défi. Tout d’abord, placez une petite quantité de milieu tissulaire sur un mandrin de cryostat pré-refroidi. Montez les blocs cérébraux sur des mandrins de cryostat en décongelant légèrement un côté du bloc dans une main gantée et en le plaçant sur le milieu tissulaire.Utilisez un spray de congélation sur le couteau et le bloc. Utilisez la plaque anti-roulis ou la brosse pour garder la section à plat pendant la coupe. Coupez des sections de 100 micromètres sur un cryostat à moins 22 degrés Celsius.Montez le dégel, si possible, en utilisant une glissière à température ambiante et opposez-la rapidement à la section. Alternativement, gardez les lames dans le cryostat, afin qu’elles gèlent. Transférez la section avec une pince froide ou un pinceau froid, puis décongelez le support.Montez trois à quatre sections coronales sur les affaissements. Nettoyez le couteau avec des lingettes en papier entre les tranches. Si le couteau nécessite un nettoyage supplémentaire, utilisez 100% d’éthanol et séchez-le avant de couper la tranche suivante.Placez les diapositives dans des racks, suffisamment espacés pour permettre à la solution d’accéder aux sections. Placer les sections dans de l’eau distillée deux fois pendant quatre minutes avant de les placer dans la solution d’imprégnation de Golgi pendant 10 minutes. Séparez les bordereaux de couverture pour vous assurer qu’un seul bordereau de couverture est placé sur les sections.Couvrez les glissières de verre avec une quantité généreuse de support de montage avant de placer un couvercle en verre sur la glissière. Une fois la couverture glissée, les lames sèches ont été signalées sur tout papier non poreux pendant trois à cinq jours, en les déplaçant légèrement, surtout après le premier jour pour éviter de coller. Transférez ensuite les diapositives dans des porte-diapositives et, idéalement, séchez les diapositives pendant au moins trois semaines avant de les examiner.Pour analyser la densité de la colonne vertébrale dendritique dans les neurones pyramidaux du cortex préfrontal médian et de la région CA1 de l’hippocampe, mesurez la longueur dendritique à l’aide d’un programme d’analyse d’images. Comptez les épines sur les dendrites à l’aide d’un compteur à main et enregistrez la longueur et le nombre d’épines. Pour l’analyse, choisissez des neurones avec des corps cellulaires et des dendrites lorsqu’ils sont imprégnés, et des dendrites qui sont continues et distinguables des cellules adjacentes.La figure montre des exemples de cellules imprégnées de Golgi dans la région CA1 de l’hippocampe est montré à faible et haute puissance. La figure illustre une expérience dans laquelle la densité basale de la colonne vertébrale dendritique a été augmentée sur des cellules pyramidales chez des rats adolescents mâles et femelles après enrichissement environnemental en CA1 et dans le cortex préfrontal médian. Il est difficile de garder les sections suffisamment froides lors de la coupe et nous utilisons beaucoup de spray de congélation pour ce faire.Et puis par la suite, il est difficile de mettre les sections sur les diapositives et de les faire sécher à plat. Cette technique est utilisée pour examiner les caractéristiques neuroanatomiques. Il peut être utilisé seul ou en combinaison avec d’autres méthodes de traçage neuroanatomique.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

L&#39;analyse de la morphologie des épines dendritiques dans les neurones du SNC de culture

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compartment of synapses. These ...

Recherche

Neurosciences

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Visualisation et la manipulation génétique des dendrites et des épines dans le cortex cérébral et l&#39;hippocampe de souris à l&#39;aide<em&gt; In utero</em&gt; Électroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

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Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Rapide Micro-iontophorèse de glutamate et le GABA: un outil utile d&#39;étudier l&#39;intégration synaptique

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In a constantly aging population, the prevalence of neurodegenerative disorders is expected to rise. Understanding disease mechanisms is the key to find ...

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Studying the physiological properties of specific synapses in the brain, and how they undergo plastic changes, is a key challenge in modern neuroscience. ...