Name: removal of an internal translational start site from mrna while retaining expression of the full-length protein
Uploaded: 2022-03-16T13:30:00
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El proyecto fue apoyado por subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud (R01HL152691, R01HL138577 y R01HL159983) a RMS.

"Todos los protocolos de cuidado y estudio de animales fueron aprobados por los Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales del Centro Médico Cedars-Sinai y la Universidad de Utah. Para los experimentos se utilizaron ratones hembra C57BL/6J obtenidos de fuentes comerciales a las 8-9 semanas de edad (ver Tabla de Materiales).
1. Preparación para la orientación genética
<ol><li>Seleccione la secuencia diana guía alrededor del sitio de mutación ...

<ol>
	<li>Smyth, J. W., Shaw, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoregulation+of+connexin43+gap+junction+formation+by+internally+translated+isoforms.">Autoregulation of connexin43 gap junction formation by internally translated isoforms.</a> Cell Reports. 5 (3), 611-618 (2013).</li><li>Basheer, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GJA1-20k+arranges+actin+to+guide+Cx43+delivery+to+cardiac+intercalated+discs.">GJA1-20k arranges actin to guide Cx43 delivery to cardiac intercalated discs.</a> Circulation Research. 121 (9), 1069-1080 (2017).</li><li>Fu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cx43+isoform+GJA1-20k+promotes+microtubule+dependent+mitochondrial+transport.">Cx43 isoform GJA1-20k promotes microtubule dependent mitochondrial transport.</a> Frontiers in Physiology. 8, 905 (2017).</li><li>Xiao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auxiliary+trafficking+subunit+GJA1-20k+protects+connexin-43+from+degradation+and+limits+ventricular+arrhythmias.">Auxiliary trafficking subunit GJA1-20k protects connexin-43 from degradation and limits ventricular arrhythmias.</a> Journal of Clinical Investigation. 130 (9), 4858-4870 (2020).</li><li>Syvanen, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+gels+to+chips:+&amp;#34;minisequencing&amp;#34;+primer+extension+for+analysis+of+point+mutations+and+single+nucleotide+polymorphisms.">From gels to chips: &amp;#34;minisequencing&amp;#34; primer extension for analysis of point mutations and single nucleotide polymorphisms.</a> Human Mutation. 13 (1), 1-10 (1999).</li><li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+SNP+discovery+in+tetraploid+alfalfa+using+454+sequencing+and+high+resolution+melting+analysis.">Genome-wide SNP discovery in tetraploid alfalfa using 454 sequencing and high resolution melting analysis.</a> BMC Genomics. 12, 1-11 (2011).</li><li>Han, Y., Khu, D. M., Monteros, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+melting+analysis+for+SNP+genotyping+and+mapping+in+tetraploid+alfalfa+(Medicago+sativa+L.).">High-resolution melting analysis for SNP genotyping and mapping in tetraploid alfalfa (Medicago sativa L.).</a> Molecular Breeding. 29 (2), 489-501 (2012).</li><li>Peng, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+and+quick+PCR-based+method+to+genotype+mice+with+a+leptin+receptor+mutation+(db/db+mice).">A novel and quick PCR-based method to genotype mice with a leptin receptor mutation (db/db mice).</a> Acta Pharmacologica Sinica. 39 (1), 117-123 (2018).</li><li>Haeussler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+off-target+and+on-target+scoring+algorithms+and+integration+into+the+guide+RNA+selection+tool+CRISPOR.">Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR.</a> Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).</li><li>Concordet, J. P., Haeussler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPOR:+Intuitive+guide+selection+for+CRISPR/Cas9+genome+editing+experiments+and+screens.">CRISPOR: Intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens.</a> Nucleic Acids Research. 46 (1), 242-245 (2018).</li><li>Hsu, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+targeting+specificity+of+RNA-guided+Cas9+nucleases.">DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.</a> Nature Biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>Paquet, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+introduction+of+specific+homozygous+and+heterozygous+mutations+using+CRISPR/Cas9.">Efficient introduction of specific homozygous and heterozygous mutations using CRISPR/Cas9.</a> Nature. 533 (7601), 125-129 (2016).</li><li>Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , (2014).</li><li>Pomp, D., Critser, E. S., Rutledge, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lower+sodium+lactate+in+Whitten's+medium+improves+in+vitro+developmental+capacity+of+one-cell+mouse+embryos.">Lower sodium lactate in Whitten's medium improves in vitro developmental capacity of one-cell mouse embryos.</a> Theriogenology. 29 (5), 1019-1025 (1988).</li><li>Summers, M. C., McGinnis, L. K., Lawitts, J. A., Raffin, M., Biggers, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IVF+of+mouse+ova+in+a+simplex+optimized+medium+supplemented+with+amino+acids.">IVF of mouse ova in a simplex optimized medium supplemented with amino acids.</a> Human Reproduction. 15 (8), 1791-1801 (2000).</li><li>Green, M. R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition). , (2012).</li><li>Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Huang, Z., Harata, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+genotyping+of+animals+followed+by+establishing+primary+cultures+of+brain+neurons.">Rapid genotyping of animals followed by establishing primary cultures of brain neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. 95. (95), e51879 (2015).</li><li>Iyer, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=No+unexpected+CRISPR-Cas9+off-target+activity+revealed+by+trio+sequencing+of+gene-edited+mice.">No unexpected CRISPR-Cas9 off-target activity revealed by trio sequencing of gene-edited mice.</a> PLoS Genetics. 14 (7), 1007503 (2018).</li><li>Nature Medicine. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keep+off-target+effects+in+focus.">Keep off-target effects in focus.</a> Nature Medicine. 24 (8), 1081 (2018).</li><li>Mayer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+EcoRI-activity+of+EcoRI+endonuclease.">Optimization of the EcoRI-activity of EcoRI endonuclease.</a> FEBS Letters. 90 (2), 341-344 (1978).</li><li>Kozak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Point+mutations+close+to+the+AUG+initiator+codon+affect+the+efficiency+of+translation+of+rat+preproinsulin+in+vivo.">Point mutations close to the AUG initiator codon affect the efficiency of translation of rat preproinsulin in vivo.</a> Nature. 308 (5956), 241-246 (1984).</li><li>Kozak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Point+mutations+define+a+sequence+flanking+the+AUG+initiator+codon+that+modulates+translation+by+eukaryotic+ribosomes.">Point mutations define a sequence flanking the AUG initiator codon that modulates translation by eukaryotic ribosomes.</a> Cell. 44 (2), 283-292 (1986).</li><li>Basheer, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+response+protein+GJA1-20k+promotes+mitochondrial+biogenesis,+metabolic+quiescence,+and+cardioprotection+against+ischemia/reperfusion+injury.">Stress response protein GJA1-20k promotes mitochondrial biogenesis, metabolic quiescence, and cardioprotection against ischemia/reperfusion injury.</a> JCI Insight. 3 (20), 121900 (2018).</li><li>Shimura, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+mitochondrial+fission+induced+by+stress-responsive+protein+GJA1-20k.">Protective mitochondrial fission induced by stress-responsive protein GJA1-20k.</a> Elife. 10, 69207 (2021).</li></ol>

Un modelo de ratón modificado genéticamente es un enfoque común para comprender la función del gen. Sin embargo, dado que la isoforma traducida internamente GJA1-20k se traduce del mismo ARNm Gja1 que cx43 de longitud completa, se ideó una estrategia creativa para retener la expresión de Cx43 de longitud completa y suprimir la expresión de GJA1-20k. El enfoque se basa en una mutación del codón de inicio interno de GJA1-20k. Con una mutación de un solo punto, M213 se cambió a L en el ARNm de Gja1</...

La conexina 43 (Cx43) de longitud completa y la isoforma truncada N-terminal, GJA1-20k, codificadas por el mismo ARNm GJA1, pero utilizan diferentes codones de inicio1 para iniciar la traducción. La traducción de Cx43 se produce en el primer codón de inicio de AUG, mientras que la traducción de GJA1-20k se inicia en el AUG en el residuo 213. Anteriormente se encontró que GJA1-20k tiene funciones esenciales para el tráfico de Cx43 de longitud completa, la estabilización de la actina y la regulación de la morfología mitocondrial in vitro 1,2,3.
Para comprender el papel de GJA1-20k in vivo, se generó un modelo de ratón GJA1-20k "knock-out" que conservó la capacidad de crear Cx43 de longitud completa. El enfoque consistió en utilizar el sistema CRISPR-Cas9 para sustituir el único residuo en 213 de una metionina (M) a una leucina (L) (Gja1M213L/M213L)4. Una mutación interna de M a L disminuye drásticamente la probabilidad de que ocurra la traducción interna, pero conserva la traducción y la función de la proteína4 de longitud completa. Debido a que el tipo salvaje (WT) y el alelo mutado tienen tamaños idénticos y productos de ARNm casi idénticos, existe una dificultad considerable para confirmar el genotipo en los ratones. La secuenciación del ADN puede identificar la mutación, pero es demasiado costosa y requiere demasiado tiempo para el uso rutinario. En general, se han establecido varios métodos de genotipado más rápido, como la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-PCR), la minisecuenciación-ligadura, el análisis de fusión de alta resolución y el sistema de mutación refractaria de amplificación tetra-primer PCR (ARMS-PCR)5,6,7,8. Sin embargo, estos métodos alternativos requieren múltiples pasos, recursos únicos y / o varios conjuntos de cebadores específicos que pueden inducir productos de PCR no específicos.
Este protocolo introduce un enfoque detallado de selección y edición de genes por parte de CRISPR-Cas9 para crear una sola mutación de aminoácidos, y se presenta un genotipado rápido para confirmar la mutación. La identificación del genotipo implica el uso creativo de enzimas de restricción que utilizan solo un conjunto único de cebadores para identificar el gen objetivo. Se remite a los lectores a la Referencia4 para observar el profundo efecto electrofisiológico de la muerte súbita cardíaca causada por una mutación de sustituciónGja1 M213L / M213L de un residuo que aún genera una proteína de longitud completa pero no genera una isoforma de truncamiento traducida internamente más pequeña. Este protocolo ayudará a que otros modelos de ratones utilicen una mutación puntual para disminuir la traducción interna de una isoforma de interés mientras conservan la expresión de la proteína endógena de longitud completa.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL 8-Strip PCR tube</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1148A28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-038</td>
			<td>For pronuclear micorinjection buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x CutSmart buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7204S</td>
			<td>Digestion buffer for NlaIII</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Tris-HCl pH 7.5</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15567-027</td>
			<td>For pronuclear micorinjection buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50x TAE Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>24710-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Thermal cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>Model # 9902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>664</td>
			<td>mouse strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemidoc MP imaging system</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td>To take gel image by 302 nm UV light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eSpCas9 protein</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>ESPCAS9PRO-50UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Lading Dye Purple (6x)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7024S</td>
			<td>Loading buffer for electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gloves</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hCG (human chorionic gonadotropin)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>23-073-425G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>H3884-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Lab software</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td>To analyze gel image</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted stereo microscope whit plasDIC</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axiovert A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA Mouse Genotyping Kits</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>KK7352</td>
			<td>For tissue or cell lysis, DNA extraction, and PCR master mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KSOM</td>
			<td>LifeGlobal</td>
			<td>ZEKS-050</td>
			<td>embryo culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab coart</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M2 medium</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>MR015D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NlaIII</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0125S</td>
			<td>To digest PCR product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9937</td>
			<td>To dilute reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin oil</td>
			<td>Nacalai USA</td>
			<td>2613785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plugged 20 &#956;L fine pipette tip</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>02-707-171</td>
			<td>To pick up blastocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSG (pregnant mare&#8217;s serum gonadotropin)</td>
			<td>ProSpec-Tany</td>
			<td>HOR-272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9760G</td>
			<td>For pronuclear micorinjection buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR safe DNA Gel Stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S33102</td>
			<td>To detect bands in gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tracrRNA</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>U-002000-120</td>
			<td>Guid RNA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

removal of an internal translational start site from mrna while retaining expression of the full-length protein

El sistema de edición de genes CRISPR-Cas9, basado en mecanismos de reparación del genoma, permite la generación de modelos de ratón modificados genéticamente de forma más rápida y sencilla en relación con la recombinación homóloga tradicional. El sistema CRISPR-Cas9 es particularmente atractivo cuando se desea una mutación de un solo punto. La proteína de unión de brecha, Connexin 43 (Cx43), está codificada por el gen Gja1, que tiene un solo exón codificante y no se puede empalmar. Sin embargo, Gja1 produce no solo la proteína Cx43 de longitud completa, sino hasta seis isoformas truncadas N-terminales mediante un proceso conocido como traducción interna, el resultado de la iniciación de la traducción ribosómica en los sitios de inicio internos de AUG (metionina). GJA1-20k es la isoforma truncada más comúnmente generada de Cx43 iniciada en el codón AUG en la posición 213 del ARNm Gja1. Debido a que el residuo 213 ocurre al final del último dominio transmembrana de Cx43, GJA1-20k es efectivamente la cola C-terminal de 20 kDa de Cx43 como una proteína independiente. Investigadores anteriores identificaron, en células, que un papel crítico de GJA1-20k es facilitar el tráfico de hemicanales de unión de brecha Cx43 de longitud completa a la membrana plasmática. Para examinar este fenómeno in vivo, se generó un ratón mutante con una mutación puntual Gja1 que reemplaza el ATG (Metionina) en el residuo 213 por TTA (mutación Leucina, M213L). El resultado de M213L es que el ARNm de Gja1 y el Cx43 de longitud completa todavía se generan, pero la traducción de Gja1-20k se reduce significativamente. Este informe se centra en la elección del sitio de la enzima de restricción para desarrollar un modelo de ratón mutado en un aminoácido (Gja1 M213L / M213L). Este protocolo describe ratones modificados genéticamente por el sistema CRISPR-Cas9 y el genotipado rápido mediante la combinación de PCR y tratamientos con enzimas de restricción.

El sistema de edición de genes CRISPR/Cas9 produce una mutación ATG a TTA y una mutación silenciosa de TCC a TCG en 56.264.279 a 56.264.281 y en 56.264.291 a 56.264.293 en el cromosoma 10 del ratón, o en 869 a 871 y 881 a 883 en el ARNm de Gja1, respectivamente. Esas mutaciones dan como resultado una mutación de metionina 213 a leucina (M213L) en la proteína GJA1 y la mutación TTC a TTG interrumpe una secuencia PAM cercana para evitar la edición no deseada del gen (Figura 1). Los det...

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Removal of an Internal Translational Start Site from mRNA While Retaining Expression of the Full-Length Protein

El presente protocolo describe una única mutación M213L en Gja1 que conserva la generación completa de Connexin43 pero evita la traducción de la isoforma GJA1-20k traducida internamente más pequeña.

Eliminación de un sitio de inicio traslacional interno del ARNm mientras se conserva la expresión de la proteína de longitud completa

The CRISPR-Cas9 gene-editing system, based on genome repair mechanisms, enables the generation of gene-modified mouse models more quickly and easily ...

La dificultad con una sola sustitución de residuos es genotipar animales de manera eficiente a pesar de la diferencia en un solo residuo. El uso especial de una enzima de restricción agrega solo un paso único, rápido y de bajo costo al genotipado típico basado en PCR. Este protocolo se puede aplicar a cualquier otro modelo de ratón con un punto de mutación si la secuencia objetivo es reconocida por una enzima de restricción, que suele ser el caso.Corte de uno a tres milímetros de la punta de la cola con tijeras limpias y transfiéralo a un tubo de PCR de ocho tiras de 0.2 mililitros. Después de contener la muestra de cola como se describe en el manuscrito, guárdela a T-menos 20 grados Celsius hasta la extracción, hasta aproximadamente una semana. Agregue 100 microlitros de solución de lisis tisular por tubo y mezcle bien, seguido de spin-down usando una minicentrífuga de mesa a 2, 200 veces G durante 10 segundos a temperatura ambiente.Asegúrese de que las muestras de cola estén sumergidas en la solución. Coloque los tubos en un conjunto de termocicladores programando los parámetros para la lisis del tejido, la inactivación y la sujeción. Guarde el lisado tisular a cuatro grados centígrados durante un máximo de una semana si la PCR no se puede realizar de inmediato.Prepare una solución de PCR que contenga cinco microlitros de agua libre de nucleasas, 0,75 microlitros de cebadores de 10 micromolares hacia adelante y hacia atrás, y 7,5 microlitros de mezcla maestra de PCR por muestra en un nuevo tubo de PCR. Añadir un microlitro del lisado tisular previamente preparado a la solución de PCR. Mezcle bien la solución de PCR y gire hacia abajo con una minicentrífuga de mesa a 2, 200 veces G durante 10 segundos a temperatura ambiente.Coloque los tubos en un termociclador programado. Una vez que se complete la reacción, almacene los productos de PCR a cuatro grados Celsius durante uno o dos meses o aproximadamente un año a menos 20 grados Celsius. Prepare la solución enzimática que contiene siete microlitros de agua libre de nucleasas, dos microlitros de tampón CutSmart a una fuerza de 10X y un microlitro de enzima de restricción NlaIII.Si hay varias muestras, multiplica cada contenido para hacer la mezcla y alícuota 10 microlitros por tubo. Añadir 10 microlitros de producto pcr previamente obtenido a la solución enzimática por tubo. Mezcle bien y gire hacia abajo con la minicentrífuga de mesa como se demostró anteriormente.Coloque los tubos en un termociclador o bloque de calor programado. Almacene el producto después de la incubación en condiciones frías. Agregue 0.75 gramos de agarosa en 50 mililitros de tampón TAE de una sola fuerza.Mezclar y calentar la agarosa en el microondas hasta que se disuelva por completo. Después de enfriarlo, agregue cinco microlitros de tinción de ADN y mezcle suavemente. Vierta 25 mililitros del gel de agarosa en el molde de gel y permita que el gel se solidifique.Cargue 10 microlitros de producto pcrendido digerido al pozo. Haga funcionar el gel con 100 voltios durante 35 minutos. Imagen del gel de agarosa bajo luz ultravioleta.La electroforesis de agarosa realizada utilizando el producto de PCR digerido dio como resultado varias bandas de diferentes tamaños en cada genotipo, con dos bandas en tipo salvaje, tres en heterocigotos y una en homocigotos, respectivamente. La inyección de prueba con análisis de blastocistos dio como resultado una tasa de éxito del 76,9% en la inyección de 50 nanogramos por microlitro de los oligos donantes, y una tasa de éxito del 25% en la inyección de 25 nanogramos por microlitro de los mismos oligos donantes, respectivamente. Finalmente, inyectando 50 nanogramos por microlitro de los oligos donantes con precipitación de etanol se obtuvieron animales fundadores con una tasa de éxito del 50%.La purificación de oligo donantes por precipitación de etanol redujo la toxicidad al tiempo que mantuvo una alta eficiencia de edición del genoma. El manejo cuidadoso y la adición de una baja cantidad de reactivos es muy importante. Asegúrese de que se agreguen correctamente y se mezclen bien.

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The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins

GST-Su purificación: A dos pasos Affinity Protocolo Purificación Cediendo largos proteínas purificadas

Key assays in enzymology for the biochemical characterization of proteins in vitro necessitate high concentrations of the purified protein of interest. ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Florecimiento extracción de proteínas de levadura y purificación para el Estudio de la función, las interacciones y modificaciones post-traduccionales

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Identificación de modificaciones post-traduccionales de la proteína vegetal Complejos

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Screening siRNA para identificar ubiquitina y reguladores del sistema ubiquitina-como de las vías biológicas en células de mamífero en cultivo

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

Síntesis in vitro de ARNm modificado para la inducción de la expresión proteica en las células humanas

The exogenous delivery of coding synthetic messenger RNA (mRNA) for induction of protein synthesis in desired cells has enormous potential in the fields ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Fluorescente verde a base de proteína Expresión Proyección de proteínas de membrana en<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...