Name: removal of an internal translational start site from mrna while retaining expression of the full-length protein
Uploaded: 2022-03-16T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Removal of an Internal Translational Start Site from mRNA While Retaining Expression of the Full-Length Protein at JoVE.com

Projektet blev støttet af National Institutes of Health tilskud (R01HL152691, R01HL138577 og R01HL159983) til RMS.

Alle dyrepleje- og undersøgelsesprotokoller blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committees of Cedars-Sinai Medical Center og University of Utah. C57BL/6J hunmus opnået fra kommercielle kilder ved 8-9 ugers alderen (se tabel over materialer) blev anvendt til forsøgene.
1. Forberedelse til målretning af gener
<ol><li>Vælg guidemålsekvensen omkring det målrettede mutationssted, der koder for M213, ved hjælp af CRIS...

<ol>
	<li>Smyth, J. W., Shaw, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoregulation+of+connexin43+gap+junction+formation+by+internally+translated+isoforms.">Autoregulation of connexin43 gap junction formation by internally translated isoforms.</a> Cell Reports. 5 (3), 611-618 (2013).</li><li>Basheer, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GJA1-20k+arranges+actin+to+guide+Cx43+delivery+to+cardiac+intercalated+discs.">GJA1-20k arranges actin to guide Cx43 delivery to cardiac intercalated discs.</a> Circulation Research. 121 (9), 1069-1080 (2017).</li><li>Fu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cx43+isoform+GJA1-20k+promotes+microtubule+dependent+mitochondrial+transport.">Cx43 isoform GJA1-20k promotes microtubule dependent mitochondrial transport.</a> Frontiers in Physiology. 8, 905 (2017).</li><li>Xiao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auxiliary+trafficking+subunit+GJA1-20k+protects+connexin-43+from+degradation+and+limits+ventricular+arrhythmias.">Auxiliary trafficking subunit GJA1-20k protects connexin-43 from degradation and limits ventricular arrhythmias.</a> Journal of Clinical Investigation. 130 (9), 4858-4870 (2020).</li><li>Syvanen, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+gels+to+chips:+&amp;#34;minisequencing&amp;#34;+primer+extension+for+analysis+of+point+mutations+and+single+nucleotide+polymorphisms.">From gels to chips: &amp;#34;minisequencing&amp;#34; primer extension for analysis of point mutations and single nucleotide polymorphisms.</a> Human Mutation. 13 (1), 1-10 (1999).</li><li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+SNP+discovery+in+tetraploid+alfalfa+using+454+sequencing+and+high+resolution+melting+analysis.">Genome-wide SNP discovery in tetraploid alfalfa using 454 sequencing and high resolution melting analysis.</a> BMC Genomics. 12, 1-11 (2011).</li><li>Han, Y., Khu, D. M., Monteros, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+melting+analysis+for+SNP+genotyping+and+mapping+in+tetraploid+alfalfa+(Medicago+sativa+L.).">High-resolution melting analysis for SNP genotyping and mapping in tetraploid alfalfa (Medicago sativa L.).</a> Molecular Breeding. 29 (2), 489-501 (2012).</li><li>Peng, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+and+quick+PCR-based+method+to+genotype+mice+with+a+leptin+receptor+mutation+(db/db+mice).">A novel and quick PCR-based method to genotype mice with a leptin receptor mutation (db/db mice).</a> Acta Pharmacologica Sinica. 39 (1), 117-123 (2018).</li><li>Haeussler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+off-target+and+on-target+scoring+algorithms+and+integration+into+the+guide+RNA+selection+tool+CRISPOR.">Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR.</a> Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).</li><li>Concordet, J. P., Haeussler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPOR:+Intuitive+guide+selection+for+CRISPR/Cas9+genome+editing+experiments+and+screens.">CRISPOR: Intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens.</a> Nucleic Acids Research. 46 (1), 242-245 (2018).</li><li>Hsu, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+targeting+specificity+of+RNA-guided+Cas9+nucleases.">DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.</a> Nature Biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>Paquet, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+introduction+of+specific+homozygous+and+heterozygous+mutations+using+CRISPR/Cas9.">Efficient introduction of specific homozygous and heterozygous mutations using CRISPR/Cas9.</a> Nature. 533 (7601), 125-129 (2016).</li><li>Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , (2014).</li><li>Pomp, D., Critser, E. S., Rutledge, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lower+sodium+lactate+in+Whitten's+medium+improves+in+vitro+developmental+capacity+of+one-cell+mouse+embryos.">Lower sodium lactate in Whitten's medium improves in vitro developmental capacity of one-cell mouse embryos.</a> Theriogenology. 29 (5), 1019-1025 (1988).</li><li>Summers, M. C., McGinnis, L. K., Lawitts, J. A., Raffin, M., Biggers, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IVF+of+mouse+ova+in+a+simplex+optimized+medium+supplemented+with+amino+acids.">IVF of mouse ova in a simplex optimized medium supplemented with amino acids.</a> Human Reproduction. 15 (8), 1791-1801 (2000).</li><li>Green, M. R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition). , (2012).</li><li>Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Huang, Z., Harata, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+genotyping+of+animals+followed+by+establishing+primary+cultures+of+brain+neurons.">Rapid genotyping of animals followed by establishing primary cultures of brain neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. 95. (95), e51879 (2015).</li><li>Iyer, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=No+unexpected+CRISPR-Cas9+off-target+activity+revealed+by+trio+sequencing+of+gene-edited+mice.">No unexpected CRISPR-Cas9 off-target activity revealed by trio sequencing of gene-edited mice.</a> PLoS Genetics. 14 (7), 1007503 (2018).</li><li>Nature Medicine. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keep+off-target+effects+in+focus.">Keep off-target effects in focus.</a> Nature Medicine. 24 (8), 1081 (2018).</li><li>Mayer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+EcoRI-activity+of+EcoRI+endonuclease.">Optimization of the EcoRI-activity of EcoRI endonuclease.</a> FEBS Letters. 90 (2), 341-344 (1978).</li><li>Kozak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Point+mutations+close+to+the+AUG+initiator+codon+affect+the+efficiency+of+translation+of+rat+preproinsulin+in+vivo.">Point mutations close to the AUG initiator codon affect the efficiency of translation of rat preproinsulin in vivo.</a> Nature. 308 (5956), 241-246 (1984).</li><li>Kozak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Point+mutations+define+a+sequence+flanking+the+AUG+initiator+codon+that+modulates+translation+by+eukaryotic+ribosomes.">Point mutations define a sequence flanking the AUG initiator codon that modulates translation by eukaryotic ribosomes.</a> Cell. 44 (2), 283-292 (1986).</li><li>Basheer, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+response+protein+GJA1-20k+promotes+mitochondrial+biogenesis,+metabolic+quiescence,+and+cardioprotection+against+ischemia/reperfusion+injury.">Stress response protein GJA1-20k promotes mitochondrial biogenesis, metabolic quiescence, and cardioprotection against ischemia/reperfusion injury.</a> JCI Insight. 3 (20), 121900 (2018).</li><li>Shimura, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+mitochondrial+fission+induced+by+stress-responsive+protein+GJA1-20k.">Protective mitochondrial fission induced by stress-responsive protein GJA1-20k.</a> Elife. 10, 69207 (2021).</li></ol>

En genmodificeret musemodel er en almindelig tilgang til forståelse af genfunktion. Men da GJA1-20k internt oversat isoform er oversat fra det samme Gja1 mRNA som Cx43 i fuld længde, blev der udtænkt en kreativ strategi for at bevare Cx43-ekspression i fuld længde, men alligevel undertrykke GJA1-20k-ekspression. Tilgangen er baseret på en mutation af den interne startkodon af GJA1-20k. Med en enkeltpunktsmutation blev M213 skiftet til L på Gja1 mRNA, hvilket lykkedes at undertrykke GJA1-20k ekspre...

Connexin 43 (Cx43) i fuld længde og N-terminus afkortede isoform, GJA1-20k, kodet af det samme GJA1 mRNA, men bruger forskellige startkodoner1 til at starte oversættelse. Cx43-oversættelse sker ved den første AUG-startkodon, mens GJA1-20k-oversættelsen starter ved AUG ved rest 213. Det blev tidligere konstateret, at GJA1-20k har væsentlige roller for Cx43-handel i fuld længde, aktinstabilisering og regulering af mitokondriel morfologi in vitro 1,2,3.
For at forstå GJA1-20k in vivos rolle blev der genereret en GJA1-20k "knock-out" musemodel, der bevarede evnen til at skabe Cx43 i fuld længde. Fremgangsmåden var at anvende CRISPR-Cas9-systemet til at erstatte den enkelte restkoncentration ved 213 fra en methionin (M) til en leucin (L) (Gja1M213L/M213L)4. En intern M til L-mutation reducerer dramatisk sandsynligheden for, at intern oversættelse forekommer, men bevarer oversættelsen og funktionen af protein i fuld længde4. Fordi vildtypen (WT) og muteret allel har identiske størrelser og næsten identiske mRNA-produkter, er der betydelige vanskeligheder med at bekræfte genotype hos musene. DNA-sekventering kan identificere mutationen, men er for dyr og tidskrævende til rutinemæssig brug. Generelt er der etableret flere hurtigere genolydningsmetoder, såsom Real-time Polymerase Chain Reaction (RT-PCR), minisequencing-ligation, smelteanalyse i høj opløsning og tetra-primer amplificering ildfast mutationssystem PCR (ARMS-PCR) 5,6,7,8. Alligevel kræver disse alternative metoder flere trin, unikke ressourcer og / eller flere specifikke primersæt, som kan fremkalde ikke-specifikke PCR-produkter.
Denne protokol introducerer en detaljeret genmålretnings- og redigeringsmetode fra CRISPR-Cas9 for at skabe en enkelt aminosyremutation, og hurtig genotypning præsenteres for at bekræfte mutationen. Genotypeidentifikation involverer kreativ anvendelse af restriktionsenzymer, der kun bruger et enkelt sæt primere til at identificere målgenet. Læsere henvises til reference4 for at observere den dybe elektrofysiologiske virkning af pludselig hjertedød forårsaget af en enkelt rest Gja1M213L / M213L substitutionsmutation, som stadig genererer protein i fuld længde, men alligevel ikke genererer en mindre internt oversat afkortningsisoform. Denne protokol vil hjælpe med at få andre musemodeller til at bruge en punktmutation til at reducere den interne oversættelse af en isoform af interesse, samtidig med at ekspressionen af det endogene protein i fuld længde bevares.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL 8-Strip PCR tube</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1148A28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-038</td>
			<td>For pronuclear micorinjection buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x CutSmart buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7204S</td>
			<td>Digestion buffer for NlaIII</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Tris-HCl pH 7.5</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15567-027</td>
			<td>For pronuclear micorinjection buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50x TAE Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>24710-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Thermal cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>Model # 9902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>664</td>
			<td>mouse strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemidoc MP imaging system</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td>To take gel image by 302 nm UV light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eSpCas9 protein</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>ESPCAS9PRO-50UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Lading Dye Purple (6x)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7024S</td>
			<td>Loading buffer for electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gloves</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hCG (human chorionic gonadotropin)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>23-073-425G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>H3884-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Lab software</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td>To analyze gel image</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted stereo microscope whit plasDIC</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axiovert A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA Mouse Genotyping Kits</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>KK7352</td>
			<td>For tissue or cell lysis, DNA extraction, and PCR master mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KSOM</td>
			<td>LifeGlobal</td>
			<td>ZEKS-050</td>
			<td>embryo culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab coart</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M2 medium</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>MR015D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NlaIII</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0125S</td>
			<td>To digest PCR product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9937</td>
			<td>To dilute reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin oil</td>
			<td>Nacalai USA</td>
			<td>2613785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plugged 20 &#956;L fine pipette tip</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>02-707-171</td>
			<td>To pick up blastocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSG (pregnant mare&#8217;s serum gonadotropin)</td>
			<td>ProSpec-Tany</td>
			<td>HOR-272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9760G</td>
			<td>For pronuclear micorinjection buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR safe DNA Gel Stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S33102</td>
			<td>To detect bands in gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tracrRNA</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>U-002000-120</td>
			<td>Guid RNA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

removal of an internal translational start site from mrna while retaining expression of the full-length protein

CRISPR-Cas9-genredigeringssystemet, der er baseret på genomreparationsmekanismer, gør det muligt at producere genmodificerede musemodeller hurtigere og lettere i forhold til traditionel homolog rekombination. CRISPR-Cas9-systemet er særligt attraktivt, når der ønskes en enkeltpunktsmutation. Gap junction proteinet, Connexin 43 (Cx43), er kodet af genet Gja1, som har en enkelt kodende exon og ikke kan splejses. Gja1 producerer imidlertid ikke kun Cx43-protein i fuld længde, men op til seks N-terminus afkortede isoformer ved en proces kendt som intern oversættelse, resultatet af ribosomal oversættelsesinitiering på interne AUG (Methionin) startsteder. GJA1-20k er den mest almindeligt genererede afkortede isoform af Cx43 initieret ved AUG-kodonen i position 213 af Gja1 mRNA. Fordi rest 213 forekommer i slutningen af det sidste transmembrandomæne af Cx43, er GJA1-20k effektivt 20 kDa C-terminushalen af Cx43 som et uafhængigt protein. Tidligere efterforskere identificerede i celler, at en kritisk rolle for GJA1-20k er at lette handel med Cx43 gap junction hemikanaler i fuld længde til plasmamembranen. For at undersøge dette fænomen in vivo blev der genereret en mutant mus med en Gja1-punktmutation, der erstatter ATG (Methionin) ved rest 213 med TTA (Leucin, M213L-mutation). Resultatet af M213L er, at Gja1 mRNA og Cx43 i fuld længde stadig genereres, men oversættelsen af Gja1-20k reduceres betydeligt. Denne rapport fokuserer på at vælge restriktionsenzymstedet til at udvikle en aminosyremuteret (Gja1M213L / M213L) musemodel. Denne protokol beskriver genetisk modificerede mus ved CRISPR-Cas9-systemet og hurtig genotypning ved at kombinere PCR- og restriktionsenzymbehandlinger.

CRISPR/Cas9-genredigeringssystemet producerer en ATG til TTA-mutation og en tavs TCC til TCG-mutation ved 56.264.279 til 56.264.281 og ved 56.264.291 til 56.264.293 på musekromosom 10 eller ved henholdsvis 869 til 871 og 881 til 883 på Gja1 mRNA. Disse mutationer resulterer i en Methionin 213 til Leucin (M213L) mutation på GJA1-protein, og TTC til TTG-mutationen forstyrrer en nærliggende PAM-sekvens for at undgå uønsket genudgave (figur 1). Detaljerne i mutationen er beskrevet i en tid...

Watch this Scientific Journal Video about Removal of an Internal Translational Start Site from mRNA While Retaining Expression of the Full-Length Protein at JoVE.com

Removal of an Internal Translational Start Site from mRNA While Retaining Expression of the Full-Length Protein

Den nuværende protokol beskriver en enkelt M213L-mutation i Gja1, der bevarer Connexin43-generationen i fuld længde, men forhindrer oversættelse af den mindre GJA1-20k internt oversatte isoform.

Fjernelse af et internt translationelt startsted fra mRNA, samtidig med at ekspressionen af proteinet i fuld længde bevares

The CRISPR-Cas9 gene-editing system, based on genome repair mechanisms, enables the generation of gene-modified mouse models more quickly and easily ...

Vanskeligheden ved en enkelt resterstatning er at genotypere dyr effektivt på trods af forskellen i enkelt restkoncentration. Særlig brug af et restriktionsenzym tilføjer kun et enkelt, hurtigt og billigt trin til typisk PCR-baseret genotyping. Denne protokol kan anvendes på enhver anden musemodel med et mutationspunkt, hvis målsekvensen genkendes af et restriktionsenzym, hvilket normalt er tilfældet.Skær en til tre millimeter af halespidsen med ren saks og overfør den til et 0,2 milliliter otte-strimmel PCR-rør. Efter at have indeholdt haleprøven som beskrevet i manuskriptet, opbevares den ved T-minus 20 grader Celsius indtil ekstraktionen, op til ca. en uge. Tilsæt 100 mikroliter vævslyseopløsning pr. rør og bland godt, efterfulgt af spin-down ved hjælp af en bordplade minicentrifuge ved 2.200 gange G i 10 sekunder ved stuetemperatur.Sørg for, at haleprøverne er nedsænket i opløsningen. Indstil rørene på et termisk cykatorsæt ved at programmere parametrene for vævslyse, inaktivering og fastholdelse. Opbevar vævslysatet ved fire grader Celsius i op til en uge, hvis PCR ikke kan udføres med det samme.Forbered en PCR-opløsning indeholdende fem mikroliter nukleasefrit vand, 0,75 mikroliter 10 mikromolære frem og tilbagegående primere og 7,5 mikroliter PCR-masterblanding pr. Prøve i et nyt PCR-rør. Tilsæt en mikroliter af det tidligere fremstillede vævslysat til PCR-opløsningen. Bland PCR-opløsningen godt og drej ned med en bordplade minicentrifuge ved 2.200 gange G i 10 sekunder ved stuetemperatur.Sæt rørene på en programmeret termisk cyktur. Når reaktionen er afsluttet, opbevares PCR-produkterne ved fire grader Celsius i en til to måneder eller cirka et år ved minus 20 grader Celsius. Forbered enzymopløsningen indeholdende syv mikroliter nukleasefrit vand, to mikroliter CutSmart-buffer ved 10X styrke og en mikroliter NlaIII-restriktionsenzym.Hvis der er flere prøver, multipliceres hvert indhold for at gøre blandingen og aliquot 10 mikroliter pr. Rør. Der tilsættes 10 mikroliter PCR-produkt, der tidligere er opnået, til enzymopløsningen pr. rør. Bland godt og drej ned med bordpladens minicentrifuge som tidligere påvist.Sæt rørene på en programmeret termisk cykturer eller varmeblok. Opbevar produktet efter inkubation under kolde forhold. Tilsæt 0,75 gram agarose i 50 ml TAE-buffer med én styrke.Bland og opvarm agarose i mikrobølgeovnen, indtil den opløses helt. Efter afkøling tilsættes fem mikroliter DNA-plet og blandes forsigtigt. Hæld 25 ml agarosegelen i gelformen og lad gelen størkne.Læg 10 mikroliter fordøjet PCR-produkt i brønden. Kør gelen med 100 volt i 35 minutter. Forestil dig agarosegelen under ultraviolet lys.Agaroseelektroforesen udført ved hjælp af det fordøjede PCR-produkt resulterede i flere bånd af forskellig størrelse i hver genotype, med to bånd i vild type, tre i heterozygot og et i homozygot, henholdsvis. Testinjektion med blastocystanalyse resulterede i en succesrate på 76,9% ved injektion af 50 nanogram pr. Mikroliter af donoroliigoerne og en succesrate på 25% ved injektion af henholdsvis 25 nanogram pr. Mikroliter af de samme donoroligoer. Endelig opnåede injektion af 50 nanogram pr. Mikroliter af donoroliigoerne med ethanoludfældning grundlæggerdyr med en succesrate på 50%.Oprensning af oligodonorer ved ethanoludfældning sænkede toksiciteten, samtidig med at den bevarede høj genomredigeringseffektivitet. Omhyggelig håndtering og tilsætning af en lav mængde reagenser er meget vigtig. Sørg for, at de er korrekt tilsat og blandes godt.

Research

JoVE Journal

Biology

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Homemade Site Directed Mutagenesis of Whole Plasmids

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins

GST-Hans oprensning: En to-trins Affinitetsrensning protokollen Efterlevelse fuld længde oprensede proteiner

Key assays in enzymology for the biochemical characterization of proteins in vitro necessitate high concentrations of the purified protein of interest. ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Spirende Gær Protein ekstraktion og oprensning for Studiet af Function, Interactions og post-translationelle modifikationer

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Identifikation af post-translationelle modifikationer til planteprotein Complexes

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

siRNA Screening at identificere Ubiquitin og ubiquitinlignende System Regulators Biologisk Pathways i dyrkede pattedyrceller

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

In vitro-syntese af modificeret mRNA for Induktion af protein-ekspression i humane celler

The exogenous delivery of coding synthetic messenger RNA (mRNA) for induction of protein synthesis in desired cells has enormous potential in the fields ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Grønt fluorescerende protein-baserede Expression Screening membranproteiner i<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...