Name: removal of an internal translational start site from mrna while retaining expression of the full-length protein
Uploaded: 2022-03-16T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Removal of an Internal Translational Start Site from mRNA While Retaining Expression of the Full-Length Protein at JoVE.com

הפרויקט נתמך על ידי מכונים לאומיים של מענקי בריאות (R01HL152691, R01HL138577, ו R01HL159983) ל RMS.

כל פרוטוקולי הטיפול והלימוד בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדות המוסדיות לטיפול בבעלי חיים ולשימוש במרכז הרפואי סידרס-סיני ובאוניברסיטת יוטה. עכברות C57BL/6J שהתקבלו ממקורות מסחריים בגיל 8-9 שבועות (ראו טבלת חומרים) שימשו לניסויים.
1. הכנה למיקוד גנים
<ol><li>בחר את ?...

<ol>
	<li>Smyth, J. W., Shaw, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoregulation+of+connexin43+gap+junction+formation+by+internally+translated+isoforms.">Autoregulation of connexin43 gap junction formation by internally translated isoforms.</a> Cell Reports. 5 (3), 611-618 (2013).</li><li>Basheer, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GJA1-20k+arranges+actin+to+guide+Cx43+delivery+to+cardiac+intercalated+discs.">GJA1-20k arranges actin to guide Cx43 delivery to cardiac intercalated discs.</a> Circulation Research. 121 (9), 1069-1080 (2017).</li><li>Fu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cx43+isoform+GJA1-20k+promotes+microtubule+dependent+mitochondrial+transport.">Cx43 isoform GJA1-20k promotes microtubule dependent mitochondrial transport.</a> Frontiers in Physiology. 8, 905 (2017).</li><li>Xiao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auxiliary+trafficking+subunit+GJA1-20k+protects+connexin-43+from+degradation+and+limits+ventricular+arrhythmias.">Auxiliary trafficking subunit GJA1-20k protects connexin-43 from degradation and limits ventricular arrhythmias.</a> Journal of Clinical Investigation. 130 (9), 4858-4870 (2020).</li><li>Syvanen, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+gels+to+chips:+&amp;#34;minisequencing&amp;#34;+primer+extension+for+analysis+of+point+mutations+and+single+nucleotide+polymorphisms.">From gels to chips: &amp;#34;minisequencing&amp;#34; primer extension for analysis of point mutations and single nucleotide polymorphisms.</a> Human Mutation. 13 (1), 1-10 (1999).</li><li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+SNP+discovery+in+tetraploid+alfalfa+using+454+sequencing+and+high+resolution+melting+analysis.">Genome-wide SNP discovery in tetraploid alfalfa using 454 sequencing and high resolution melting analysis.</a> BMC Genomics. 12, 1-11 (2011).</li><li>Han, Y., Khu, D. M., Monteros, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+melting+analysis+for+SNP+genotyping+and+mapping+in+tetraploid+alfalfa+(Medicago+sativa+L.).">High-resolution melting analysis for SNP genotyping and mapping in tetraploid alfalfa (Medicago sativa L.).</a> Molecular Breeding. 29 (2), 489-501 (2012).</li><li>Peng, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+and+quick+PCR-based+method+to+genotype+mice+with+a+leptin+receptor+mutation+(db/db+mice).">A novel and quick PCR-based method to genotype mice with a leptin receptor mutation (db/db mice).</a> Acta Pharmacologica Sinica. 39 (1), 117-123 (2018).</li><li>Haeussler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+off-target+and+on-target+scoring+algorithms+and+integration+into+the+guide+RNA+selection+tool+CRISPOR.">Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR.</a> Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).</li><li>Concordet, J. P., Haeussler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPOR:+Intuitive+guide+selection+for+CRISPR/Cas9+genome+editing+experiments+and+screens.">CRISPOR: Intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens.</a> Nucleic Acids Research. 46 (1), 242-245 (2018).</li><li>Hsu, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+targeting+specificity+of+RNA-guided+Cas9+nucleases.">DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.</a> Nature Biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>Paquet, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+introduction+of+specific+homozygous+and+heterozygous+mutations+using+CRISPR/Cas9.">Efficient introduction of specific homozygous and heterozygous mutations using CRISPR/Cas9.</a> Nature. 533 (7601), 125-129 (2016).</li><li>Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , (2014).</li><li>Pomp, D., Critser, E. S., Rutledge, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lower+sodium+lactate+in+Whitten's+medium+improves+in+vitro+developmental+capacity+of+one-cell+mouse+embryos.">Lower sodium lactate in Whitten's medium improves in vitro developmental capacity of one-cell mouse embryos.</a> Theriogenology. 29 (5), 1019-1025 (1988).</li><li>Summers, M. C., McGinnis, L. K., Lawitts, J. A., Raffin, M., Biggers, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IVF+of+mouse+ova+in+a+simplex+optimized+medium+supplemented+with+amino+acids.">IVF of mouse ova in a simplex optimized medium supplemented with amino acids.</a> Human Reproduction. 15 (8), 1791-1801 (2000).</li><li>Green, M. R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition). , (2012).</li><li>Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Huang, Z., Harata, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+genotyping+of+animals+followed+by+establishing+primary+cultures+of+brain+neurons.">Rapid genotyping of animals followed by establishing primary cultures of brain neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. 95. (95), e51879 (2015).</li><li>Iyer, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=No+unexpected+CRISPR-Cas9+off-target+activity+revealed+by+trio+sequencing+of+gene-edited+mice.">No unexpected CRISPR-Cas9 off-target activity revealed by trio sequencing of gene-edited mice.</a> PLoS Genetics. 14 (7), 1007503 (2018).</li><li>Nature Medicine. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keep+off-target+effects+in+focus.">Keep off-target effects in focus.</a> Nature Medicine. 24 (8), 1081 (2018).</li><li>Mayer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+EcoRI-activity+of+EcoRI+endonuclease.">Optimization of the EcoRI-activity of EcoRI endonuclease.</a> FEBS Letters. 90 (2), 341-344 (1978).</li><li>Kozak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Point+mutations+close+to+the+AUG+initiator+codon+affect+the+efficiency+of+translation+of+rat+preproinsulin+in+vivo.">Point mutations close to the AUG initiator codon affect the efficiency of translation of rat preproinsulin in vivo.</a> Nature. 308 (5956), 241-246 (1984).</li><li>Kozak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Point+mutations+define+a+sequence+flanking+the+AUG+initiator+codon+that+modulates+translation+by+eukaryotic+ribosomes.">Point mutations define a sequence flanking the AUG initiator codon that modulates translation by eukaryotic ribosomes.</a> Cell. 44 (2), 283-292 (1986).</li><li>Basheer, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+response+protein+GJA1-20k+promotes+mitochondrial+biogenesis,+metabolic+quiescence,+and+cardioprotection+against+ischemia/reperfusion+injury.">Stress response protein GJA1-20k promotes mitochondrial biogenesis, metabolic quiescence, and cardioprotection against ischemia/reperfusion injury.</a> JCI Insight. 3 (20), 121900 (2018).</li><li>Shimura, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+mitochondrial+fission+induced+by+stress-responsive+protein+GJA1-20k.">Protective mitochondrial fission induced by stress-responsive protein GJA1-20k.</a> Elife. 10, 69207 (2021).</li></ol>

מודל עכבר שעבר שינוי גנים הוא גישה נפוצה להבנת תפקוד הגנים. עם זאת, מאז GJA1-20k בתרגום פנימי איזופורם מתורגם מאותו Gja1 mRNA כמו Cx43 באורך מלא, אסטרטגיה יצירתית הומצאה כדי לשמור על ביטוי Cx43 באורך מלא עדיין לדכא ביטוי GJA1-20k. הגישה מבוססת על מוטציה של קודון ההתחלה הפנימי של GJA1-20k. עם מוטציה של נקוד?...

קונקסין 43 (Cx43) באורך מלא ואיזופורם טרמינל N-terminus, GJA1-20k, מקודד על ידי אותו GJA1 mRNA אך משתמשים בקודוני התחלה שונים1 כדי ליזום תרגום. תרגום Cx43 מתרחש בקודון ההתחלה הראשון של AUG, בעוד שתרגום GJA1-20k יוזם ב- AUG בשאריות 213. בעבר נמצא כי GJA1-20k יש תפקידים חיוניים עבור סחר Cx43 באורך מלא, ייצוב actin, ורגולציה של מורפולוגיה מיטוכונדריאלית במבחנה 1,2,3.
כדי להבין את התפקיד של GJA1-20k ב vivo, GJA1-20k "לדפוק החוצה" מודל העכבר נוצר ששומר על היכולת ליצור Cx43 באורך מלא. הגישה הייתה להשתמש במערכת CRISPR-Cas9 כדי להחליף את השאריות הבודדות ב-213 ממתיונין (ז) ללאוצין (L) (Gja1M213L/M213L)4. מוטציה פנימית M ל- L מקטינה באופן דרמטי את הסבירות לתרגום פנימי המתרחש אך שומרת על התרגום והתפקוד של חלבון באורך מלא4. מכיוון שלסוג הפראי (WT) ולאלל שעבר מוטציה יש גדלים זהים ומוצרי mRNA כמעט זהים, קיים קושי ניכר באישור גנוטיפ בעכברים. ריצוף דנ"א יכול לזהות את המוטציה, אך הוא יקר מדי וגוזל זמן רב מדי לשימוש שגרתי. באופן כללי, הוקמו מספר שיטות גנוטיפינג מהיר יותר, כגון תגובת שרשרת פולימראז בזמן אמת (RT-PCR), מיני-קשירה-קשירה, ניתוח היתוך ברזולוציה גבוהה, ומערכת מוטציה עקשן הגברה טטרה-פריימר PCR (נשק-PCR)5,6,7,8. עם זאת, שיטות חלופיות אלה דורשות שלבים מרובים, משאבים ייחודיים ו/או מספר ערכות פריימר ספציפיות אשר יכולות לגרום למוצרי PCR שאינם ספציפיים.
פרוטוקול זה מציג גישה מפורטת של פילוח ועריכה של גנים על ידי CRISPR-Cas9 כדי ליצור מוטציה אחת בחומצת אמינו, וגנוטיפינג מהיר מוצג כדי לאשר את המוטציה. זיהוי גנוטיפ כרוך בשימוש יצירתי באנזימי הגבלה המשתמשים רק בערכה אחת של פריימרים כדי לזהות את גן היעד. הקוראים מופנים Reference4 כדי לבחון את ההשפעה האלקטרופיזיולוגית העמוקה של מוות לבבי פתאומי הנגרמת על ידי שאריות אחת Gja1M213L / M213L מוטציה החלפת אשר עדיין מייצר חלבון באורך מלא עדיין לא מצליח לייצר איזופורם חיתוך קטן יותר מתורגם פנימית. פרוטוקול זה יסייע להפוך מודלים עכברים אחרים להשתמש מוטציה נקודתית כדי להקטין את התרגום הפנימי של איזופורם של עניין תוך שמירה על הביטוי של חלבון אנדוגני באורך מלא.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL 8-Strip PCR tube</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1148A28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-038</td>
			<td>For pronuclear micorinjection buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x CutSmart buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7204S</td>
			<td>Digestion buffer for NlaIII</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Tris-HCl pH 7.5</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15567-027</td>
			<td>For pronuclear micorinjection buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50x TAE Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>24710-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Thermal cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>Model # 9902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>664</td>
			<td>mouse strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemidoc MP imaging system</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td>To take gel image by 302 nm UV light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eSpCas9 protein</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>ESPCAS9PRO-50UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Lading Dye Purple (6x)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7024S</td>
			<td>Loading buffer for electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gloves</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hCG (human chorionic gonadotropin)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>23-073-425G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>H3884-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Lab software</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td>To analyze gel image</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted stereo microscope whit plasDIC</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axiovert A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA Mouse Genotyping Kits</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>KK7352</td>
			<td>For tissue or cell lysis, DNA extraction, and PCR master mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KSOM</td>
			<td>LifeGlobal</td>
			<td>ZEKS-050</td>
			<td>embryo culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab coart</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M2 medium</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>MR015D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NlaIII</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0125S</td>
			<td>To digest PCR product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9937</td>
			<td>To dilute reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin oil</td>
			<td>Nacalai USA</td>
			<td>2613785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plugged 20 &#956;L fine pipette tip</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>02-707-171</td>
			<td>To pick up blastocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSG (pregnant mare&#8217;s serum gonadotropin)</td>
			<td>ProSpec-Tany</td>
			<td>HOR-272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9760G</td>
			<td>For pronuclear micorinjection buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR safe DNA Gel Stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S33102</td>
			<td>To detect bands in gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tracrRNA</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>U-002000-120</td>
			<td>Guid RNA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

removal of an internal translational start site from mrna while retaining expression of the full-length protein

מערכת עריכת הגנים CRISPR-Cas9, המבוססת על מנגנוני תיקון גנום, מאפשרת ליצור מודלים של עכברים שעברו שינוי גנטי במהירות ובקלות רבה יותר ביחס לשילוב ההומולוגי המסורתי. מערכת CRISPR-Cas9 אטרקטיבית במיוחד כאשר נדרשת מוטציה של נקודה אחת. חלבון צומת הפערים, Connexin 43 (Cx43), מקודד על ידי הגן Gja1, שיש לו אקסון קידוד יחיד ולא ניתן לחבר אותו. עם זאת, Gja1 מייצר לא רק חלבון Cx43 באורך מלא אלא עד שישה איזופורמים חתוכים N-טרמינוס על ידי תהליך המכונה תרגום פנימי, תוצאה של חניכת תרגום ריבוזומלי באתרי התחלה פנימיים AUG (מתיונין). GJA1-20k הוא האיזופורם החתוך הנפוץ ביותר שנוצר של Cx43 שיזם בקודון AUG במיקום 213 של Gja1 mRNA. מכיוון שאריות 213 מתרחשת בסוף תחום transmembrane האחרון של Cx43, GJA1-20k הוא למעשה זנב 20 kDa C-terminus של Cx43 כחלבון עצמאי. חוקרים קודמים זיהו, בתאים, כי תפקיד קריטי של GJA1-20k הוא להקל על סחר של hemichannels צומת פער Cx43 באורך מלא לקרום הפלזמה. כדי לבחון תופעה זו ב- vivo, נוצר עכבר מוטנטי עם מוטציה נקודתית Gja1 המחליף את ה- ATG (מתיונין) בשאריות 213 עם TTA (לאוצין, מוטציה M213L). התוצאה של M213L היא כי Gja1 mRNA ו Cx43 באורך מלא עדיין נוצרים, עדיין התרגום של Gja1-20k מופחת באופן משמעותי. דו"ח זה מתמקד בבחירת אתר אנזימי ההגבלה לפתח מודל עכבר מוטציה אחת של חומצת אמינו (Gja1M213L/M213L). פרוטוקול זה מתאר עכברים מהונדסים גנטית על ידי מערכת CRISPR-Cas9 וגנוטיפינג מהיר על ידי שילוב של PCR וטיפולי אנזימי הגבלה.

מערכת עריכת הגנים CRISPR/Cas9 מייצרת מוטציה ATG ל- TTA ומוטציה שקטה של TCC ל- TCG ב-56,264,279 עד 56,264,281 וב-56,264,291 עד 56,264,293 בכרומוזום עכבר 10, או ב-869 עד 871 ו-881 עד 883 ב-Gja1 mRNA, בהתאמה. מוטציה זו גורמת למוטציה של מתיונין 213 עד לאוצין (M213L) בחלבון GJA1 והמוטציה TTC ל- TTG משבשת רצף PAM סמוך כדי להימנע ממהדורת גנים לא רצויה (<strong cl...

Watch this Scientific Journal Video about Removal of an Internal Translational Start Site from mRNA While Retaining Expression of the Full-Length Protein at JoVE.com

Removal of an Internal Translational Start Site from mRNA While Retaining Expression of the Full-Length Protein

הפרוטוקול הנוכחי מתאר מוטציה אחת M213L ב- Gja1 השומרת על דור Connexin43 באורך מלא אך מונעת תרגום של איזופורם קטן יותר של GJA1-20k שתורגם באופן פנימי.

הסרת אתר התחלה תרגומי פנימי מ- mRNA תוך שמירה על הביטוי של חלבון באורך מלא

The CRISPR-Cas9 gene-editing system, based on genome repair mechanisms, enables the generation of gene-modified mouse models more quickly and easily ...

הקושי בהחלפת שאריות בודדות הוא לגנוטיזציה יעילה של בעלי חיים למרות ההבדל בשאריות בודדות. שימוש מיוחד באנזים הגבלה מוסיף רק שלב אחד, מהיר ובעלות נמוכה לגנוטיפינג טיפוסי המבוסס על PCR. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על כל מודל עכבר אחר עם נקודת מוטציה אם רצף היעד מזוהה על ידי אנזים הגבלה, וזה בדרך כלל המקרה.חותכים 1 עד 3 מילימטרים של קצה הזנב עם מספריים נקיים ולהעביר אותו לצינור PCR שמונה רצועות 0.2 מיליליטר. לאחר שהכיל את דגימת הזנב כמתואר בכתב היד, לאחסן אותו ב T-מינוס 20 מעלות צלזיוס עד החילוץ, עד כשבוע. הוסף 100 מיקרוליטרים של תמיסת תמיסת רקמות לכל צינור וערבוב היטב, ואחריו ספין למטה באמצעות minicentrifuge שולחן ב 2, 200 פעמים G במשך 10 שניות בטמפרטורת החדר.ודא שדגימות הזנב שקועות בפתרון. הגדר את הצינורות על מחזור תרמי להגדיר על ידי תכנות הפרמטרים עבור תמוגה רקמות, השבתה, והחזקה. לאחסן את lysate הרקמה בארבע מעלות צלזיוס עד שבוע אם PCR לא ניתן לבצע באופן מיידי.הכינו פתרון PCR המכיל חמישה מיקרוליטרים של מים נטולי נוקלאז, 0.75 מיקרוליטרים של פריימרים קדמיים והפוך של 10 מיקרומולרים, ו-7.5 מיקרוליטרים של תערובת ראשית PCR לדגימה לצינור PCR חדש. הוסף מיקרוליטר אחד של ליסאט הרקמה שהוכן בעבר לתמיסת ה- PCR. ערבבו היטב את תמיסת ה-PCR והסתובבו עם מיני-צנטריפוגה עם שולחן ב-2, 200 פעמים G למשך 10 שניות בטמפרטורת החדר.הגדר את הצינורות על רוכב אופניים תרמי מתוכנת. לאחר השלמת התגובה, לאחסן את מוצרי PCR בארבע מעלות צלזיוס במשך חודש עד חודשיים או כשנה אחת במינוס 20 מעלות צלזיוס. הכינו את תמיסת האנזים המכילה שבעה מיקרוליטרים של מים נטולי נוקלאז, שני מיקרוליטרים של מאגר CutSmart בעוצמה של פי 10, ומיקרוליטר אחד של אנזים הגבלת NlaIII.אם יש כמה דוגמאות, להכפיל כל תוכן כדי להפוך את התערובת aliquot 10 microliters לכל צינור. הוסף 10 מיקרוליטרים של מוצר PCR שהושג בעבר לתמיסת האנזים לכל צינור. מערבבים היטב ומסתובבים עם המיני-צנטריפוגה של השולחן כפי שהוכח בעבר.הגדר את הצינורות על רוכב אופניים תרמי מתוכנת או בלוק חום. יש לאחסן את המוצר לאחר הדגירה בתנאי קור. הוסף 0.75 גרם של agarose ב 50 מיליליטר של חיץ TAE חד-כוח.מערבבים ומחממים את האגרוז במיקרוגל עד שהוא מתמוסס לחלוטין. לאחר קירורו, הוסיפו חמישה מיקרוליטרים של כתם DNA וערבבו בעדינות. יוצקים 25 מיליליטר של ג'ל agarose לתוך תבנית הג'ל ולאפשר את הג'ל להתמצק.טען 10 מיקרוליטרים של מוצר PCR מעוכל לבאר. הפעל את הג'ל עם 100 וולט במשך 35 דקות. דמיינו את ג'ל האגרוז תחת אור אולטרה סגול.האלקטרופורזה האגרוזית שבוצעה באמצעות מוצר ה- PCR המעוכל הביאה למספר להקות בגדלים שונים בכל גנוטיפ, עם שתי להקות בסוג פראי, שלוש בהטרוזיגוס ואחת בהומוזיגוס, בהתאמה. הזרקת בדיקה עם ניתוח בלסטוציסט הביאה לשיעור הצלחה של 76.9% בהזרקת 50 ננוגרם למיקרוליטר של אוליגוס התורם, ושיעור הצלחה של 25% בהזרקת 25 ננוגרם למיקרוליטר של אותו אוליגוס תורם, בהתאמה. לבסוף, הזרקת 50 ננוגרם לכל מיקרוליטר של אוליגוס התורם עם משקעים אתנול השיג בעלי חיים מייסדים עם 50% הצלחה.טיהור תורמי אוליגו על ידי משקעים אתנול הוריד את הרעילות תוך שמירה על יעילות עריכת גנום גבוהה. טיפול זהיר והוספת כמות נמוכה של ריאגנטים חשוב מאוד. ודא שהם מתווספים כראוי ומעורבים היטב.

Research

JoVE Journal

Biology

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

הכנת ראשי בתרביות תאים hematopoietic ממח העצם Murine עבור electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Homemade Site Directed Mutagenesis of Whole Plasmids

Mutagenesis האתר ביתי בימוי של פלסמידים שלמים

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

הכתמה של חלבונים עם ג&#39;ל Coomassie G-250 ללא חומצה אצטית ממס אורגני

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

שימוש מונה תא אוטומטי כדי לפשט את הביטוי מחקרים ג&#39;ין: siRNA מציאה הביטוי IL 4-Gene תלויים תאים Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins

GST-טיהור: שני שלבי זיקה טיהור פרוטוקול מניב חלבונים מטוהרים באורך מלא

Key assays in enzymology for the biochemical characterization of proteins in vitro necessitate high concentrations of the purified protein of interest. ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

הפקת ניצני שמרים וטיהור חלבון לחקר תפקוד, האינטראקציות, ולאחר translational השינויים

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

זיהוי לאחר translational השינויים של קומפלקסי חלבוני צמח

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

הקרנת siRNA לזיהוי יוביקוויטין ורגולטורים מערכת דמויות יוביקוויטין של מסלולים ביולוגיים בתאי יונקים בתרבית

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

במבחנת הסינתזה של mRNA השתנה לאינדוקציה של ביטוי חלבון בתאים אנושיים

The exogenous delivery of coding synthetic messenger RNA (mRNA) for induction of protein synthesis in desired cells has enormous potential in the fields ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

הקרנה ירוקה פלורסנט מבוסס חלבון ביטוי של החלבונים ממברנה ב<em&gt; Coli Escherichia</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...