Name: removal of an internal translational start site from mrna while retaining expression of the full-length protein
Uploaded: 2022-03-16T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Removal of an Internal Translational Start Site from mRNA While Retaining Expression of the Full-Length Protein at JoVE.com

Проект был поддержан грантами Национальных институтов здравоохранения (R01HL152691, R01HL138577 и R01HL159983) для RMS.

«Все протоколы ухода за животными и их изучения были одобрены институциональными комитетами по уходу за животными и их использованию Медицинского центра Cedars-Sinai и Университета штата Юта. Для экспериментов использовали самок мышей C57BL/6J, полученных из коммерческих источников в возраст?...

<ol>
	<li>Smyth, J. W., Shaw, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoregulation+of+connexin43+gap+junction+formation+by+internally+translated+isoforms.">Autoregulation of connexin43 gap junction formation by internally translated isoforms.</a> Cell Reports. 5 (3), 611-618 (2013).</li><li>Basheer, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GJA1-20k+arranges+actin+to+guide+Cx43+delivery+to+cardiac+intercalated+discs.">GJA1-20k arranges actin to guide Cx43 delivery to cardiac intercalated discs.</a> Circulation Research. 121 (9), 1069-1080 (2017).</li><li>Fu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cx43+isoform+GJA1-20k+promotes+microtubule+dependent+mitochondrial+transport.">Cx43 isoform GJA1-20k promotes microtubule dependent mitochondrial transport.</a> Frontiers in Physiology. 8, 905 (2017).</li><li>Xiao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auxiliary+trafficking+subunit+GJA1-20k+protects+connexin-43+from+degradation+and+limits+ventricular+arrhythmias.">Auxiliary trafficking subunit GJA1-20k protects connexin-43 from degradation and limits ventricular arrhythmias.</a> Journal of Clinical Investigation. 130 (9), 4858-4870 (2020).</li><li>Syvanen, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+gels+to+chips:+&amp;#34;minisequencing&amp;#34;+primer+extension+for+analysis+of+point+mutations+and+single+nucleotide+polymorphisms.">From gels to chips: &amp;#34;minisequencing&amp;#34; primer extension for analysis of point mutations and single nucleotide polymorphisms.</a> Human Mutation. 13 (1), 1-10 (1999).</li><li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+SNP+discovery+in+tetraploid+alfalfa+using+454+sequencing+and+high+resolution+melting+analysis.">Genome-wide SNP discovery in tetraploid alfalfa using 454 sequencing and high resolution melting analysis.</a> BMC Genomics. 12, 1-11 (2011).</li><li>Han, Y., Khu, D. M., Monteros, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+melting+analysis+for+SNP+genotyping+and+mapping+in+tetraploid+alfalfa+(Medicago+sativa+L.).">High-resolution melting analysis for SNP genotyping and mapping in tetraploid alfalfa (Medicago sativa L.).</a> Molecular Breeding. 29 (2), 489-501 (2012).</li><li>Peng, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+and+quick+PCR-based+method+to+genotype+mice+with+a+leptin+receptor+mutation+(db/db+mice).">A novel and quick PCR-based method to genotype mice with a leptin receptor mutation (db/db mice).</a> Acta Pharmacologica Sinica. 39 (1), 117-123 (2018).</li><li>Haeussler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+off-target+and+on-target+scoring+algorithms+and+integration+into+the+guide+RNA+selection+tool+CRISPOR.">Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR.</a> Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).</li><li>Concordet, J. P., Haeussler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPOR:+Intuitive+guide+selection+for+CRISPR/Cas9+genome+editing+experiments+and+screens.">CRISPOR: Intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens.</a> Nucleic Acids Research. 46 (1), 242-245 (2018).</li><li>Hsu, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+targeting+specificity+of+RNA-guided+Cas9+nucleases.">DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.</a> Nature Biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>Paquet, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+introduction+of+specific+homozygous+and+heterozygous+mutations+using+CRISPR/Cas9.">Efficient introduction of specific homozygous and heterozygous mutations using CRISPR/Cas9.</a> Nature. 533 (7601), 125-129 (2016).</li><li>Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , (2014).</li><li>Pomp, D., Critser, E. S., Rutledge, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lower+sodium+lactate+in+Whitten's+medium+improves+in+vitro+developmental+capacity+of+one-cell+mouse+embryos.">Lower sodium lactate in Whitten's medium improves in vitro developmental capacity of one-cell mouse embryos.</a> Theriogenology. 29 (5), 1019-1025 (1988).</li><li>Summers, M. C., McGinnis, L. K., Lawitts, J. A., Raffin, M., Biggers, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IVF+of+mouse+ova+in+a+simplex+optimized+medium+supplemented+with+amino+acids.">IVF of mouse ova in a simplex optimized medium supplemented with amino acids.</a> Human Reproduction. 15 (8), 1791-1801 (2000).</li><li>Green, M. R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition). , (2012).</li><li>Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Huang, Z., Harata, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+genotyping+of+animals+followed+by+establishing+primary+cultures+of+brain+neurons.">Rapid genotyping of animals followed by establishing primary cultures of brain neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. 95. (95), e51879 (2015).</li><li>Iyer, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=No+unexpected+CRISPR-Cas9+off-target+activity+revealed+by+trio+sequencing+of+gene-edited+mice.">No unexpected CRISPR-Cas9 off-target activity revealed by trio sequencing of gene-edited mice.</a> PLoS Genetics. 14 (7), 1007503 (2018).</li><li>Nature Medicine. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keep+off-target+effects+in+focus.">Keep off-target effects in focus.</a> Nature Medicine. 24 (8), 1081 (2018).</li><li>Mayer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+EcoRI-activity+of+EcoRI+endonuclease.">Optimization of the EcoRI-activity of EcoRI endonuclease.</a> FEBS Letters. 90 (2), 341-344 (1978).</li><li>Kozak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Point+mutations+close+to+the+AUG+initiator+codon+affect+the+efficiency+of+translation+of+rat+preproinsulin+in+vivo.">Point mutations close to the AUG initiator codon affect the efficiency of translation of rat preproinsulin in vivo.</a> Nature. 308 (5956), 241-246 (1984).</li><li>Kozak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Point+mutations+define+a+sequence+flanking+the+AUG+initiator+codon+that+modulates+translation+by+eukaryotic+ribosomes.">Point mutations define a sequence flanking the AUG initiator codon that modulates translation by eukaryotic ribosomes.</a> Cell. 44 (2), 283-292 (1986).</li><li>Basheer, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+response+protein+GJA1-20k+promotes+mitochondrial+biogenesis,+metabolic+quiescence,+and+cardioprotection+against+ischemia/reperfusion+injury.">Stress response protein GJA1-20k promotes mitochondrial biogenesis, metabolic quiescence, and cardioprotection against ischemia/reperfusion injury.</a> JCI Insight. 3 (20), 121900 (2018).</li><li>Shimura, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+mitochondrial+fission+induced+by+stress-responsive+protein+GJA1-20k.">Protective mitochondrial fission induced by stress-responsive protein GJA1-20k.</a> Elife. 10, 69207 (2021).</li></ol>

Генно-модифицированная модель мыши является распространенным подходом к пониманию функции генов. Однако, поскольку внутренне транслируемая изоформа GJA1-20k транслируется из той же мРНК Gja1 , что и полноразмерная Cx43, была разработана творческая стратегия для сохранения полноразмерн?...

Полноразмерный коннексин 43 (Cx43) и N-конечная усеченная изоформа GJA1-20k, кодируемые одной и той же мРНК GJA1, но использующие разные стартовые кодоны1 для инициирования трансляции. Трансляция Cx43 происходит при первом кодоне запуска AUG, тогда как трансляция GJA1-20k инициируется в AUG при остатке 213. Ранее было обнаружено, что GJA1-20k играет важную роль в полноразмерном трафике Cx43, стабилизации актина и регуляции митохондриальной морфологии in vitro 1,2,3.
Чтобы понять роль GJA1-20k in vivo, была сгенерирована «нокаутирующая» модель мыши GJA1-20k, которая сохранила способность создавать полноразмерный Cx43. Подход заключался в использовании системы CRISPR-Cas9 для замены одиночного остатка при 213 с метионина (M) на лейцин (L) (Gja1M213L / M213L) 4. Внутренняя мутация от M до L резко снижает вероятность внутренней трансляции, но сохраняет трансляцию и функцию полноразмерного белка4. Поскольку дикий тип (WT) и мутировавший аллель имеют одинаковые размеры и почти идентичные продукты мРНК, существует значительная трудность в подтверждении генотипа у мышей. Секвенирование ДНК может идентифицировать мутацию, но слишком дорого и отнимает много времени для рутинного использования. В целом, было установлено несколько методов быстрого генотипирования, таких как полимеразная цепная реакция в реальном времени (ОТ-ПЦР), минисеквенирование-лигирование, анализ плавления с высоким разрешением и тетра-праймерная амплификационная тугобачная мутационная система ПЦР (ARMS-PCR)5,6,7,8. Тем не менее, эти альтернативные методы требуют нескольких шагов, уникальных ресурсов и / или нескольких конкретных наборов праймеров, которые могут индуцировать неспецифические продукты ПЦР.
Этот протокол вводит подробный подход к нацеливанию и редактированию генов CRISPR-Cas9 для создания одной аминокислотной мутации, и для подтверждения мутации представлено быстрое генотипирование. Идентификация генотипа включает в себя творческое использование ферментов рестрикции, использующих только один набор праймеров для идентификации гена-мишени. Читатели ссылаются на Ссылку4 , чтобы наблюдать глубокий электрофизиологический эффект внезапной сердечной смерти, вызванной мутацией замещения одного остатка Gja1M213L / M213L , которая все еще генерирует полноразмерный белок, но не может генерировать меньшую внутренне переведенную изоформу усечения. Этот протокол поможет другим моделям мышей использовать точечную мутацию для уменьшения внутренней трансляции интересующей изоформы при сохранении экспрессии эндогенного полноразмерного белка.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL 8-Strip PCR tube</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1148A28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-038</td>
			<td>For pronuclear micorinjection buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x CutSmart buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7204S</td>
			<td>Digestion buffer for NlaIII</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Tris-HCl pH 7.5</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15567-027</td>
			<td>For pronuclear micorinjection buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50x TAE Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>24710-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Thermal cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>Model # 9902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>664</td>
			<td>mouse strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemidoc MP imaging system</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td>To take gel image by 302 nm UV light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eSpCas9 protein</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>ESPCAS9PRO-50UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Lading Dye Purple (6x)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7024S</td>
			<td>Loading buffer for electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gloves</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hCG (human chorionic gonadotropin)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>23-073-425G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>H3884-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Lab software</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td>To analyze gel image</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted stereo microscope whit plasDIC</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axiovert A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA Mouse Genotyping Kits</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>KK7352</td>
			<td>For tissue or cell lysis, DNA extraction, and PCR master mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KSOM</td>
			<td>LifeGlobal</td>
			<td>ZEKS-050</td>
			<td>embryo culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab coart</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M2 medium</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>MR015D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NlaIII</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0125S</td>
			<td>To digest PCR product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9937</td>
			<td>To dilute reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin oil</td>
			<td>Nacalai USA</td>
			<td>2613785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plugged 20 &#956;L fine pipette tip</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>02-707-171</td>
			<td>To pick up blastocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSG (pregnant mare&#8217;s serum gonadotropin)</td>
			<td>ProSpec-Tany</td>
			<td>HOR-272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9760G</td>
			<td>For pronuclear micorinjection buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR safe DNA Gel Stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S33102</td>
			<td>To detect bands in gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tracrRNA</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>U-002000-120</td>
			<td>Guid RNA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

removal of an internal translational start site from mrna while retaining expression of the full-length protein

Система редактирования генов CRISPR-Cas9, основанная на механизмах восстановления генома, позволяет быстрее и проще генерировать генно-модифицированные мышиные модели по сравнению с традиционной гомологичной рекомбинацией. Система CRISPR-Cas9 особенно привлекательна, когда требуется одноточечная мутация. Белок щелевого перехода, Connexin 43 (Cx43), кодируется геном Gja1, который имеет один кодирующий экзон и не может быть сращен. Тем не менее, Gja1 производит не только полноразмерный белок Cx43, но и до шести усеченных изоформ N-конца с помощью процесса, известного как внутренняя трансляция, в результате инициации рибосомной трансляции на внутренних начальных участках AUG (метионин). GJA1-20k является наиболее часто генерируемой усеченной изоформой Cx43, инициируемой в кодоне AUG в позиции 213 мРНК Gja1. Поскольку остаток 213 встречается в конце последнего трансмембранного домена Cx43, GJA1-20k фактически является 20 кДа C-концевым хвостом Cx43 в качестве независимого белка. Предыдущие исследователи определили в клетках, что критическая роль GJA1-20k заключается в облегчении транспортировки полноразмерных гемиханнелей Cx43 с плазматической мембраной. Чтобы исследовать это явление in vivo, была сгенерирована мышь-мутант с точечной мутацией Gja1, которая заменяет ATG (метионин) в остатке 213 TTA (мутация Leucine, M213L). Результатом M213L является то, что мРНК Gja1 и полноразмерная Cx43 все еще генерируются, но трансляция Gja1-20k значительно снижается. В этом отчете основное внимание уделяется выбору сайта фермента рестрикции для разработки мышиной модели с одной аминокислотой мутированной (Gja1M213L / M213L). Этот протокол описывает генетически модифицированных мышей с помощью системы CRISPR-Cas9 и быстрого генотипирования путем комбинирования ПЦР и рестрикционных ферментов.

Система редактирования генов CRISPR/Cas9 производит мутацию ATG to TTA и тихую мутацию TCC to TCG при 56 264 279 до 56 264 281 и от 56 264 291 до 56 264 293 на хромосоме мыши 10 или при 869 до 871 и 881 до 883 на мРНК Gja1 соответственно. Эта мутация приводит к мутации метионина 213 к лейцину (M213L) на белке GJA1, а мутация TTC к TTG нарушает ?...

Watch this Scientific Journal Video about Removal of an Internal Translational Start Site from mRNA While Retaining Expression of the Full-Length Protein at JoVE.com

Removal of an Internal Translational Start Site from mRNA While Retaining Expression of the Full-Length Protein

Настоящий протокол описывает одну мутацию M213L в Gja1, которая сохраняет полноразмерную генерацию Connexin43, но предотвращает трансляцию меньшей изоформы GJA1-20k с внутренней трансляцией.

Удаление внутреннего трансляционного стартового участка из мРНК при сохранении экспрессии полноразмерного белка

The CRISPR-Cas9 gene-editing system, based on genome repair mechanisms, enables the generation of gene-modified mouse models more quickly and easily ...

Трудность с заменой одного остатка заключается в эффективном генотипировании животных, несмотря на разницу в единичном остатке. Специальное использование фермента рестрикции добавляет только один, быстрый и недорогой шаг к типичному генотипированию на основе ПЦР. Этот протокол может быть применен к любой другой мышиной модели с точкой мутации, если целевая последовательность распознается ферментом рестрикции, что обычно и происходит.Отрежьте один-три миллиметра кончика хвоста чистыми ножницами и переложите его в 0,2-миллилитровую восьмиполосную ПЦР-трубку. После хранения образца хвоста, как описано в рукописи, храните его при Т-минус 20 градусах Цельсия до извлечения, примерно до недели. Добавьте 100 микролитров раствора лизиса тканей на пробирку и хорошо перемешайте, а затем открутите вниз с помощью настольной миницентрифуги при 2, 200 раз G в течение 10 секунд при комнатной температуре.Убедитесь, что образцы хвоста погружены в раствор. Установите трубки на термоциклер, запрограммировав параметры лизиса, инактивации и удержания тканей. Храните тканевый лизат при четырех градусах Цельсия в течение недели, если ПЦР не может быть выполнена немедленно.Готовят раствор ПЦР, содержащий пять микролитров воды без нуклеазы, 0,75 микролитра 10-микромолярной прямой и обратной праймеров и 7,5 микролитра мастер-смеси ПЦР на образец в новую ПЦР-трубку. Добавьте один микролитр предварительно приготовленного тканевого лизата в раствор ПЦР. Хорошо перемешайте раствор ПЦР и открутите его с помощью настольной миницентрифуги при 2, 200 раз g в течение 10 секунд при комнатной температуре.Установите трубки на программируемый тепловой цикл. Как только реакция будет завершена, храните продукты ПЦР при четырех градусах Цельсия в течение одного-двух месяцев или примерно одного года при минус 20 градусах Цельсия. Приготовьте раствор фермента, содержащий семь микролитров воды без нуклеазы, два микролитра буфера CutSmart с силой 10X и один микролитр фермента рестрикции NlaIII.Если образцов несколько, умножьте каждое содержимое, чтобы получилась смесь, и аликвотьте 10 микролитров на пробирку. Добавьте 10 микролитров ранее полученного продукта ПЦР к раствору фермента на пробирку. Хорошо перемешайте и раскрутите с помощью настольной мини-центрифуги, как показано ранее.Установите трубки на программируемый тепловой циклер или тепловой блок. Хранить продукт после инкубации в холодных условиях. Добавьте 0,75 г агарозы в 50 миллилитра однопрочного буфера TAE.Смешайте и нагрейте агарозу в микроволновой печи, пока она полностью не растворится. После охлаждения добавьте пять микролитров пятна ДНК и аккуратно перемешайте. Налейте 25 миллилитров агарозного геля в гелевую форму и дайте гелю затвердеть.Загрузите в скважину 10 микролитров переваренного продукта ПЦР. Запустите гель со 100 вольт в течение 35 минут. Изобразите агарозный гель под ультрафиолетовым светом.Электрофорез агарозы, выполненный с использованием переваренного продукта ПЦР, привел к образованию нескольких полос разных размеров в каждом генотипе, с двумя полосами в диком типе, тремя в гетерозиготных и одной в гомозиготных, соответственно. Тестовая инъекция с анализом бластоцисты привела к 76,9% успеха при введении 50 нанограммов на микролитр донорского олиго и 25% успеха при введении 25 нанограммов на микролитр того же донорского олигоса, соответственно. Наконец, инъекция 50 нанограммов на микролитр донорских олиго с осаждением этанола получила животных-основателей с 50%-ным успехом.Очистка доноров олиго осаждением этанола снижала токсичность при сохранении высокой эффективности редактирования генома. Тщательное обращение и при добавлении небольшого количества реагентов очень важно. Убедитесь, что они правильно добавлены и хорошо перемешаны.

Research

JoVE Journal

Biology

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

Подготовка первичных гемопоэтических клеточных культур из костного мозга мышей для Электропорация

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Homemade Site Directed Mutagenesis of Whole Plasmids

Домашний сайт направленного мутагенеза Всего Плазмиды

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Окрашивание белков в гелях Кумасси G-250 без органических растворителей и уксусной кислоты

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

Использование автоматизированных счетчиков сотовый для упрощения исследования экспрессии генов: миРНК Нокдаун ИЛ-4 зависимости экспрессии генов в клетках Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins

GST-Его очистка: Двухступенчатая Affinity Очистка Протокол Уступая полноразмерных очищенных белков

Key assays in enzymology for the biochemical characterization of proteins in vitro necessitate high concentrations of the purified protein of interest. ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Многообещающая Добыча дрожжевого белка и очистка по изучению функций, взаимодействия и пост-трансляционных модификаций

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Идентификация пост-трансляционных модификаций растительных белковых комплексов

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

миРНК Скрининг для идентификации Убиквитин и Убиквитин-подобной системе регуляторов биологических путей в культивируемых клетках млекопитающих

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

Экстракорпоральное синтеза модифицированных мРНК для индукции экспрессии белка в клетках человека

The exogenous delivery of coding synthetic messenger RNA (mRNA) for induction of protein synthesis in desired cells has enormous potential in the fields ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Зеленый флуоресцентный белок на основе Expression Скрининг мембранных белков в<em&gt; Кишечная палочка</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...