Name: removal of an internal translational start site from mrna while retaining expression of the full-length protein
Uploaded: 2022-03-16T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Removal of an Internal Translational Start Site from mRNA While Retaining Expression of the Full-Length Protein at JoVE.com

Il progetto è stato sostenuto da sovvenzioni del National Institutes of Health (R01HL152691, R01HL138577 e R01HL159983) a RMS.

"Tutti i protocolli di cura e studio degli animali sono stati approvati dai comitati istituzionali per la cura e l'uso degli animali del Cedars-Sinai Medical Center e dell'Università dello Utah. Per gli esperimenti sono stati utilizzati topi femmina C57BL/6J ottenuti da fonti commerciali a 8-9 settimane di età (vedi Tabella dei materiali).
1. Preparazione per il targeting genico
<ol><li>Selezionare la sequenza bersaglio guida attorno al sito di mutazione b...

<ol>
	<li>Smyth, J. W., Shaw, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoregulation+of+connexin43+gap+junction+formation+by+internally+translated+isoforms.">Autoregulation of connexin43 gap junction formation by internally translated isoforms.</a> Cell Reports. 5 (3), 611-618 (2013).</li><li>Basheer, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GJA1-20k+arranges+actin+to+guide+Cx43+delivery+to+cardiac+intercalated+discs.">GJA1-20k arranges actin to guide Cx43 delivery to cardiac intercalated discs.</a> Circulation Research. 121 (9), 1069-1080 (2017).</li><li>Fu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cx43+isoform+GJA1-20k+promotes+microtubule+dependent+mitochondrial+transport.">Cx43 isoform GJA1-20k promotes microtubule dependent mitochondrial transport.</a> Frontiers in Physiology. 8, 905 (2017).</li><li>Xiao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auxiliary+trafficking+subunit+GJA1-20k+protects+connexin-43+from+degradation+and+limits+ventricular+arrhythmias.">Auxiliary trafficking subunit GJA1-20k protects connexin-43 from degradation and limits ventricular arrhythmias.</a> Journal of Clinical Investigation. 130 (9), 4858-4870 (2020).</li><li>Syvanen, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+gels+to+chips:+&amp;#34;minisequencing&amp;#34;+primer+extension+for+analysis+of+point+mutations+and+single+nucleotide+polymorphisms.">From gels to chips: &amp;#34;minisequencing&amp;#34; primer extension for analysis of point mutations and single nucleotide polymorphisms.</a> Human Mutation. 13 (1), 1-10 (1999).</li><li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+SNP+discovery+in+tetraploid+alfalfa+using+454+sequencing+and+high+resolution+melting+analysis.">Genome-wide SNP discovery in tetraploid alfalfa using 454 sequencing and high resolution melting analysis.</a> BMC Genomics. 12, 1-11 (2011).</li><li>Han, Y., Khu, D. M., Monteros, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+melting+analysis+for+SNP+genotyping+and+mapping+in+tetraploid+alfalfa+(Medicago+sativa+L.).">High-resolution melting analysis for SNP genotyping and mapping in tetraploid alfalfa (Medicago sativa L.).</a> Molecular Breeding. 29 (2), 489-501 (2012).</li><li>Peng, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+and+quick+PCR-based+method+to+genotype+mice+with+a+leptin+receptor+mutation+(db/db+mice).">A novel and quick PCR-based method to genotype mice with a leptin receptor mutation (db/db mice).</a> Acta Pharmacologica Sinica. 39 (1), 117-123 (2018).</li><li>Haeussler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+off-target+and+on-target+scoring+algorithms+and+integration+into+the+guide+RNA+selection+tool+CRISPOR.">Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR.</a> Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).</li><li>Concordet, J. P., Haeussler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPOR:+Intuitive+guide+selection+for+CRISPR/Cas9+genome+editing+experiments+and+screens.">CRISPOR: Intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens.</a> Nucleic Acids Research. 46 (1), 242-245 (2018).</li><li>Hsu, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+targeting+specificity+of+RNA-guided+Cas9+nucleases.">DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.</a> Nature Biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>Paquet, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+introduction+of+specific+homozygous+and+heterozygous+mutations+using+CRISPR/Cas9.">Efficient introduction of specific homozygous and heterozygous mutations using CRISPR/Cas9.</a> Nature. 533 (7601), 125-129 (2016).</li><li>Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , (2014).</li><li>Pomp, D., Critser, E. S., Rutledge, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lower+sodium+lactate+in+Whitten's+medium+improves+in+vitro+developmental+capacity+of+one-cell+mouse+embryos.">Lower sodium lactate in Whitten's medium improves in vitro developmental capacity of one-cell mouse embryos.</a> Theriogenology. 29 (5), 1019-1025 (1988).</li><li>Summers, M. C., McGinnis, L. K., Lawitts, J. A., Raffin, M., Biggers, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IVF+of+mouse+ova+in+a+simplex+optimized+medium+supplemented+with+amino+acids.">IVF of mouse ova in a simplex optimized medium supplemented with amino acids.</a> Human Reproduction. 15 (8), 1791-1801 (2000).</li><li>Green, M. R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition). , (2012).</li><li>Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Huang, Z., Harata, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+genotyping+of+animals+followed+by+establishing+primary+cultures+of+brain+neurons.">Rapid genotyping of animals followed by establishing primary cultures of brain neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. 95. (95), e51879 (2015).</li><li>Iyer, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=No+unexpected+CRISPR-Cas9+off-target+activity+revealed+by+trio+sequencing+of+gene-edited+mice.">No unexpected CRISPR-Cas9 off-target activity revealed by trio sequencing of gene-edited mice.</a> PLoS Genetics. 14 (7), 1007503 (2018).</li><li>Nature Medicine. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keep+off-target+effects+in+focus.">Keep off-target effects in focus.</a> Nature Medicine. 24 (8), 1081 (2018).</li><li>Mayer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+EcoRI-activity+of+EcoRI+endonuclease.">Optimization of the EcoRI-activity of EcoRI endonuclease.</a> FEBS Letters. 90 (2), 341-344 (1978).</li><li>Kozak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Point+mutations+close+to+the+AUG+initiator+codon+affect+the+efficiency+of+translation+of+rat+preproinsulin+in+vivo.">Point mutations close to the AUG initiator codon affect the efficiency of translation of rat preproinsulin in vivo.</a> Nature. 308 (5956), 241-246 (1984).</li><li>Kozak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Point+mutations+define+a+sequence+flanking+the+AUG+initiator+codon+that+modulates+translation+by+eukaryotic+ribosomes.">Point mutations define a sequence flanking the AUG initiator codon that modulates translation by eukaryotic ribosomes.</a> Cell. 44 (2), 283-292 (1986).</li><li>Basheer, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+response+protein+GJA1-20k+promotes+mitochondrial+biogenesis,+metabolic+quiescence,+and+cardioprotection+against+ischemia/reperfusion+injury.">Stress response protein GJA1-20k promotes mitochondrial biogenesis, metabolic quiescence, and cardioprotection against ischemia/reperfusion injury.</a> JCI Insight. 3 (20), 121900 (2018).</li><li>Shimura, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+mitochondrial+fission+induced+by+stress-responsive+protein+GJA1-20k.">Protective mitochondrial fission induced by stress-responsive protein GJA1-20k.</a> Elife. 10, 69207 (2021).</li></ol>

Un modello murino geneticamente modificato è un approccio comune per comprendere la funzione genica. Tuttavia, poiché l'isoforma tradotta internamente GJA1-20k viene tradotta dallo stesso mRNA Gja1 del Cx43 a lunghezza intera, è stata ideata una strategia creativa per mantenere l'espressione Cx43 a lunghezza intera ma sopprimere l'espressione GJA1-20k. L'approccio si basa su una mutazione del codone di partenza interno di GJA1-20k. Con una singola mutazione puntiforme, M213 è stato commutato in L sull'mRNA <...

Il Connexin 43 (Cx43) a lunghezza intera e l'isoforma troncata N-terminus, GJA1-20k, codificati dallo stesso mRNA GJA1 ma utilizzano codoni di avvio diversi1 per avviare la traduzione. La traduzione Cx43 avviene al primo codone di avvio AUG, mentre la traduzione GJA1-20k inizia all'AUG al residuo 213. In precedenza è stato scoperto che GJA1-20k ha ruoli essenziali per il traffico di Cx43 a figura intera, la stabilizzazione dell'actina e la regolazione della morfologia mitocondriale in vitro 1,2,3.
Per comprendere il ruolo di GJA1-20k in vivo, è stato generato un modello murino "knock-out" GJA1-20k che ha mantenuto la capacità di creare Cx43 a figura intera. L'approccio è stato quello di utilizzare il sistema CRISPR-Cas9 per sostituire il singolo residuo a 213 da una metionina (M) a una leucina (L) (Gja1M213L/M213L)4. Una mutazione interna da M a L riduce drasticamente la probabilità che si verifichi una traduzione interna, ma mantiene la traduzione e la funzione della proteina4 a lunghezza intera. Poiché il tipo selvatico (WT) e l'allele mutato hanno dimensioni identiche e prodotti a mRNA quasi identici, vi è una notevole difficoltà nel confermare il genotipo nei topi. Il sequenziamento del DNA può identificare la mutazione, ma è troppo costoso e richiede tempo per l'uso di routine. In generale, sono stati stabiliti diversi metodi di genotipizzazione più rapida, come la reazione a catena della polimerasi in tempo reale (RT-PCR), la legatura minisequenziale, l'analisi della fusione ad alta risoluzione e il sistema di mutazione refrattaria amplificazione tetra-primer PCR (ARMS-PCR)5,6,7,8. Tuttavia, questi metodi alternativi richiedono più passaggi, risorse uniche e / o diversi set di primer specifici che possono indurre prodotti PCR non specifici.
Questo protocollo introduce un approccio dettagliato di targeting ed editing genico da parte di CRISPR-Cas9 per creare una singola mutazione di amminoacidi e viene presentata una rapida genotipizzazione per confermare la mutazione. L'identificazione del genotipo comporta l'uso creativo di enzimi di restrizione che utilizzano solo un singolo set di primer per identificare il gene bersaglio. I lettori sono indirizzati al riferimento4 per osservare il profondo effetto elettrofisiologico della morte cardiaca improvvisa causata da una mutazione di sostituzioneGja1 M213L / M213L di un residuo che genera ancora una proteina a lunghezza intera ma non riesce a generare un'isoforma di troncamento tradotta internamente più piccola. Questo protocollo aiuterà altri modelli murini a utilizzare una mutazione puntiforme per ridurre la traduzione interna di un'isoforma di interesse pur mantenendo l'espressione della proteina endogena a lunghezza intera.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL 8-Strip PCR tube</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1148A28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-038</td>
			<td>For pronuclear micorinjection buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x CutSmart buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7204S</td>
			<td>Digestion buffer for NlaIII</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Tris-HCl pH 7.5</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15567-027</td>
			<td>For pronuclear micorinjection buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50x TAE Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>24710-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Thermal cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>Model # 9902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>664</td>
			<td>mouse strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemidoc MP imaging system</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td>To take gel image by 302 nm UV light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eSpCas9 protein</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>ESPCAS9PRO-50UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Lading Dye Purple (6x)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7024S</td>
			<td>Loading buffer for electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gloves</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hCG (human chorionic gonadotropin)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>23-073-425G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>H3884-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Lab software</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td>To analyze gel image</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted stereo microscope whit plasDIC</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axiovert A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA Mouse Genotyping Kits</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>KK7352</td>
			<td>For tissue or cell lysis, DNA extraction, and PCR master mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KSOM</td>
			<td>LifeGlobal</td>
			<td>ZEKS-050</td>
			<td>embryo culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab coart</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M2 medium</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>MR015D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NlaIII</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0125S</td>
			<td>To digest PCR product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9937</td>
			<td>To dilute reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin oil</td>
			<td>Nacalai USA</td>
			<td>2613785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plugged 20 &#956;L fine pipette tip</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>02-707-171</td>
			<td>To pick up blastocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSG (pregnant mare&#8217;s serum gonadotropin)</td>
			<td>ProSpec-Tany</td>
			<td>HOR-272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9760G</td>
			<td>For pronuclear micorinjection buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR safe DNA Gel Stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S33102</td>
			<td>To detect bands in gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tracrRNA</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>U-002000-120</td>
			<td>Guid RNA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

removal of an internal translational start site from mrna while retaining expression of the full-length protein

Il sistema di modifica genetica CRISPR-Cas9, basato su meccanismi di riparazione del genoma, consente la generazione di modelli murini modificati geneticamente più rapidamente e facilmente rispetto alla tradizionale ricombinazione omologa. Il sistema CRISPR-Cas9 è particolarmente interessante quando si desidera una mutazione a punto singolo. La proteina gap junction, Connexin 43 (Cx43), è codificata dal gene Gja1, che ha un singolo esone codificante e non può essere spliced. Tuttavia, Gja1 produce non solo la proteina Cx43 a lunghezza intera, ma fino a sei isoforme troncate N-terminus mediante un processo noto come traduzione interna, il risultato dell'inizio della traduzione ribosomiale nei siti interni di inizio AUG (Metionina). GJA1-20k è l'isoforma troncata più comunemente generata di Cx43 iniziata al codone AUG in posizione 213 dell'mRNA Gja1. Poiché il residuo 213 si verifica alla fine dell'ultimo dominio transmembrana di Cx43, GJA1-20k è effettivamente la coda C-terminus di 20 kDa di Cx43 come proteina indipendente. Precedenti ricercatori hanno identificato, nelle cellule, che un ruolo critico di GJA1-20k è quello di facilitare il traffico di emicanali di giunzione gap Cx43 a tutta lunghezza alla membrana plasmatica. Per esaminare questo fenomeno in vivo, è stato generato un topo mutante con una mutazione puntiforme Gja1 che sostituisce l'ATG (Metionina) al residuo 213 con TTA (Leucina, mutazione M213L). Il risultato di M213L è che l'mRNA Gja1 e il Cx43 a lunghezza intera sono ancora generati, ma la traduzione di Gja1-20k è significativamente ridotta. Questo rapporto si concentra sulla scelta del sito dell'enzima di restrizione per sviluppare un modello murino mutato di un amminoacido (Gja1 M213L / M213L). Questo protocollo descrive topi geneticamente modificati dal sistema CRISPR-Cas9 e la genotipizzazione rapida combinando PCR e trattamenti enzimatici di restrizione.

Il sistema di modifica genetica CRISPR/Cas9 produce una mutazione da ATG a TTA e una mutazione silenziosa da TCC a TCG a 56.264.279 a 56.264.281 e a 56.264.291 a 56.264.293 sul cromosoma 10 del topo, o da 869 a 871 e da 881 a 883 sull'mRNA Gja1, rispettivamente. Questa mutazione si traduce in una mutazione da metionina 213 a leucina (M213L) sulla proteina GJA1 e la mutazione da TTC a TTG interrompe una sequenza PAM vicina per evitare l'edizione indesiderata del gene (Figura 1). I dettagli de...

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Removal of an Internal Translational Start Site from mRNA While Retaining Expression of the Full-Length Protein

Il presente protocollo descrive una singola mutazione M213L in Gja1 che mantiene la generazione di Connexin43 a lunghezza intera ma impedisce la traduzione della più piccola isoforma GJA1-20k tradotta internamente.

Rimozione di un sito di partenza traslazionale interno dall'mRNA pur mantenendo l'espressione della proteina a lunghezza intera

The CRISPR-Cas9 gene-editing system, based on genome repair mechanisms, enables the generation of gene-modified mouse models more quickly and easily ...

La difficoltà con una sostituzione di un singolo residuo consiste nel genotipizzare gli animali in modo efficiente nonostante la differenza di singolo residuo. L'uso speciale di un enzima di restrizione aggiunge solo un singolo passaggio rapido e a basso costo alla tipica genotipizzazione basata sulla PCR. Questo protocollo può essere applicato a qualsiasi altro modello murino con un punto di mutazione se la sequenza target è riconosciuta da un enzima di restrizione, che di solito è il caso.Tagliare da uno a tre millimetri della punta della coda con forbici pulite e trasferirlo in un tubo PCR a otto strisce da 0,2 millilitri. Dopo aver contenuto il campione di coda come descritto nel manoscritto, conservarlo a T-meno 20 gradi Celsius fino all'estrazione, fino a circa una settimana. Aggiungere 100 microlitri di soluzione di lisi tissutale per tubo e mescolare bene, seguito da spin-down utilizzando una minicentrifuga da tavolo a 2.200 volte G per 10 secondi a temperatura ambiente.Assicurarsi che i campioni di coda siano immersi nella soluzione. Impostare i tubi su un set di termociclatori programmando i parametri per la lisi tissutale, l'inattivazione e la tenuta. Conservare il lisato tissutale a quattro gradi Celsius per un massimo di una settimana se la PCR non può essere eseguita immediatamente.Preparare una soluzione PCR contenente cinque microlitri di acqua priva di nucleasi, 0,75 microlitri di primer 10 micromolari avanti e indietro e 7,5 microlitri di miscela master PCR per campione in un nuovo tubo PCR. Aggiungere un microlitro del lisato tissutale precedentemente preparato alla soluzione PCR. Mescolare bene la soluzione PCR e girare verso il basso con una minicentrifuga da tavolo a 2.200 volte G per 10 secondi a temperatura ambiente.Impostare i tubi su un termociclatore programmato. Una volta completata la reazione, conservare i prodotti PCR a quattro gradi Celsius per uno o due mesi o circa un anno a meno 20 gradi Celsius. Preparare la soluzione enzimatica contenente sette microlitri di acqua priva di nucleasi, due microlitri di tampone CutSmart con forza 10X e un microlitro di enzima di restrizione NlaIII.Se ci sono più campioni, moltiplicare ogni contenuto per ottenere la miscela e aliquota 10 microlitri per tubo. Aggiungere 10 microlitri di prodotto PCR precedentemente ottenuti alla soluzione enzimatica per tubo. Mescolare bene e girare verso il basso con la minicentrifuga da tavolo come dimostrato in precedenza.Impostare i tubi su un termociclatore programmato o su un blocco termico. Conservare il prodotto dopo l'incubazione in condizioni di freddo. Aggiungere 0,75 grammi di agarosio in 50 millilitri di tampone TAE monoreduttore.Mescolare e riscaldare l'agarosio nel microonde fino a quando non si dissolve completamente. Dopo averlo raffreddato, aggiungere cinque microlitri di macchia di DNA e mescolare delicatamente. Versare 25 millilitri di gel di agarosio nello stampo gel e lasciare che il gel si solidifichi.Caricare 10 microlitri di prodotto PCR digerito sul pozzo. Eseguire il gel con 100 volt per 35 minuti. Immagine del gel di agarosio sotto la luce ultravioletta.L'elettroforesi dell'agarosio eseguita utilizzando il prodotto PCR digerito ha portato a diverse bande di dimensioni diverse in ciascun genotipo, con due bande in wild type, tre in eterozigote e una in omozigote, rispettivamente. L'iniezione di prova con analisi della blastocisti ha portato a un tasso di successo del 76,9% sull'iniezione di 50 nanogrammi per microlitro degli oligo donatori e un tasso di successo del 25% sull'iniezione di 25 nanogrammi per microlitro degli stessi oligo donatori, rispettivamente. Infine, l'iniezione di 50 nanogrammi per microlitro di oligo donatori con precipitazione di etanolo ha ottenuto animali fondatori con un tasso di successo del 50%.La purificazione degli oligo donatori mediante precipitazione di etanolo ha ridotto la tossicità pur mantenendo un'elevata efficienza di editing del genoma. Un'attenta manipolazione e l'aggiunta di una bassa quantità di reagenti è molto importante. Assicurati che siano aggiunti correttamente e siano mescolati bene.

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La colorazione delle proteine ​​in gel con Coomassie G-250, senza solventi organici acido acetico e

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

L&#39;utilizzo di un contatore automatico cella per semplificare gli studi sull&#39;espressione genica: Knockdown siRNA di IL-4 genica dipendente nelle celle Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins

GST-la sua purificazione: A Two-step Affinity Purification protocollo Cedendo Full-length proteine ​​purificate

Key assays in enzymology for the biochemical characterization of proteins in vitro necessitate high concentrations of the purified protein of interest. ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Germogliamento lievito proteine ​​estrazione e purificazione per lo Studio della funzione, interazioni e modificazioni post-traduzionali

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Identificazione delle modificazioni post-traduzionali di proteine ​​vegetali Complessi

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

siRNA screening per identificare ubiquitina e ubiquitina-come regolatori del sistema di percorsi biologici in cellule di mammifero coltivate

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

In vitro Sintesi di mRNA modificata per l&#39;induzione di espressione della proteina nelle cellule umane

The exogenous delivery of coding synthetic messenger RNA (mRNA) for induction of protein synthesis in desired cells has enormous potential in the fields ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-base Espressione Proiezione di proteine ​​di membrana in<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...