Name: removal of an internal translational start site from mrna while retaining expression of the full-length protein
Uploaded: 2022-03-16T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Removal of an Internal Translational Start Site from mRNA While Retaining Expression of the Full-Length Protein at JoVE.com

O projeto foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (R01HL152691, R01HL138577 e R01HL159983) à RMS.

Todos os protocolos de cuidados e estudos para animais foram aprovados pelos Comitês Institucionais de Cuidados e Uso de Animais do Cedars-Sinai Medical Center e da Universidade de Utah. Camundongos fêmeas C57BL/6J obtidos de fontes comerciais com 8-9 semanas de idade (ver Tabela de Materiais) foram utilizados para os experimentos.
1. Preparação para direcionamento genético
<ol><li>Selecione a sequência de destino guia em torno do site de mutação alv...

<ol>
	<li>Smyth, J. W., Shaw, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoregulation+of+connexin43+gap+junction+formation+by+internally+translated+isoforms.">Autoregulation of connexin43 gap junction formation by internally translated isoforms.</a> Cell Reports. 5 (3), 611-618 (2013).</li><li>Basheer, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GJA1-20k+arranges+actin+to+guide+Cx43+delivery+to+cardiac+intercalated+discs.">GJA1-20k arranges actin to guide Cx43 delivery to cardiac intercalated discs.</a> Circulation Research. 121 (9), 1069-1080 (2017).</li><li>Fu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cx43+isoform+GJA1-20k+promotes+microtubule+dependent+mitochondrial+transport.">Cx43 isoform GJA1-20k promotes microtubule dependent mitochondrial transport.</a> Frontiers in Physiology. 8, 905 (2017).</li><li>Xiao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auxiliary+trafficking+subunit+GJA1-20k+protects+connexin-43+from+degradation+and+limits+ventricular+arrhythmias.">Auxiliary trafficking subunit GJA1-20k protects connexin-43 from degradation and limits ventricular arrhythmias.</a> Journal of Clinical Investigation. 130 (9), 4858-4870 (2020).</li><li>Syvanen, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+gels+to+chips:+&amp;#34;minisequencing&amp;#34;+primer+extension+for+analysis+of+point+mutations+and+single+nucleotide+polymorphisms.">From gels to chips: &amp;#34;minisequencing&amp;#34; primer extension for analysis of point mutations and single nucleotide polymorphisms.</a> Human Mutation. 13 (1), 1-10 (1999).</li><li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+SNP+discovery+in+tetraploid+alfalfa+using+454+sequencing+and+high+resolution+melting+analysis.">Genome-wide SNP discovery in tetraploid alfalfa using 454 sequencing and high resolution melting analysis.</a> BMC Genomics. 12, 1-11 (2011).</li><li>Han, Y., Khu, D. M., Monteros, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+melting+analysis+for+SNP+genotyping+and+mapping+in+tetraploid+alfalfa+(Medicago+sativa+L.).">High-resolution melting analysis for SNP genotyping and mapping in tetraploid alfalfa (Medicago sativa L.).</a> Molecular Breeding. 29 (2), 489-501 (2012).</li><li>Peng, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+and+quick+PCR-based+method+to+genotype+mice+with+a+leptin+receptor+mutation+(db/db+mice).">A novel and quick PCR-based method to genotype mice with a leptin receptor mutation (db/db mice).</a> Acta Pharmacologica Sinica. 39 (1), 117-123 (2018).</li><li>Haeussler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+off-target+and+on-target+scoring+algorithms+and+integration+into+the+guide+RNA+selection+tool+CRISPOR.">Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR.</a> Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).</li><li>Concordet, J. P., Haeussler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPOR:+Intuitive+guide+selection+for+CRISPR/Cas9+genome+editing+experiments+and+screens.">CRISPOR: Intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens.</a> Nucleic Acids Research. 46 (1), 242-245 (2018).</li><li>Hsu, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+targeting+specificity+of+RNA-guided+Cas9+nucleases.">DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.</a> Nature Biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>Paquet, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+introduction+of+specific+homozygous+and+heterozygous+mutations+using+CRISPR/Cas9.">Efficient introduction of specific homozygous and heterozygous mutations using CRISPR/Cas9.</a> Nature. 533 (7601), 125-129 (2016).</li><li>Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , (2014).</li><li>Pomp, D., Critser, E. S., Rutledge, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lower+sodium+lactate+in+Whitten's+medium+improves+in+vitro+developmental+capacity+of+one-cell+mouse+embryos.">Lower sodium lactate in Whitten's medium improves in vitro developmental capacity of one-cell mouse embryos.</a> Theriogenology. 29 (5), 1019-1025 (1988).</li><li>Summers, M. C., McGinnis, L. K., Lawitts, J. A., Raffin, M., Biggers, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IVF+of+mouse+ova+in+a+simplex+optimized+medium+supplemented+with+amino+acids.">IVF of mouse ova in a simplex optimized medium supplemented with amino acids.</a> Human Reproduction. 15 (8), 1791-1801 (2000).</li><li>Green, M. R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition). , (2012).</li><li>Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Huang, Z., Harata, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+genotyping+of+animals+followed+by+establishing+primary+cultures+of+brain+neurons.">Rapid genotyping of animals followed by establishing primary cultures of brain neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. 95. (95), e51879 (2015).</li><li>Iyer, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=No+unexpected+CRISPR-Cas9+off-target+activity+revealed+by+trio+sequencing+of+gene-edited+mice.">No unexpected CRISPR-Cas9 off-target activity revealed by trio sequencing of gene-edited mice.</a> PLoS Genetics. 14 (7), 1007503 (2018).</li><li>Nature Medicine. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keep+off-target+effects+in+focus.">Keep off-target effects in focus.</a> Nature Medicine. 24 (8), 1081 (2018).</li><li>Mayer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+EcoRI-activity+of+EcoRI+endonuclease.">Optimization of the EcoRI-activity of EcoRI endonuclease.</a> FEBS Letters. 90 (2), 341-344 (1978).</li><li>Kozak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Point+mutations+close+to+the+AUG+initiator+codon+affect+the+efficiency+of+translation+of+rat+preproinsulin+in+vivo.">Point mutations close to the AUG initiator codon affect the efficiency of translation of rat preproinsulin in vivo.</a> Nature. 308 (5956), 241-246 (1984).</li><li>Kozak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Point+mutations+define+a+sequence+flanking+the+AUG+initiator+codon+that+modulates+translation+by+eukaryotic+ribosomes.">Point mutations define a sequence flanking the AUG initiator codon that modulates translation by eukaryotic ribosomes.</a> Cell. 44 (2), 283-292 (1986).</li><li>Basheer, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+response+protein+GJA1-20k+promotes+mitochondrial+biogenesis,+metabolic+quiescence,+and+cardioprotection+against+ischemia/reperfusion+injury.">Stress response protein GJA1-20k promotes mitochondrial biogenesis, metabolic quiescence, and cardioprotection against ischemia/reperfusion injury.</a> JCI Insight. 3 (20), 121900 (2018).</li><li>Shimura, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+mitochondrial+fission+induced+by+stress-responsive+protein+GJA1-20k.">Protective mitochondrial fission induced by stress-responsive protein GJA1-20k.</a> Elife. 10, 69207 (2021).</li></ol>

Um modelo de rato modificado por genes é uma abordagem comum para entender a função genética. No entanto, uma vez que o isoform traduzido internamente GJA1-20k é traduzido do mesmo Gja1 mRNA como Cx43 de comprimento completo, uma estratégia criativa foi concebida para manter a expressão Cx43 de comprimento completo, mas suprimir a expressão GJA1-20k. A abordagem é baseada em uma mutação do códon inicial interno de GJA1-20k. Com uma mutação de um único ponto, M213 foi trocado para L em Gja1</em...

O Connexin 43 (Cx43) e o isoforme truncado N-terminus, GJA1-20k, codificados pelo mesmo GJA1 mRNA, mas utilizam códons de início diferentes1 para iniciar a tradução. A tradução Cx43 ocorre no primeiro códon de início de AUG, enquanto a tradução GJA1-20k inicia-se no AUG no resíduo 213. Foi previamente constatado que o GJA1-20k tem funções essenciais para o tráfico de Cx43 em comprimento total, estabilização de actin e regulação da morfologia mitocondrial in vitro 1,2,3.
Para entender o papel do GJA1-20k in vivo, foi gerado um modelo de mouse "knock-out" GJA1-20k que manteve a capacidade de criar Cx43 de comprimento completo. A abordagem foi utilizar o sistema CRISPR-Cas9 para substituir o resíduo único em 213 de uma methionina (M) a uma leucina (L) (Gja1M213L/M213L)4. Uma mutação interna de M a L diminui drasticamente a probabilidade de a tradução interna ocorrer, mas mantém a tradução e a função da proteína de comprimento total4. Como o tipo selvagem (WT) e o alelo mutado têm tamanhos idênticos e produtos mRNA quase idênticos, há uma dificuldade considerável em confirmar genótipo nos camundongos. O sequenciamento de DNA pode identificar a mutação, mas é muito caro e demorado para uso rotineiro. Em geral, vários métodos de genotipagem mais rápido foram estabelecidos, como reação de cadeia de polimerase em tempo real (RT-PCR), minisequenciamento-ligation, análise de fusão de alta resolução e sistema de mutação refratário tetra-primer PCR (ARMS-PCR)5,6,7,8. No entanto, esses métodos alternativos requerem múltiplas etapas, recursos exclusivos e/ou vários conjuntos de primer específicos que podem induzir produtos PCR não específicos.
Este protocolo introduz uma abordagem detalhada de segmentação e edição de genes pelo CRISPR-Cas9 para criar uma única mutação de aminoácidos, e genotipagem rápida é apresentada para confirmar a mutação. A identificação do genótipo envolve o uso criativo de enzimas de restrição utilizando apenas um único conjunto de primers para identificar o gene alvo. Os leitores são encaminhados à Referência4 para observar o profundo efeito eletrofisiológico da morte cardíaca súbita causada por uma mutação de substituição Gja1M213L/M213L que ainda gera proteína de comprimento total e não consegue gerar uma isoforma de truncação ingenuamente traduzida internamente menor. Este protocolo ajudará a fazer com que outros modelos de camundongos usem uma mutação pontual para diminuir a tradução interna de uma isoforme de interesse, mantendo a expressão da proteína endógena de comprimento total.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL 8-Strip PCR tube</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1148A28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-038</td>
			<td>For pronuclear micorinjection buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x CutSmart buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7204S</td>
			<td>Digestion buffer for NlaIII</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Tris-HCl pH 7.5</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15567-027</td>
			<td>For pronuclear micorinjection buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50x TAE Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>24710-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Thermal cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>Model # 9902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>664</td>
			<td>mouse strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemidoc MP imaging system</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td>To take gel image by 302 nm UV light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eSpCas9 protein</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>ESPCAS9PRO-50UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Lading Dye Purple (6x)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7024S</td>
			<td>Loading buffer for electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gloves</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hCG (human chorionic gonadotropin)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>23-073-425G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>H3884-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Lab software</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td>To analyze gel image</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted stereo microscope whit plasDIC</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axiovert A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA Mouse Genotyping Kits</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>KK7352</td>
			<td>For tissue or cell lysis, DNA extraction, and PCR master mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KSOM</td>
			<td>LifeGlobal</td>
			<td>ZEKS-050</td>
			<td>embryo culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab coart</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M2 medium</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>MR015D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NlaIII</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0125S</td>
			<td>To digest PCR product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9937</td>
			<td>To dilute reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin oil</td>
			<td>Nacalai USA</td>
			<td>2613785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plugged 20 &#956;L fine pipette tip</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>02-707-171</td>
			<td>To pick up blastocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSG (pregnant mare&#8217;s serum gonadotropin)</td>
			<td>ProSpec-Tany</td>
			<td>HOR-272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9760G</td>
			<td>For pronuclear micorinjection buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR safe DNA Gel Stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S33102</td>
			<td>To detect bands in gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tracrRNA</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>U-002000-120</td>
			<td>Guid RNA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

removal of an internal translational start site from mrna while retaining expression of the full-length protein

O sistema de edição de genes CRISPR-Cas9, baseado em mecanismos de reparação de genomas, permite a geração de modelos de camundongos modificados por genes de forma mais rápida e fácil em relação à recombinação homologous tradicional. O sistema CRISPR-Cas9 é particularmente atraente quando uma mutação de um ponto é desejada. A proteína de junção de lacunas, Connexin 43 (Cx43), é codificada pelo gene Gja1, que tem um único exon de codificação e não pode ser emendado. No entanto, Gja1 produz não apenas proteína Cx43 de comprimento completo, mas até seis isoformas truncados N-terminus por um processo conhecido como tradução interna, o resultado da iniciação da tradução ribossômica em locais de partida internos de AUG (Methionine). GJA1-20k é o isóforme truncado mais comumente gerado do Cx43 iniciado no codon AUG na posição 213 de Gja1 mRNA. Como o resíduo 213 ocorre no final do último domínio transmembrano de Cx43, GJA1-20k é efetivamente a cauda C-terminus de 20 kDa C de Cx43 como uma proteína independente. Investigadores anteriores identificaram, em células, que um papel crítico do GJA1-20k é facilitar o tráfico de hemicanais de junção de lacunas Cx43 de comprimento completo à membrana plasmática. Para examinar esse fenômeno in vivo, foi gerado um rato mutante com mutação de ponto Gja1 que substitui o ATG (Methionine) no resíduo 213 por TTA (leucemia, mutação M213L). O resultado do M213L é que Gja1 mRNA e Cx43 de comprimento completo ainda são gerados, mas a tradução de Gja1-20k é significativamente reduzida. Este relatório se concentra na escolha do local da enzima de restrição para desenvolver um modelo de mouse de um aminoácido mutado (Gja1M213L/M213L). Este protocolo descreve camundongos geneticamente modificados pelo sistema CRISPR-Cas9 e genotipagem rápida combinando tratamentos de PCR e enzimas de restrição.

O sistema de edição de genes CRISPR/Cas9 produz uma mutação ATG para TTA e uma mutação silenciosa de TCC para TCG entre 56.264.279 a 56.264.281 e de 56.264.291 a 56.264.293 no cromossomo do rato 10, ou em 869 a 871 e 881 a 883 em Gja1 mRNA, respectivamente. Essa mutação resulta em uma mutação de Methionina 213 a Leucina (M213L) na proteína GJA1 e a mutação TTC para TTG interrompe uma sequência PAM próxima para evitar edição genética indesejada (Figura 1). Os detalhes da mut...

Watch this Scientific Journal Video about Removal of an Internal Translational Start Site from mRNA While Retaining Expression of the Full-Length Protein at JoVE.com

Removal of an Internal Translational Start Site from mRNA While Retaining Expression of the Full-Length Protein

O presente protocolo descreve uma única mutação M213L em Gja1 que retém a geração Connexin43 em comprimento completo, mas impede a tradução do isoforme traduzido internamente GJA1-20k.

Remoção de um local de início de tradução interna do mRNA enquanto retém a expressão da proteína de comprimento completo

The CRISPR-Cas9 gene-editing system, based on genome repair mechanisms, enables the generation of gene-modified mouse models more quickly and easily ...

A dificuldade com uma única substituição de resíduo é genotipar animais de forma eficiente, apesar da diferença no único resíduo. O uso especial de uma enzima de restrição adiciona apenas um passo único, rápido e de baixo custo ao genotipagem típico baseado em PCR. Este protocolo pode ser aplicado a qualquer outro modelo de mouse com um ponto de mutação se a sequência de destino for reconhecida por uma enzima de restrição, que geralmente é o caso.Corte de um a três milímetros da ponta da cauda com uma tesoura limpa e transfira-a para um tubo PCR de oito tiras de 0,2 mililitro. Depois de conter a amostra de cauda como descrito no manuscrito, armazene-a a T-menos 20 graus Celsius até a extração, até cerca de uma semana. Adicione 100 microliters de solução de lise tecidual por tubo e misture bem, seguido de spin-down usando uma minicentrifuagem de mesa a 2.200 vezes G por 10 segundos à temperatura ambiente.Certifique-se de que as amostras da cauda estão submersas na solução. Coloque os tubos em um cicloviário térmico, programando os parâmetros para lise tecidual, inativação e retenção. Armazene o tecido a quatro graus Celsius por até uma semana se o PCR não puder ser realizado imediatamente.Prepare uma solução PCR contendo cinco microlitros de água sem nuclease, 0,75 microlitros de primers avançados e reversos de 10 micromolares e 7,5 microlitros de mix mestre PCR por amostra em um novo tubo PCR. Adicione um microliter do tecido previamente preparado à solução PCR. Misture bem a solução PCR e gire para baixo com uma minicentrifugação de mesa a 2.200 vezes G durante 10 segundos à temperatura ambiente.Coloque os tubos em um ciclo térmico programado. Uma vez concluída a reação, armazene os produtos PCR a quatro graus Celsius por um a dois meses ou aproximadamente um ano a menos 20 graus Celsius. Prepare a solução enzimada contendo sete microlitrais de água sem nuclease, dois microliters de buffer CutSmart com força de 10X e um microliter de enzima de restrição NlaIII.Se houver várias amostras, multiplique cada conteúdo para fazer a mistura e alíquota de 10 microliters por tubo. Adicione 10 microliters de produto PCR previamente obtidos à solução enzimápica por tubo. Misture bem e gire para baixo com o minicentrifuge de mesa como demonstrado anteriormente.Coloque os tubos em um ciclo de calor programado ou bloqueio térmico. Armazene o produto após a incubação em condições frias. Adicione 0,75 gramas de agarose em 50 mililitros de tampão TAE de força única.Misture e aqueça a agarose no micro-ondas até dissolver completamente. Depois de esfriá-lo, adicione cinco microliters de mancha de DNA e misture suavemente. Despeje 25 mililitros do gel de agarose no molde de gel e deixe o gel solidificar.Carregue 10 microliters do produto PCR digerido para o poço. Execute o gel com 100 volts por 35 minutos. Imagem do gel agarose sob luz ultravioleta.A eletroforese agarose realizada utilizando o produto PCR digerido resultou em várias faixas de tamanhos diferentes em cada genótipo, com duas bandas em tipo selvagem, três em heterozigous e uma em homozigos, respectivamente. A injeção de teste com análise blastocisto resultou em uma taxa de sucesso de 76,9% na injeção de 50 nanogramas por microliter dos oligos doadores, e uma taxa de sucesso de 25% na injeção de 25 nanogramas por microliter dos mesmos oligos doadores, respectivamente. Finalmente, injetar 50 nanogramas por microliter dos oligos doadores com precipitação de etanol obteve animais fundadores com uma taxa de sucesso de 50%.A purificação de doadores de oligo por precipitação de etanol reduziu a toxicidade, mantendo alta eficiência de edição de genomas. O manuseio cuidadoso e a adição de uma baixa quantidade de reagentes é muito importante. Certifique-se de que eles são adicionados corretamente e são bem misturados.

Research

JoVE Journal

Biology

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

Elaboração de culturas de células primárias hematopoéticas de medula óssea de camundongos para Eletroporação

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Biologia

Homemade Site Directed Mutagenesis of Whole Plasmids

Mutagênese do site caseiros Direção de Plasmids Whole

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Coloração de proteínas em géis com Coomassie G-250 sem ácido acético e Solventes Orgânicos

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

Usando um contador de células automatizadas para simplificar Estudos da Expressão Gênica: Knockdown siRNA de Expressão IL-4 Gene Dependente em células NAMALWA

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins

GST-Sua purificação: A Two-step Affinity Purification Protocolo Cedendo Full-length proteínas purificadas

Key assays in enzymology for the biochemical characterization of proteins in vitro necessitate high concentrations of the purified protein of interest. ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Brotando Yeast extração e purificação de proteínas para o estudo da função, interações e modificações pós-traducionais

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Identificação de modificações pós-translacionais de Complexos de proteína vegetal

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Screening siRNA identificar Ubiquitin e ubiquitina-como reguladores do sistema de caminhos biológicos em células de mamíferos cultivadas

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

In Vitro Síntese de ARNm de modificação para indução da expressão da proteína em células humanas

The exogenous delivery of coding synthetic messenger RNA (mRNA) for induction of protein synthesis in desired cells has enormous potential in the fields ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Verde Fluorescente à base de proteínas Expressão Rastreio de Proteínas de Membrana em<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...