Name: removal of an internal translational start site from mrna while retaining expression of the full-length protein
Uploaded: 2022-03-16T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Removal of an Internal Translational Start Site from mRNA While Retaining Expression of the Full-Length Protein at JoVE.com

Das Projekt wurde durch Zuschüsse der National Institutes of Health (R01HL152691, R01HL138577 und R01HL159983) an RMS unterstützt.

"Alle Tierpflege- und Studienprotokolle wurden von den Institutional Animal Care and Use Committees des Cedars-Sinai Medical Center und der University of Utah genehmigt. Für die Experimente wurden weibliche C57BL/6J-Mäuse verwendet, die im Alter von 8-9 Wochen aus kommerziellen Quellen gewonnen wurden (siehe Materialtabelle).
1. Vorbereitung auf Gen-Targeting
<ol><li>Wählen Sie die Leitzielsequenz um die Zielmutationsstelle herum aus, die M213 kodiert, in...

<ol>
	<li>Smyth, J. W., Shaw, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoregulation+of+connexin43+gap+junction+formation+by+internally+translated+isoforms.">Autoregulation of connexin43 gap junction formation by internally translated isoforms.</a> Cell Reports. 5 (3), 611-618 (2013).</li><li>Basheer, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GJA1-20k+arranges+actin+to+guide+Cx43+delivery+to+cardiac+intercalated+discs.">GJA1-20k arranges actin to guide Cx43 delivery to cardiac intercalated discs.</a> Circulation Research. 121 (9), 1069-1080 (2017).</li><li>Fu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cx43+isoform+GJA1-20k+promotes+microtubule+dependent+mitochondrial+transport.">Cx43 isoform GJA1-20k promotes microtubule dependent mitochondrial transport.</a> Frontiers in Physiology. 8, 905 (2017).</li><li>Xiao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auxiliary+trafficking+subunit+GJA1-20k+protects+connexin-43+from+degradation+and+limits+ventricular+arrhythmias.">Auxiliary trafficking subunit GJA1-20k protects connexin-43 from degradation and limits ventricular arrhythmias.</a> Journal of Clinical Investigation. 130 (9), 4858-4870 (2020).</li><li>Syvanen, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+gels+to+chips:+&amp;#34;minisequencing&amp;#34;+primer+extension+for+analysis+of+point+mutations+and+single+nucleotide+polymorphisms.">From gels to chips: &amp;#34;minisequencing&amp;#34; primer extension for analysis of point mutations and single nucleotide polymorphisms.</a> Human Mutation. 13 (1), 1-10 (1999).</li><li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+SNP+discovery+in+tetraploid+alfalfa+using+454+sequencing+and+high+resolution+melting+analysis.">Genome-wide SNP discovery in tetraploid alfalfa using 454 sequencing and high resolution melting analysis.</a> BMC Genomics. 12, 1-11 (2011).</li><li>Han, Y., Khu, D. M., Monteros, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+melting+analysis+for+SNP+genotyping+and+mapping+in+tetraploid+alfalfa+(Medicago+sativa+L.).">High-resolution melting analysis for SNP genotyping and mapping in tetraploid alfalfa (Medicago sativa L.).</a> Molecular Breeding. 29 (2), 489-501 (2012).</li><li>Peng, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+and+quick+PCR-based+method+to+genotype+mice+with+a+leptin+receptor+mutation+(db/db+mice).">A novel and quick PCR-based method to genotype mice with a leptin receptor mutation (db/db mice).</a> Acta Pharmacologica Sinica. 39 (1), 117-123 (2018).</li><li>Haeussler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+off-target+and+on-target+scoring+algorithms+and+integration+into+the+guide+RNA+selection+tool+CRISPOR.">Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR.</a> Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).</li><li>Concordet, J. P., Haeussler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPOR:+Intuitive+guide+selection+for+CRISPR/Cas9+genome+editing+experiments+and+screens.">CRISPOR: Intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens.</a> Nucleic Acids Research. 46 (1), 242-245 (2018).</li><li>Hsu, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+targeting+specificity+of+RNA-guided+Cas9+nucleases.">DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.</a> Nature Biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>Paquet, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+introduction+of+specific+homozygous+and+heterozygous+mutations+using+CRISPR/Cas9.">Efficient introduction of specific homozygous and heterozygous mutations using CRISPR/Cas9.</a> Nature. 533 (7601), 125-129 (2016).</li><li>Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , (2014).</li><li>Pomp, D., Critser, E. S., Rutledge, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lower+sodium+lactate+in+Whitten's+medium+improves+in+vitro+developmental+capacity+of+one-cell+mouse+embryos.">Lower sodium lactate in Whitten's medium improves in vitro developmental capacity of one-cell mouse embryos.</a> Theriogenology. 29 (5), 1019-1025 (1988).</li><li>Summers, M. C., McGinnis, L. K., Lawitts, J. A., Raffin, M., Biggers, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IVF+of+mouse+ova+in+a+simplex+optimized+medium+supplemented+with+amino+acids.">IVF of mouse ova in a simplex optimized medium supplemented with amino acids.</a> Human Reproduction. 15 (8), 1791-1801 (2000).</li><li>Green, M. R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition). , (2012).</li><li>Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Huang, Z., Harata, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+genotyping+of+animals+followed+by+establishing+primary+cultures+of+brain+neurons.">Rapid genotyping of animals followed by establishing primary cultures of brain neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. 95. (95), e51879 (2015).</li><li>Iyer, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=No+unexpected+CRISPR-Cas9+off-target+activity+revealed+by+trio+sequencing+of+gene-edited+mice.">No unexpected CRISPR-Cas9 off-target activity revealed by trio sequencing of gene-edited mice.</a> PLoS Genetics. 14 (7), 1007503 (2018).</li><li>Nature Medicine. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keep+off-target+effects+in+focus.">Keep off-target effects in focus.</a> Nature Medicine. 24 (8), 1081 (2018).</li><li>Mayer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+EcoRI-activity+of+EcoRI+endonuclease.">Optimization of the EcoRI-activity of EcoRI endonuclease.</a> FEBS Letters. 90 (2), 341-344 (1978).</li><li>Kozak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Point+mutations+close+to+the+AUG+initiator+codon+affect+the+efficiency+of+translation+of+rat+preproinsulin+in+vivo.">Point mutations close to the AUG initiator codon affect the efficiency of translation of rat preproinsulin in vivo.</a> Nature. 308 (5956), 241-246 (1984).</li><li>Kozak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Point+mutations+define+a+sequence+flanking+the+AUG+initiator+codon+that+modulates+translation+by+eukaryotic+ribosomes.">Point mutations define a sequence flanking the AUG initiator codon that modulates translation by eukaryotic ribosomes.</a> Cell. 44 (2), 283-292 (1986).</li><li>Basheer, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+response+protein+GJA1-20k+promotes+mitochondrial+biogenesis,+metabolic+quiescence,+and+cardioprotection+against+ischemia/reperfusion+injury.">Stress response protein GJA1-20k promotes mitochondrial biogenesis, metabolic quiescence, and cardioprotection against ischemia/reperfusion injury.</a> JCI Insight. 3 (20), 121900 (2018).</li><li>Shimura, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+mitochondrial+fission+induced+by+stress-responsive+protein+GJA1-20k.">Protective mitochondrial fission induced by stress-responsive protein GJA1-20k.</a> Elife. 10, 69207 (2021).</li></ol>

Ein genmodifiziertes Mausmodell ist ein gängiger Ansatz zum Verständnis der Genfunktion. Da jedoch die intern übersetzte Isoform GJA1-20k aus derselben Gja1-mRNA wie die Cx43 in voller Länge übersetzt wird, wurde eine kreative Strategie entwickelt, um die Cx43-Expression in voller Länge beizubehalten und dennoch die GJA1-20k-Expression zu unterdrücken. Der Ansatz basiert auf einer Mutation des internen Startcodons von GJA1-20k. Mit einer Einzelpunktmutation wurde M213 auf L auf Gja1 mRNA umgestellt, wodur...

Das Connexin 43 (Cx43) in voller Länge und die abgeschnittene Isoform N-Terminus, GJA1-20k, kodiert durch dieselbe GJA1-mRNA, verwenden jedoch unterschiedliche Start-Codons1, um die Translation zu initiieren. Die Cx43-Translation erfolgt beim ersten AUG-Startcodon, während die GJA1-20k-Translation am AUG bei Rest 213 beginnt. Es wurde zuvor festgestellt, dass GJA1-20k eine wesentliche Rolle für den Cx43-Transport in voller Länge, die Stabilisierung von Aktin und die Regulation der mitochondrialen Morphologie in vitro 1,2,3 spielt.
Um die Rolle von GJA1-20k in vivo zu verstehen, wurde ein GJA1-20k "Knock-out" -Mausmodell generiert, das die Fähigkeit beibehielt, Cx43 in voller Länge zu erstellen. Der Ansatz bestand darin, das CRISPR-Cas9-System zu verwenden, um den einzelnen Rückstand bei 213 von einem Methionin (M) zu einem Leucin (L) (Gja1M213L/M213L)4 zu ersetzen. Eine interne M-zu-L-Mutation verringert die Wahrscheinlichkeit einer internen Translation dramatisch, behält jedoch die Translation und Funktion des Proteins 4 in voller Längebei. Da der Wildtyp (WT) und das mutierte Allel identische Größen und nahezu identische mRNA-Produkte aufweisen, gibt es erhebliche Schwierigkeiten, den Genotyp in den Mäusen zu bestätigen. Die DNA-Sequenzierung kann die Mutation identifizieren, ist aber für den routinemäßigen Gebrauch zu teuer und zeitaufwendig. Im Allgemeinen haben sich mehrere schnellere Genotypisierungsmethoden etabliert, wie z. B. die Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR), die Minisequenzierungs-Ligation, die hochauflösende Schmelzanalyse und das refraktäre Mutationssystem PCR (ARMS-PCR) 5,6,7,8. Diese alternativen Methoden erfordern jedoch mehrere Schritte, einzigartige Ressourcen und / oder mehrere spezifische Primer-Sets, die unspezifische PCR-Produkte induzieren können.
Dieses Protokoll führt einen detaillierten Gen-Targeting- und Editing-Ansatz von CRISPR-Cas9 ein, um eine einzelne Aminosäuremutation zu erzeugen, und eine schnelle Genotypisierung wird vorgestellt, um die Mutation zu bestätigen. Die Identifizierung des Genotyps beinhaltet die kreative Verwendung von Restriktionsenzymen, bei denen nur ein einziger Satz von Primern verwendet wird, um das Zielgen zu identifizieren. Die Leser werden auf Referenz 4 verwiesen, um die tiefgreifende elektrophysiologische Wirkung des plötzlichen Herztodes zu beobachten, der durch eine Gja1M213L/M213L-Substitutionsmutation mit einem Rückstand verursacht wird, die immer noch ein Protein in voller Länge erzeugt, aber keine kleinere intern übersetzte Trunkierungsisoform erzeugt. Dieses Protokoll wird dazu beitragen, dass andere Mäusemodelle eine Punktmutation verwenden, um die interne Translation einer Isoform von Interesse zu verringern und gleichzeitig die Expression des endogenen Protein in voller Länge beizubehalten.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL 8-Strip PCR tube</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1148A28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-038</td>
			<td>For pronuclear micorinjection buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x CutSmart buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7204S</td>
			<td>Digestion buffer for NlaIII</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Tris-HCl pH 7.5</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15567-027</td>
			<td>For pronuclear micorinjection buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50x TAE Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>24710-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Thermal cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>Model # 9902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>664</td>
			<td>mouse strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemidoc MP imaging system</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td>To take gel image by 302 nm UV light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eSpCas9 protein</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>ESPCAS9PRO-50UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Lading Dye Purple (6x)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7024S</td>
			<td>Loading buffer for electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gloves</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hCG (human chorionic gonadotropin)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>23-073-425G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>H3884-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Lab software</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td>To analyze gel image</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted stereo microscope whit plasDIC</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axiovert A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA Mouse Genotyping Kits</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>KK7352</td>
			<td>For tissue or cell lysis, DNA extraction, and PCR master mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KSOM</td>
			<td>LifeGlobal</td>
			<td>ZEKS-050</td>
			<td>embryo culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab coart</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M2 medium</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>MR015D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NlaIII</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0125S</td>
			<td>To digest PCR product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9937</td>
			<td>To dilute reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin oil</td>
			<td>Nacalai USA</td>
			<td>2613785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plugged 20 &#956;L fine pipette tip</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>02-707-171</td>
			<td>To pick up blastocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSG (pregnant mare&#8217;s serum gonadotropin)</td>
			<td>ProSpec-Tany</td>
			<td>HOR-272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9760G</td>
			<td>For pronuclear micorinjection buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR safe DNA Gel Stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S33102</td>
			<td>To detect bands in gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tracrRNA</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>U-002000-120</td>
			<td>Guid RNA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

removal of an internal translational start site from mrna while retaining expression of the full-length protein

Das Gen-Editing-System CRISPR-Cas9, das auf Genomreparaturmechanismen basiert, ermöglicht die schnellere und einfachere Generierung genmodifizierter Mausmodelle im Vergleich zur traditionellen homologen Rekombination. Das CRISPR-Cas9-System ist besonders attraktiv, wenn eine Einzelpunktmutation gewünscht wird. Das Gap-Junction-Protein, Connexin 43 (Cx43), wird vom Gen Gja1 kodiert, das ein einzelnes kodierendes Exon hat und nicht gespleißt werden kann. Gja1 produziert jedoch nicht nur Cx43-Protein in voller Länge, sondern bis zu sechs N-terminus-abgeschnittene Isoformen durch einen Prozess, der als interne Translation bekannt ist, das Ergebnis der ribosomalen Translationsinitiierung an internen AUG-Startstellen (Methionin). GJA1-20k ist die am häufigsten erzeugte abgeschnittene Isoform von Cx43, die am AUG-Codon an Position 213 der Gja1-mRNA initiiert wurde. Da der Rest 213 am Ende der letzten Transmembrandomäne von Cx43 auftritt, ist GJA1-20k effektiv der 20 kDa C-Terminus-Schwanz von Cx43 als unabhängiges Protein. Frühere Forscher identifizierten in Zellen, dass eine entscheidende Rolle von GJA1-20k darin besteht, den Handel von Cx43-Gap-Junction-Hemikanälen in voller Länge zur Plasmamembran zu erleichtern. Um dieses Phänomen in vivo zu untersuchen, wurde eine mutierte Maus mit einer Gja1-Punktmutation erzeugt, die das ATG (Methionin) am Rest 213 durch TTA (Leucin, M213L-Mutation) ersetzt. Das Ergebnis von M213L ist, dass Gja1 mRNA und Cx43 in voller Länge immer noch erzeugt werden, die Translation von Gja1-20k jedoch signifikant reduziert ist. Dieser Bericht konzentriert sich auf die Auswahl der Restriktionsenzymstelle, um ein mit einer Aminosäure mutiertes (Gja1 M213L/ M213L) Mausmodell zu entwickeln. Dieses Protokoll beschreibt genetisch veränderte Mäuse durch das CRISPR-Cas9-System und die schnelle Genotypisierung durch Kombination von PCR- und Restriktionsenzymbehandlungen.

Das CRISPR/Cas9-Gen-Editing-System erzeugt eine ATG-zu-TTA-Mutation und eine stille TCC-zu-TCG-Mutation bei 56.264.279 bis 56.264.281 und bei 56.264.291 bis 56.264.293 auf Mauschromosom 10 bzw. bei 869 bis 871 bzw. 881 bis 883 auf Gja1-mRNA. Diese Mutation führt zu einer Mutation von Methionin 213 zu Leucin (M213L) auf dem GJA1-Protein, und die TTC-zu-TTG-Mutation stört eine nahe gelegene PAM-Sequenz, um eine unerwünschte Genedition zu vermeiden (Abbildung 1). Die Details der Mutation sin...

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Removal of an Internal Translational Start Site from mRNA While Retaining Expression of the Full-Length Protein

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine einzelne M213L-Mutation in Gja1, die die Connexin43-Generation in voller Länge beibehält, aber die Translation der kleineren GJA1-20k-intern übersetzten Isoform verhindert.

Entfernung einer internen translationalen Startstelle aus der mRNA unter Beibehaltung der Expression des Protein in voller Länge

The CRISPR-Cas9 gene-editing system, based on genome repair mechanisms, enables the generation of gene-modified mouse models more quickly and easily ...

Die Schwierigkeit bei der Substitution einzelner Rückstände besteht darin, Tiere trotz des Unterschieds in den einzelnen Rückständen effizient zu genotypisieren. Die spezielle Verwendung eines Restriktionsenzyms fügt der typischen PCR-basierten Genotypisierung nur einen einzigen, schnellen und kostengünstigen Schritt hinzu. Dieses Protokoll kann auf jedes andere Mausmodell mit einem Mutationspunkt angewendet werden, wenn die Zielsequenz von einem Restriktionsenzym erkannt wird, was normalerweise der Fall ist.Schneiden Sie mit einer sauberen Schere ein bis drei Millimeter der Heckspitze ab und geben Sie sie in eine 0,2-Milliliter-Acht-Streifen-PCR-Röhre. Nachdem Sie die im Manuskript beschriebene Schwanzprobe enthalten haben, lagern Sie sie bis zur Extraktion bis zu etwa einer Woche bei T-minus 20 Grad Celsius. Fügen Sie 100 Mikroliter Gewebelyselösung pro Röhrchen hinzu und mischen Sie gut, gefolgt von einem Spin-Down mit einer Tisch-Minizentrifuge bei 2.200 mal G für 10 Sekunden bei Raumtemperatur.Stellen Sie sicher, dass die Schwanzproben in die Lösung eingetaucht sind. Stellen Sie die Röhrchen auf einen Thermocycler-Satz ein, indem Sie die Parameter für die Gewebelyse, Inaktivierung und das Halten programmieren. Lagern Sie das Gewebelysat bei vier Grad Celsius bis zu einer Woche, wenn die PCR nicht sofort durchgeführt werden kann.Bereiten Sie eine PCR-Lösung vor, die fünf Mikroliter nukleasefreies Wasser, 0,75 Mikroliter 10-Mikromolare Vorwärts- und Rückwärtsprimer und 7,5 Mikroliter PCR-Master-Mix pro Probe zu einem neuen PCR-Röhrchen enthält. Geben Sie einen Mikroliter des zuvor hergestellten Gewebelysats in die PCR-Lösung. Mischen Sie die PCR-Lösung gut und drehen Sie sie mit einer Tisch-Minizentrifuge bei 2.200 mal G für 10 Sekunden bei Raumtemperatur herunter.Stellen Sie die Rohre auf einen programmierten Thermocycler. Sobald die Reaktion abgeschlossen ist, lagern Sie die PCR-Produkte bei vier Grad Celsius für ein bis zwei Monate oder etwa ein Jahr bei minus 20 Grad Celsius. Bereiten Sie die Enzymlösung vor, die sieben Mikroliter nukleasefreies Wasser, zwei Mikroliter CutSmart-Puffer mit 10-facher Stärke und einen Mikroliter NlaIII-Restriktionsenzym enthält.Wenn es mehrere Proben gibt, multiplizieren Sie jeden Inhalt zu der Mischung und aliquot 10 Mikroliter pro Röhrchen. Fügen Sie 10 Mikroliter PCR-Produkt, das zuvor erhalten wurde, der Enzymlösung pro Röhrchen hinzu. Gut mischen und mit der Tisch-Minizentrifuge nach unten drehen, wie zuvor gezeigt.Stellen Sie die Rohre auf einen programmierten Thermocycler oder Wärmeblock ein. Lagern Sie das Produkt nach der Inkubation unter kalten Bedingungen. Fügen Sie 0,75 Gramm Agarose in 50 Milliliter eindichten TAE-Puffer hinzu.Rühren und erhitzen Sie die Agarose in der Mikrowelle, bis sie sich vollständig auflöst. Nach dem Abkühlen fünf Mikroliter DNA-Flecken hinzufügen und vorsichtig mischen. Gießen Sie 25 Milliliter des Agarosegels in die Gelform und lassen Sie das Gel erstarren.Laden Sie 10 Mikroliter verdautes PCR-Produkt in die Vertiefung. Lassen Sie das Gel mit 100 Volt für 35 Minuten laufen. Stellen Sie sich das Agarosegel unter ultraviolettem Licht vor.Die Agaroseelektrophorese, die mit dem verdauten PCR-Produkt durchgeführt wurde, führte zu mehreren Banden unterschiedlicher Größe in jedem Genotyp, mit zwei Banden im Wildtyp, drei in Heterozygoten und einer bei Homozygoten. Die Testinjektion mit Blastozystenanalyse führte zu einer Erfolgsquote von 76,9% bei der Injektion von 50 Nanogramm pro Mikroliter der Spenderoligos und einer Erfolgsrate von 25% bei der Injektion von 25 Nanogramm pro Mikroliter derselben Spenderoligos. Schließlich wurden durch die Injektion von 50 Nanogramm pro Mikroliter der Spenderoligos mit Ethanolfällung Grundtiere mit einer Erfolgsquote von 50% erzielt.Die Reinigung von Oligospendern durch Ethanolfällung senkte die Toxizität und behielt gleichzeitig eine hohe Effizienz bei der Genombearbeitung bei. Eine sorgfältige Handhabung und die Zugabe einer geringen Menge an Reagenzien ist sehr wichtig. Stellen Sie sicher, dass sie korrekt hinzugefügt und gut gemischt werden.

Research

JoVE Journal

Biology

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

Die Herstellung von primären hämatopoetischen Zellkulturen aus Knochenmark der Maus für die Elektroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Forschung

Biologie

Homemade Site Directed Mutagenesis of Whole Plasmids

Hausgemachte Mutagenese von Whole Plasmide

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Färbung von Proteinen in Gelen mit Coomassie G-250 ohne organische Lösungsmittel und Essigsäure

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

Verwendung eines automatisierten Cell Counter zu Genexpressionsstudien Simplify: siRNA Knockdown von IL-4 abhängige Genexpression in Namalwalzellen

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins

GST-His-Reinigung: Ein Zwei-Schritt-Affinitätsreinigung Protokoll Nachgeben in voller Länge Gereinigte Proteine

Key assays in enzymology for the biochemical characterization of proteins in vitro necessitate high concentrations of the purified protein of interest. ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Bäckerhefe Protein Extraktion und Reinigung für das Studium der Funktion, Wechselwirkungen, und post-translationale Modifikationen

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Bezeichnung des Post-translationale Modifikationen von Pflanzenproteinkomplexe

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

siRNA Screening zu Ubiquitin und Ubiquitin-ähnlichen System Regler der biologischen Stoffwechselwege in kultivierten Säugerzellen identifizieren

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

In vitro Synthese von modifizierten mRNA zur Induktion der Proteinexpression in menschlichen Zellen

The exogenous delivery of coding synthetic messenger RNA (mRNA) for induction of protein synthesis in desired cells has enormous potential in the fields ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-basierte Screening Expression von Membranproteinen in<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...