Name: removal of an internal translational start site from mrna while retaining expression of the full-length protein
Uploaded: 2022-03-16T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Removal of an Internal Translational Start Site from mRNA While Retaining Expression of the Full-Length Protein at JoVE.com

このプロジェクトは、国立衛生研究所のRMSへの助成金(R01HL152691、R01HL138577、およびR01HL159983)によって支援されました。

「すべての動物ケアと研究プロトコルは、シダーズ・シナイ医療センターとユタ大学の施設動物ケアおよび使用委員会によって承認されました。8〜9週齢で市販の供給源から得られたC57BL/6J雌マウス( 材料表を参照)を実験に使用した。
1. 遺伝子ターゲティングの準備
<ol><li>CRISPOR Webアルゴリズム4、9<sup...

<ol>
	<li>Smyth, J. W., Shaw, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoregulation+of+connexin43+gap+junction+formation+by+internally+translated+isoforms.">Autoregulation of connexin43 gap junction formation by internally translated isoforms.</a> Cell Reports. 5 (3), 611-618 (2013).</li><li>Basheer, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GJA1-20k+arranges+actin+to+guide+Cx43+delivery+to+cardiac+intercalated+discs.">GJA1-20k arranges actin to guide Cx43 delivery to cardiac intercalated discs.</a> Circulation Research. 121 (9), 1069-1080 (2017).</li><li>Fu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cx43+isoform+GJA1-20k+promotes+microtubule+dependent+mitochondrial+transport.">Cx43 isoform GJA1-20k promotes microtubule dependent mitochondrial transport.</a> Frontiers in Physiology. 8, 905 (2017).</li><li>Xiao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auxiliary+trafficking+subunit+GJA1-20k+protects+connexin-43+from+degradation+and+limits+ventricular+arrhythmias.">Auxiliary trafficking subunit GJA1-20k protects connexin-43 from degradation and limits ventricular arrhythmias.</a> Journal of Clinical Investigation. 130 (9), 4858-4870 (2020).</li><li>Syvanen, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+gels+to+chips:+&amp;#34;minisequencing&amp;#34;+primer+extension+for+analysis+of+point+mutations+and+single+nucleotide+polymorphisms.">From gels to chips: &amp;#34;minisequencing&amp;#34; primer extension for analysis of point mutations and single nucleotide polymorphisms.</a> Human Mutation. 13 (1), 1-10 (1999).</li><li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+SNP+discovery+in+tetraploid+alfalfa+using+454+sequencing+and+high+resolution+melting+analysis.">Genome-wide SNP discovery in tetraploid alfalfa using 454 sequencing and high resolution melting analysis.</a> BMC Genomics. 12, 1-11 (2011).</li><li>Han, Y., Khu, D. M., Monteros, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+melting+analysis+for+SNP+genotyping+and+mapping+in+tetraploid+alfalfa+(Medicago+sativa+L.).">High-resolution melting analysis for SNP genotyping and mapping in tetraploid alfalfa (Medicago sativa L.).</a> Molecular Breeding. 29 (2), 489-501 (2012).</li><li>Peng, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+and+quick+PCR-based+method+to+genotype+mice+with+a+leptin+receptor+mutation+(db/db+mice).">A novel and quick PCR-based method to genotype mice with a leptin receptor mutation (db/db mice).</a> Acta Pharmacologica Sinica. 39 (1), 117-123 (2018).</li><li>Haeussler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+off-target+and+on-target+scoring+algorithms+and+integration+into+the+guide+RNA+selection+tool+CRISPOR.">Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR.</a> Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).</li><li>Concordet, J. P., Haeussler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPOR:+Intuitive+guide+selection+for+CRISPR/Cas9+genome+editing+experiments+and+screens.">CRISPOR: Intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens.</a> Nucleic Acids Research. 46 (1), 242-245 (2018).</li><li>Hsu, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+targeting+specificity+of+RNA-guided+Cas9+nucleases.">DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.</a> Nature Biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>Paquet, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+introduction+of+specific+homozygous+and+heterozygous+mutations+using+CRISPR/Cas9.">Efficient introduction of specific homozygous and heterozygous mutations using CRISPR/Cas9.</a> Nature. 533 (7601), 125-129 (2016).</li><li>Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , (2014).</li><li>Pomp, D., Critser, E. S., Rutledge, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lower+sodium+lactate+in+Whitten's+medium+improves+in+vitro+developmental+capacity+of+one-cell+mouse+embryos.">Lower sodium lactate in Whitten's medium improves in vitro developmental capacity of one-cell mouse embryos.</a> Theriogenology. 29 (5), 1019-1025 (1988).</li><li>Summers, M. C., McGinnis, L. K., Lawitts, J. A., Raffin, M., Biggers, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IVF+of+mouse+ova+in+a+simplex+optimized+medium+supplemented+with+amino+acids.">IVF of mouse ova in a simplex optimized medium supplemented with amino acids.</a> Human Reproduction. 15 (8), 1791-1801 (2000).</li><li>Green, M. R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition). , (2012).</li><li>Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Huang, Z., Harata, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+genotyping+of+animals+followed+by+establishing+primary+cultures+of+brain+neurons.">Rapid genotyping of animals followed by establishing primary cultures of brain neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. 95. (95), e51879 (2015).</li><li>Iyer, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=No+unexpected+CRISPR-Cas9+off-target+activity+revealed+by+trio+sequencing+of+gene-edited+mice.">No unexpected CRISPR-Cas9 off-target activity revealed by trio sequencing of gene-edited mice.</a> PLoS Genetics. 14 (7), 1007503 (2018).</li><li>Nature Medicine. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keep+off-target+effects+in+focus.">Keep off-target effects in focus.</a> Nature Medicine. 24 (8), 1081 (2018).</li><li>Mayer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+EcoRI-activity+of+EcoRI+endonuclease.">Optimization of the EcoRI-activity of EcoRI endonuclease.</a> FEBS Letters. 90 (2), 341-344 (1978).</li><li>Kozak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Point+mutations+close+to+the+AUG+initiator+codon+affect+the+efficiency+of+translation+of+rat+preproinsulin+in+vivo.">Point mutations close to the AUG initiator codon affect the efficiency of translation of rat preproinsulin in vivo.</a> Nature. 308 (5956), 241-246 (1984).</li><li>Kozak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Point+mutations+define+a+sequence+flanking+the+AUG+initiator+codon+that+modulates+translation+by+eukaryotic+ribosomes.">Point mutations define a sequence flanking the AUG initiator codon that modulates translation by eukaryotic ribosomes.</a> Cell. 44 (2), 283-292 (1986).</li><li>Basheer, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+response+protein+GJA1-20k+promotes+mitochondrial+biogenesis,+metabolic+quiescence,+and+cardioprotection+against+ischemia/reperfusion+injury.">Stress response protein GJA1-20k promotes mitochondrial biogenesis, metabolic quiescence, and cardioprotection against ischemia/reperfusion injury.</a> JCI Insight. 3 (20), 121900 (2018).</li><li>Shimura, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+mitochondrial+fission+induced+by+stress-responsive+protein+GJA1-20k.">Protective mitochondrial fission induced by stress-responsive protein GJA1-20k.</a> Elife. 10, 69207 (2021).</li></ol>

遺伝子改変マウスモデルは、遺伝子機能を理解するための一般的なアプローチです。しかし、GJA1-20k内部翻訳アイソフォームは全長Cx43と同じ Gja1 mRNAから翻訳されるため、全長Cx43発現を保持しながらGJA1-20k発現を抑制するための創造的な戦略が考案された。このアプローチは、GJA1-20kの内部開始コドンの変異に基づいている。一点変異により、M213はGja1 mRNA上でLに切り替えられ、 GJA1-2...

全長コネキシン43(Cx43)およびN末端切断アイソフォームGJA1-20kは、同じGJA1 mRNAによってコードされるが、翻訳を開始するために異なる開始コドン1を利用する。Cx43翻訳は最初のAUG開始コドンで起こり、一方GJA1-20k翻訳は残基213のAUGで開始する。GJA1-20kは、インビトロでの完全長Cx43トラフィッキング、アクチン安定化、およびミトコンドリア形態の調節に不可欠な役割を果たすことが以前に見出された1,2,3。
生体内でのGJA1-20kの役割を理解するために、完全長Cx43を作成する能力を保持したGJA1-20k「ノックアウト」マウスモデルが生成された。このアプローチは、CRISPR-Cas9システムを使用して、213の単一残基をメチオニン(M)からロイシン(L)(Gja1M213L/M213L)4に置換することでした。内部MからLへの変異は、内部翻訳が起こる可能性を劇的に低下させるが、それでも完全長タンパク質4の翻訳および機能を保持する。野生型(WT)と変異対立遺伝子は同一のサイズおよびほぼ同一のmRNA産物を有するため、マウスにおける遺伝子型を確認するのはかなり困難である。DNAシーケンシングは変異を同定できますが、日常的な使用には高価で時間がかかります。一般に、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)、ミニシーケンシングライゲーション、高分解能融解解析、テトラプライマー増幅難治性変異システムPCR(ARMS-PCR)5、6、7、8など、いくつかの高速ジェノタイピング法が確立されています。しかし、これらの代替法は、複数のステップ、独自のリソース、および/または非特異的PCR産物を誘導する可能性のあるいくつかの特異的プライマーセットを必要とする。
このプロトコルは、CRISPR-Cas9による詳細な遺伝子ターゲティングおよび編集アプローチを導入して単一のアミノ酸変異を作成し、その変異を確認するためにラピッドジェノタイピングを提示する。遺伝子型同定は、標的遺伝子を同定するために単一のプライマーセットのみを利用する制限酵素の創造的な使用を含む。読者は参考文献4 を参照し、1残基Gja1 M213L/M213L 置換変異によって引き起こされる突然の心臓死の深遠な電気生理学的効果を観察し、それでもなお完全長タンパク質を生成するが、より小さな内部翻訳切断アイソフォームを生成することができない。このプロトコルは、他のマウスモデルが点突然変異を使用して、内因性完全長タンパク質の発現を維持しながら、目的のアイソフォームの内部翻訳を減少させるのに役立ちます。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL 8-Strip PCR tube</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1148A28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-038</td>
			<td>For pronuclear micorinjection buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x CutSmart buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7204S</td>
			<td>Digestion buffer for NlaIII</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Tris-HCl pH 7.5</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15567-027</td>
			<td>For pronuclear micorinjection buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50x TAE Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>24710-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Thermal cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>Model # 9902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>664</td>
			<td>mouse strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemidoc MP imaging system</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td>To take gel image by 302 nm UV light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eSpCas9 protein</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>ESPCAS9PRO-50UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Lading Dye Purple (6x)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7024S</td>
			<td>Loading buffer for electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gloves</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hCG (human chorionic gonadotropin)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>23-073-425G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>H3884-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Lab software</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td>To analyze gel image</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted stereo microscope whit plasDIC</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axiovert A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA Mouse Genotyping Kits</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>KK7352</td>
			<td>For tissue or cell lysis, DNA extraction, and PCR master mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KSOM</td>
			<td>LifeGlobal</td>
			<td>ZEKS-050</td>
			<td>embryo culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab coart</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M2 medium</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>MR015D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NlaIII</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0125S</td>
			<td>To digest PCR product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9937</td>
			<td>To dilute reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin oil</td>
			<td>Nacalai USA</td>
			<td>2613785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plugged 20 &#956;L fine pipette tip</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>02-707-171</td>
			<td>To pick up blastocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSG (pregnant mare&#8217;s serum gonadotropin)</td>
			<td>ProSpec-Tany</td>
			<td>HOR-272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9760G</td>
			<td>For pronuclear micorinjection buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR safe DNA Gel Stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S33102</td>
			<td>To detect bands in gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tracrRNA</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>U-002000-120</td>
			<td>Guid RNA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

removal of an internal translational start site from mrna while retaining expression of the full-length protein

ゲノム修復機構に基づくCRISPR-Cas9遺伝子編集システムは、従来の相同組換えと比較して、遺伝子改変マウスモデルをより迅速かつ容易に生成することを可能にする。CRISPR-Cas9システムは、単一点変異が望まれる場合に特に魅力的である。ギャップ接合タンパク質であるコネキシン43(Cx43)は、単一のコードエクソンを有し、スプライシングできない遺伝子Gja1によってコードされる。しかし、Gja1は、全長Cx43タンパク質だけでなく、内部翻訳として知られるプロセスによって最大6つのN末端切断アイソフォームを産生し、その結果、内部AUG(メチオニン)開始部位でのリボソーム翻訳開始が生じる。GJA1−20kは、Gja1 mRNAの213位のAUGコドンで開始されるCx43の最も一般的に生成されたトランケートアイソフォームである。残基213はCx43の最後の膜貫通ドメインの末端に存在するので、GJA1-20kは、独立したタンパク質として事実上、Cx43の20kDaのC末端尾部である。以前の研究者らは、細胞において、GJA1-20kの重要な役割は、原形質膜への全長Cx43ギャップ接合ヘミチャネルのトラフィッキングを促進することであると同定した。この現象を 生体内で調べるために、残基213のATG(メチオニン)をTTA(ロイシン、M213L変異)で置換するGja1点変異を有する変異マウスを作製した。M213Lの結果、Gja1 mRNAおよび完全長Cx43は依然として生成されているが、Gja1-20kの翻訳は有意に減少している。本報告では、1アミノ酸変異(Gja1 M213L/M213L)マウスモデルを開発するための制限酵素部位の選択に着目した。このプロトコルは、CRISPR-Cas9システムによる遺伝子改変マウスと、PCRと制限酵素処理を組み合わせたラピッドジェノタイピングについて説明しています。

CRISPR/Cas9遺伝子編集系は、マウス10番染色体上でそれぞれ56,264,279~56,264,281および56,264,291~56,264,293に、またはGja1 mRNA上で869~871および881~883でATGからTTAへの変異およびサイレントTCCからTCGへの変異を生じる。これらの変異は、GJA1タンパク質上のメチオニン213からロイシン(M213L)への変異をもたらし、TTCからTTGへの変異は、望ましくない遺伝子編集を避けるために近くのPAM配列を破壊する(<strong class="x...

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Removal of an Internal Translational Start Site from mRNA While Retaining Expression of the Full-Length Protein

本プロトコールは、完全長コネキシン43生成を保持するが、より小さなGJA1-20k内部翻訳アイソフォームの翻訳を防止する、Gja1における単一のM213L変異を記載する。

完全長タンパク質の発現を維持しながらmRNAからの内部翻訳開始部位を除去する

The CRISPR-Cas9 gene-editing system, based on genome repair mechanisms, enables the generation of gene-modified mouse models more quickly and easily ...

単一残基置換の難しさは、単一残基の違いにもかかわらず動物を効率的にジェノタイピングすることである。制限酵素を特別に使用すると、典型的なPCRベースのジェノタイピングに1つの迅速で低コストのステップしか追加されません。このプロトコルは、標的配列が制限酵素によって認識される場合、変異点を有する他の任意のマウスモデルに適用することができる(これは通常そうである)。尾の先端をきれいなハサミで1~3ミリカットし、0.2ミリリットルの8ストリップPCRチューブに移します。原稿に記載されているように尾部サンプルを入れた後、抽出までTマイナス20°Cで、約1週間まで保管してください。チューブあたり100マイクロリットルの組織溶解溶液を加え、よく混合し、続いて卓上小型遠心分離機を用いて2,200倍Gで室温で10秒間スピンダウンした。テールサンプルが溶液に沈んでいることを確認します。組織溶解、不活性化、および保持のパラメータをプログラミングすることによって、チューブをサーマルサイクラーにセットします。PCRをすぐに実行できない場合は、組織溶解液を摂氏4度で最大1週間保存してください。サンプルあたり 5 マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水、0.75 マイクロリットルの 10 マイクロモルのフォワードプライマーとリバースプライマー、および 7.5 マイクロリットルの PCR マスターミックスを含む PCR 溶液を新しい PCR チューブに準備します。予め調製した組織溶解液1マイクロリットルをPCR溶液に加える。PCR溶液をよく混合し、卓上型ミニ遠心分離機で2,200倍のGで室温で10秒間スピンダウンします。チューブをプログラムされたサーマルサイクラーにセットします。反応が完了したら、PCR産物を摂氏4度で1~2ヶ月間、またはマイナス20度で約1年間保管してください。ヌクレアーゼを含まない水 7 マイクロリットル、10 倍の強度で 2 マイクロリットルの CutSmart バッファー、および 1 マイクロリットルの NlaIII 制限酵素を含む酵素溶液を調製します。複数のサンプルがある場合は、各含有量を掛けて混合物を作り、チューブあたり10マイクロリットルをアリコートします。以前に得られた10マイクロリットルのPCR産物を酵素溶液に1本のチューブあたりに加える。よく混ぜて、前に示したように卓上ミニ遠心分離機でスピンダウンします。チューブをプログラムされたサーマルサイクラーまたはヒートブロックにセットします。低温条件下でのインキュベーション後に製品を保管する。50ミリリットルの単一強度TAEバッファーに0.75グラムのアガロースを加える。アガロースが完全に溶解するまで電子レンジでアガロースを混ぜて加熱する。それを冷却した後、5マイクロリットルのDNA染色剤を加え、穏やかに混ぜる。25ミリリットルのアガロースゲルをゲルモールドに注ぎ、ゲルを固化させる。10マイクロリットルの消化PCR産物をウェルにロードする。ゲルを100ボルトで35分間実行します。紫外線下でアガロースゲルを画像化します。消化されたPCR産物を用いて行われたアガロース電気泳動は、各遺伝子型において異なるサイズのいくつかのバンドをもたらし、それぞれ野生型に2つのバンド、ヘテロ接合型で3つ、およびホモ接合型で1つのバンドをもたらした。胚盤胞分析による試験注入は、ドナーオリゴのマイクロリットル当たり50ナノグラムを注入することにおいて76.9%の成功率をもたらし、同じドナーオリゴのマイクロリットル当たり25ナノグラムを注入することにおいてそれぞれ25%の成功率をもたらした。最後に、エタノール沈殿を用いてドナーオリゴのマイクロリットル当たり50ナノグラムを注入し、50%の成功率で創始者動物を得た。エタノール沈殿によるオリゴドナーの精製は、高いゲノム編集効率を維持しながら毒性を低下させた。慎重な取り扱いと少量の試薬を添加する上では非常に重要です。それらが正しく追加され、よく混合されていることを確認してください。

Research

JoVE Journal

Biology

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

エレクトロポレーションのためのマウス骨髄からの一次造血細胞培養の準備

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

生物学

Homemade Site Directed Mutagenesis of Whole Plasmids

全プラスミドの自家製のサイトが特異的突然変異誘発

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

クーマシー有機溶媒および酢酸のないG - 250でゲル中のタンパク質の染色

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

ナマルバ細胞におけるIL - 4依存性遺伝子発現のsiRNAのノックダウン：遺伝子発現研究を簡素化する自動化セルカウンターの使い方

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins

GST-Hisの精製：全長精製タンパク質を降伏二段階アフィニティー精製プロトコル

Key assays in enzymology for the biochemical characterization of proteins in vitro necessitate high concentrations of the purified protein of interest. ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

機能の研究、相互作用、および翻訳後修飾のため出芽酵母タンパク質の抽出と精製

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

植物タンパク質複合体の翻訳後修飾の同定

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

培養哺乳動物細胞内の生物学的経路のユビキチンおよびユビキチン様システムレギュレータを識別するために、siRNAのスクリーニング

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

ヒト細胞におけるタンパク質発現の誘導のために修飾されたmRNAのインビトロ合成における

The exogenous delivery of coding synthetic messenger RNA (mRNA) for induction of protein synthesis in desired cells has enormous potential in the fields ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

膜タンパク質の緑色蛍光タンパク質ベースの発現スクリーニングで<em&gt;エシェリヒア·コリ</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...