Name: removal of an internal translational start site from mrna while retaining expression of the full-length protein
Uploaded: 2022-03-16T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Removal of an Internal Translational Start Site from mRNA While Retaining Expression of the Full-Length Protein at JoVE.com

Het project werd ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health (R01HL152691, R01HL138577 en R01HL159983) aan RMS.

'Alle dierverzorgings- en studieprotocollen zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committees van Cedars-Sinai Medical Center en de University of Utah. C57BL/6J vrouwelijke muizen verkregen uit commerciële bronnen op de leeftijd van 8-9 weken (zie Tabel met materialen) werden gebruikt voor de experimenten.
1. Voorbereiding op gentargeting
<ol><li>Selecteer de richtdoelsequentie rond de beoogde mutatieplaats die M213 codeert met behulp va...

<ol>
	<li>Smyth, J. W., Shaw, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoregulation+of+connexin43+gap+junction+formation+by+internally+translated+isoforms.">Autoregulation of connexin43 gap junction formation by internally translated isoforms.</a> Cell Reports. 5 (3), 611-618 (2013).</li><li>Basheer, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GJA1-20k+arranges+actin+to+guide+Cx43+delivery+to+cardiac+intercalated+discs.">GJA1-20k arranges actin to guide Cx43 delivery to cardiac intercalated discs.</a> Circulation Research. 121 (9), 1069-1080 (2017).</li><li>Fu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cx43+isoform+GJA1-20k+promotes+microtubule+dependent+mitochondrial+transport.">Cx43 isoform GJA1-20k promotes microtubule dependent mitochondrial transport.</a> Frontiers in Physiology. 8, 905 (2017).</li><li>Xiao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auxiliary+trafficking+subunit+GJA1-20k+protects+connexin-43+from+degradation+and+limits+ventricular+arrhythmias.">Auxiliary trafficking subunit GJA1-20k protects connexin-43 from degradation and limits ventricular arrhythmias.</a> Journal of Clinical Investigation. 130 (9), 4858-4870 (2020).</li><li>Syvanen, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+gels+to+chips:+&amp;#34;minisequencing&amp;#34;+primer+extension+for+analysis+of+point+mutations+and+single+nucleotide+polymorphisms.">From gels to chips: &amp;#34;minisequencing&amp;#34; primer extension for analysis of point mutations and single nucleotide polymorphisms.</a> Human Mutation. 13 (1), 1-10 (1999).</li><li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+SNP+discovery+in+tetraploid+alfalfa+using+454+sequencing+and+high+resolution+melting+analysis.">Genome-wide SNP discovery in tetraploid alfalfa using 454 sequencing and high resolution melting analysis.</a> BMC Genomics. 12, 1-11 (2011).</li><li>Han, Y., Khu, D. M., Monteros, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+melting+analysis+for+SNP+genotyping+and+mapping+in+tetraploid+alfalfa+(Medicago+sativa+L.).">High-resolution melting analysis for SNP genotyping and mapping in tetraploid alfalfa (Medicago sativa L.).</a> Molecular Breeding. 29 (2), 489-501 (2012).</li><li>Peng, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+and+quick+PCR-based+method+to+genotype+mice+with+a+leptin+receptor+mutation+(db/db+mice).">A novel and quick PCR-based method to genotype mice with a leptin receptor mutation (db/db mice).</a> Acta Pharmacologica Sinica. 39 (1), 117-123 (2018).</li><li>Haeussler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+off-target+and+on-target+scoring+algorithms+and+integration+into+the+guide+RNA+selection+tool+CRISPOR.">Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR.</a> Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).</li><li>Concordet, J. P., Haeussler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPOR:+Intuitive+guide+selection+for+CRISPR/Cas9+genome+editing+experiments+and+screens.">CRISPOR: Intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens.</a> Nucleic Acids Research. 46 (1), 242-245 (2018).</li><li>Hsu, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+targeting+specificity+of+RNA-guided+Cas9+nucleases.">DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.</a> Nature Biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>Paquet, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+introduction+of+specific+homozygous+and+heterozygous+mutations+using+CRISPR/Cas9.">Efficient introduction of specific homozygous and heterozygous mutations using CRISPR/Cas9.</a> Nature. 533 (7601), 125-129 (2016).</li><li>Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , (2014).</li><li>Pomp, D., Critser, E. S., Rutledge, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lower+sodium+lactate+in+Whitten's+medium+improves+in+vitro+developmental+capacity+of+one-cell+mouse+embryos.">Lower sodium lactate in Whitten's medium improves in vitro developmental capacity of one-cell mouse embryos.</a> Theriogenology. 29 (5), 1019-1025 (1988).</li><li>Summers, M. C., McGinnis, L. K., Lawitts, J. A., Raffin, M., Biggers, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IVF+of+mouse+ova+in+a+simplex+optimized+medium+supplemented+with+amino+acids.">IVF of mouse ova in a simplex optimized medium supplemented with amino acids.</a> Human Reproduction. 15 (8), 1791-1801 (2000).</li><li>Green, M. R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition). , (2012).</li><li>Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Huang, Z., Harata, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+genotyping+of+animals+followed+by+establishing+primary+cultures+of+brain+neurons.">Rapid genotyping of animals followed by establishing primary cultures of brain neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. 95. (95), e51879 (2015).</li><li>Iyer, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=No+unexpected+CRISPR-Cas9+off-target+activity+revealed+by+trio+sequencing+of+gene-edited+mice.">No unexpected CRISPR-Cas9 off-target activity revealed by trio sequencing of gene-edited mice.</a> PLoS Genetics. 14 (7), 1007503 (2018).</li><li>Nature Medicine. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keep+off-target+effects+in+focus.">Keep off-target effects in focus.</a> Nature Medicine. 24 (8), 1081 (2018).</li><li>Mayer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+EcoRI-activity+of+EcoRI+endonuclease.">Optimization of the EcoRI-activity of EcoRI endonuclease.</a> FEBS Letters. 90 (2), 341-344 (1978).</li><li>Kozak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Point+mutations+close+to+the+AUG+initiator+codon+affect+the+efficiency+of+translation+of+rat+preproinsulin+in+vivo.">Point mutations close to the AUG initiator codon affect the efficiency of translation of rat preproinsulin in vivo.</a> Nature. 308 (5956), 241-246 (1984).</li><li>Kozak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Point+mutations+define+a+sequence+flanking+the+AUG+initiator+codon+that+modulates+translation+by+eukaryotic+ribosomes.">Point mutations define a sequence flanking the AUG initiator codon that modulates translation by eukaryotic ribosomes.</a> Cell. 44 (2), 283-292 (1986).</li><li>Basheer, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+response+protein+GJA1-20k+promotes+mitochondrial+biogenesis,+metabolic+quiescence,+and+cardioprotection+against+ischemia/reperfusion+injury.">Stress response protein GJA1-20k promotes mitochondrial biogenesis, metabolic quiescence, and cardioprotection against ischemia/reperfusion injury.</a> JCI Insight. 3 (20), 121900 (2018).</li><li>Shimura, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+mitochondrial+fission+induced+by+stress-responsive+protein+GJA1-20k.">Protective mitochondrial fission induced by stress-responsive protein GJA1-20k.</a> Elife. 10, 69207 (2021).</li></ol>

Een gen-gemodificeerd muismodel is een veel voorkomende benadering voor het begrijpen van de genfunctie. Omdat de intern vertaalde isovorm van GJA1-20k echter wordt vertaald uit hetzelfde Gja1-mRNA als Cx43 van volledige lengte, werd een creatieve strategie bedacht om de Cx43-expressie over de volledige lengte te behouden en toch de GJA1-20k-expressie te onderdrukken. De aanpak is gebaseerd op een mutatie van het interne startcodon van GJA1-20k. Met een single point mutatie werd M213 overgeschakeld naar L op <em...

De volledige lengte Connexin 43 (Cx43) en de N-terminus afgeknotte isovorm, GJA1-20k, gecodeerd door hetzelfde GJA1-mRNA, maar gebruiken verschillende startcodons1 om de translatie te initiëren. Cx43-translatie vindt plaats bij het eerste AUG-startcodon, terwijl GJA1-20k-translatie begint bij de AUG bij residu 213. Eerder werd vastgesteld dat GJA1-20k essentiële rollen heeft voor volledige Cx43-handel, actinestabilisatie en regulatie van mitochondriale morfologie in vitro 1,2,3.
Om de rol van GJA1-20k in vivo te begrijpen, werd een GJA1-20k "knock-out" muismodel gegenereerd dat de mogelijkheid behield om Cx43 van volledige lengte te maken. De aanpak was om het CRISPR-Cas9-systeem te gebruiken om het enkele residu bij 213 te vervangen van een methionine (M) naar een leucine (L) (Gja1M213L / M213L)4. Een interne M naar L mutatie vermindert de kans op interne translatie drastisch, maar behoudt de translatie en functie van eiwit4 over de volledige lengte. Omdat het wildtype (WT) en het gemuteerde allel identieke afmetingen en bijna identieke mRNA-producten hebben, is het bij de muizen erg moeilijk om het genotype te bevestigen. DNA-sequencing kan de mutatie identificeren, maar is te duur en tijdrovend voor routinematig gebruik. Over het algemeen zijn verschillende snellere genotyperingsmethoden vastgesteld, zoals Real-time Polymerase Chain Reaction (RT-PCR), minisequencing-ligatie, hoge-resolutie smeltanalyse en tetra-primer amplificatie refractair mutatiesysteem PCR (ARMS-PCR)5,6,7,8. Toch vereisen deze alternatieve methoden meerdere stappen, unieke bronnen en /of verschillende specifieke primersets die niet-specifieke PCR-producten kunnen induceren.
Dit protocol introduceert een gedetailleerde gen targeting en editing aanpak door CRISPR-Cas9 om een enkele aminozuurmutatie te creëren, en snelle genotypering wordt gepresenteerd om de mutatie te bevestigen. Genotype-identificatie omvat het creatieve gebruik van restrictie-enzymen die slechts een enkele set primers gebruiken om het doelgen te identificeren. Lezers worden verwezen naar Referentie4 om het diepgaande elektrofysiologische effect van plotselinge hartdood te observeren, veroorzaakt door een één residu Gja1M213L / M213L substitutiemutatie die nog steeds eiwit over de volledige lengte genereert, maar er niet in slaagt een kleinere intern vertaalde truncation isoform te genereren. Dit protocol zal andere muizenmodellen helpen een puntmutatie te gebruiken om de interne translatie van een isovorm van belang te verminderen met behoud van de expressie van het endogene eiwit over de volledige lengte.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL 8-Strip PCR tube</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1148A28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-038</td>
			<td>For pronuclear micorinjection buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x CutSmart buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7204S</td>
			<td>Digestion buffer for NlaIII</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Tris-HCl pH 7.5</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15567-027</td>
			<td>For pronuclear micorinjection buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50x TAE Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>24710-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Thermal cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>Model # 9902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>664</td>
			<td>mouse strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemidoc MP imaging system</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td>To take gel image by 302 nm UV light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eSpCas9 protein</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>ESPCAS9PRO-50UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Lading Dye Purple (6x)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7024S</td>
			<td>Loading buffer for electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gloves</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hCG (human chorionic gonadotropin)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>23-073-425G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>H3884-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Lab software</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td>To analyze gel image</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted stereo microscope whit plasDIC</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axiovert A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA Mouse Genotyping Kits</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>KK7352</td>
			<td>For tissue or cell lysis, DNA extraction, and PCR master mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KSOM</td>
			<td>LifeGlobal</td>
			<td>ZEKS-050</td>
			<td>embryo culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab coart</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M2 medium</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>MR015D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NlaIII</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0125S</td>
			<td>To digest PCR product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9937</td>
			<td>To dilute reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin oil</td>
			<td>Nacalai USA</td>
			<td>2613785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plugged 20 &#956;L fine pipette tip</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>02-707-171</td>
			<td>To pick up blastocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSG (pregnant mare&#8217;s serum gonadotropin)</td>
			<td>ProSpec-Tany</td>
			<td>HOR-272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9760G</td>
			<td>For pronuclear micorinjection buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR safe DNA Gel Stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S33102</td>
			<td>To detect bands in gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tracrRNA</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>U-002000-120</td>
			<td>Guid RNA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

removal of an internal translational start site from mrna while retaining expression of the full-length protein

Het CRISPR-Cas9 genbewerkingssysteem, gebaseerd op genoomherstelmechanismen, maakt het mogelijk om sneller en gemakkelijker gen-gemodificeerde muismodellen te genereren in vergelijking met traditionele homologe recombinatie. Het CRISPR-Cas9-systeem is vooral aantrekkelijk wanneer een single-point mutatie gewenst is. Het gap junction-eiwit, Connexin 43 (Cx43), wordt gecodeerd door gen Gja1, dat een enkel coderend exon heeft en niet kan worden gesplitst. Gja1 produceert echter niet alleen Cx43-eiwit over de volledige lengte, maar tot zes N-terminus afgeknotte isovormen door een proces dat bekend staat als interne translatie, het resultaat van ribosomale translatie-initiatie op interne AUG (Methionine) startplaatsen. GJA1-20k is de meest gegenereerde afgeknotte isovorm van Cx43 geïnitieerd bij het AUG-codon op positie 213 van Gja1 mRNA. Omdat residu 213 optreedt aan het einde van het laatste transmembraandomein van Cx43, is GJA1-20k effectief de 20 kDa C-terminusstaart van Cx43 als onafhankelijk eiwit. Eerdere onderzoekers identificeerden in cellen dat een cruciale rol van GJA1-20k is om de handel in Cx43 gap junction hemichannels over de volledige lengte naar het plasmamembraan te vergemakkelijken. Om dit fenomeen in vivo te onderzoeken, werd een mutante muis met een Gja1-puntmutatie gegenereerd die de ATG (Methionine) bij residu 213 vervangt door TTA (Leucine, M213L-mutatie). Het resultaat van M213L is dat Gja1 mRNA en full-length Cx43 nog steeds worden gegenereerd, maar de translatie van Gja1-20k is aanzienlijk verminderd. Dit rapport richt zich op het kiezen van de restrictie-enzymplaats om een één aminozuur gemuteerd (Gja1M213L / M213L) muismodel te ontwikkelen. Dit protocol beschrijft genetisch gemodificeerde muizen door het CRISPR-Cas9-systeem en snelle genotypering door pcr- en restrictie-enzymbehandelingen te combineren.

Het CRISPR/Cas9-genbewerkingssysteem produceert een ATG naar TTA-mutatie en een stille TCC naar TCG-mutatie bij 56.264.279 tot 56.264.281 en bij 56.264.291 tot 56.264.293 op muischromosoom 10, of bij respectievelijk 869 tot 871 en 881 tot 883 op Gja1 mRNA. Die mutatie resulteert in een methionine 213 tot Leucine (M213L) mutatie op GJA1 eiwit en de TTC naar TTG mutatie verstoort een nabijgelegen PAM-sequentie om ongewenste geneditie te voorkomen (figuur 1). De details van de mutatie zijn besc...

Watch this Scientific Journal Video about Removal of an Internal Translational Start Site from mRNA While Retaining Expression of the Full-Length Protein at JoVE.com

Removal of an Internal Translational Start Site from mRNA While Retaining Expression of the Full-Length Protein

Het huidige protocol beschrijft een enkele M213L-mutatie in Gja1 die de connexin43-generatie over de volledige lengte behoudt, maar de vertaling van de kleinere GJA1-20k intern vertaalde isovorm voorkomt.

Verwijdering van een interne translationele startplaats van mRNA met behoud van expressie van het eiwit over de volledige lengte

The CRISPR-Cas9 gene-editing system, based on genome repair mechanisms, enables the generation of gene-modified mouse models more quickly and easily ...

De moeilijkheid met een enkele residusubstitutie is om dieren efficiënt te genotyperen, ondanks het verschil in enkel residu. Speciaal gebruik van een restrictie-enzym voegt slechts een enkele, snelle en goedkope stap toe aan typische PCR-gebaseerde genotypering. Dit protocol kan worden toegepast op elk ander muismodel met een punt van mutatie als de doelsequentie wordt herkend door een restrictie-enzym, wat meestal het geval is.Knip één tot drie millimeter van de staartpunt met een schone schaar en breng deze over naar een 0,2 milliliter achtstrips PCR-buis. Nadat u het staartmonster hebt bevat zoals beschreven in het manuscript, bewaart u het bij T-minus 20 graden Celsius tot de extractie, tot ongeveer een week. Voeg 100 microliter weefsellysisoplossing per buis toe en meng goed, gevolgd door spin-down met behulp van een tafelmodel minicentrifuge op 2, 200 keer G gedurende 10 seconden bij kamertemperatuur.Zorg ervoor dat de staartmonsters in de oplossing zijn ondergedompeld. Plaats de buizen op een thermische cycler die is ingesteld door de parameters voor weefsellysis, inactivatie en vasthouden te programmeren. Bewaar het weefsel lysaat bij vier graden Celsius gedurende maximaal een week als PCR niet onmiddellijk kan worden uitgevoerd.Bereid een PCR-oplossing met vijf microliter nucleasevrij water, 0,75 microliter 10 micromolaire voorwaartse en omgekeerde primers en 7,5 microliter PCR-mastermix per monster in een nieuwe PCR-buis. Voeg één microliter van het eerder bereide weefsellysaat toe aan de PCR-oplossing. Meng de PCR-oplossing goed en draai met een tafelmodel minicentrifuge op 2, 200 maal G gedurende 10 seconden bij kamertemperatuur.Zet de buizen op een geprogrammeerde thermische cycler. Zodra de reactie is voltooid, bewaart u de PCR-producten bij vier graden Celsius gedurende één tot twee maanden of ongeveer een jaar bij min 20 graden Celsius. Bereid de enzymoplossing met zeven microliter nucleasevrij water, twee microliter CutSmart-buffer met een sterkte van 10X en één microliter NlaIII-restrictie-enzym.Als er meerdere monsters zijn, vermenigvuldigt u elke inhoud om het mengsel te maken en aliquot 10 microliter per buis. Voeg per buis 10 microliter PCR-product toe aan de enzymoplossing. Meng goed en draai naar beneden met de tafelmodel minicentrifuge zoals eerder gedemonstreerd.Plaats de buizen op een geprogrammeerde thermische cycler of warmteblok. Bewaar het product na incubatie onder koude omstandigheden. Voeg 0,75 gram agarose toe in 50 milliliter tae-buffer met enkele sterkte.Meng en verwarm de agarose in de magnetron totdat deze volledig is opgelost. Voeg na het afkoelen vijf microliter DNA-kleuring toe en meng voorzichtig. Giet 25 milliliter van de agarose gel in de gelvorm en laat de gel stollen.Laad 10 microliter verteerd PCR-product in de put. Laat de gel 35 minuten met 100 volt lopen. Stel je de agarose-gel voor onder ultraviolet licht.De agarose-elektroforese uitgevoerd met behulp van het verteerde PCR-product resulteerde in verschillende banden van verschillende grootte in elk genotype, met respectievelijk twee banden in wildtype, drie in heterozygoot en één in homozygoot. Testinjectie met blastocystanalyse resulteerde in een slagingspercentage van 76,9% bij het injecteren van 50 nanogram per microliter van de donor oligo's en een slagingspercentage van 25% bij het injecteren van respectievelijk 25 nanogram per microliter van dezelfde donor oligo's. Ten slotte werd door het injecteren van 50 nanogram per microliter van de donor oligo's met ethanolprecipitatie stichterdieren met een slagingspercentage van 50% verkregen.Zuivering van oligodonoren door ethanolprecipitatie verlaagde de toxiciteit met behoud van een hoge efficiëntie van het bewerken van het genoom. Zorgvuldige hantering en bij het toevoegen van een lage hoeveelheid reagentia is erg belangrijk. Zorg ervoor dat ze correct worden toegevoegd en goed worden gemengd.

Research

JoVE Journal

Biology

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

De vervaardiging van primaire hematopoietische cellen culturen uit Murine Bone Marrow voor Elektroporatie

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Homemade Site Directed Mutagenesis of Whole Plasmids

Homemade plaatsgerichte mutagenese van Whole Plasmids

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Kleuring van eiwitten in Gels met Coomassie G-250 zonder organisch oplosmiddel en azijnzuur

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

Met behulp van een geautomatiseerde cel Counter aan Gene Expression Studies Vereenvoudigen: siRNA Knockdown van IL-4 Afhankelijk van genexpressie in cellen Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins

GST-Zijn zuivering: een twee-staps Affiniteitszuivering Protocol Meegevende Full-length gezuiverde eiwitten

Key assays in enzymology for the biochemical characterization of proteins in vitro necessitate high concentrations of the purified protein of interest. ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Ontluikende Gist Protein extractie en zuivering voor de Studie van de functie, interacties, en post-translationele modificaties

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Identificatie van post-translationele modificaties van Plant eiwitcomplexen

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

siRNA Screening naar Ubiquitin en Ubiquitin-achtig systeem regulatoren van biologische pathways identificeren in gekweekte zoogdiercellen

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

In vitro Synthese van gemodificeerde mRNA voor inductie van eiwitexpressie in menselijke cellen

The exogenous delivery of coding synthetic messenger RNA (mRNA) for induction of protein synthesis in desired cells has enormous potential in the fields ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein gebaseerd Expression Screening van membraaneiwitten in<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...