Name: removal of an internal translational start site from mrna while retaining expression of the full-length protein
Uploaded: 2022-03-16T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Removal of an Internal Translational Start Site from mRNA While Retaining Expression of the Full-Length Protein at JoVE.com

Projektet stöddes av National Institutes of Health-bidrag (R01HL152691, R01HL138577 och R01HL159983) till RMS.

"Alla djurvårds- och studieprotokoll godkändes av Institutional Animal Care and Use Committees of Cedars-Sinai Medical Center och University of Utah. C57BL/6J honmöss erhållna från kommersiella källor vid 8-9 veckors ålder (se materialtabell) användes för experimenten.
1. Förberedelse för geninriktning
<ol><li>Välj guidens målsekvens runt den riktade mutationsplatskodningen M213 med hjälp av CRISPOR-webbalgoritmen<sup class="xr...

<ol>
	<li>Smyth, J. W., Shaw, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoregulation+of+connexin43+gap+junction+formation+by+internally+translated+isoforms.">Autoregulation of connexin43 gap junction formation by internally translated isoforms.</a> Cell Reports. 5 (3), 611-618 (2013).</li><li>Basheer, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GJA1-20k+arranges+actin+to+guide+Cx43+delivery+to+cardiac+intercalated+discs.">GJA1-20k arranges actin to guide Cx43 delivery to cardiac intercalated discs.</a> Circulation Research. 121 (9), 1069-1080 (2017).</li><li>Fu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cx43+isoform+GJA1-20k+promotes+microtubule+dependent+mitochondrial+transport.">Cx43 isoform GJA1-20k promotes microtubule dependent mitochondrial transport.</a> Frontiers in Physiology. 8, 905 (2017).</li><li>Xiao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auxiliary+trafficking+subunit+GJA1-20k+protects+connexin-43+from+degradation+and+limits+ventricular+arrhythmias.">Auxiliary trafficking subunit GJA1-20k protects connexin-43 from degradation and limits ventricular arrhythmias.</a> Journal of Clinical Investigation. 130 (9), 4858-4870 (2020).</li><li>Syvanen, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+gels+to+chips:+&amp;#34;minisequencing&amp;#34;+primer+extension+for+analysis+of+point+mutations+and+single+nucleotide+polymorphisms.">From gels to chips: &amp;#34;minisequencing&amp;#34; primer extension for analysis of point mutations and single nucleotide polymorphisms.</a> Human Mutation. 13 (1), 1-10 (1999).</li><li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+SNP+discovery+in+tetraploid+alfalfa+using+454+sequencing+and+high+resolution+melting+analysis.">Genome-wide SNP discovery in tetraploid alfalfa using 454 sequencing and high resolution melting analysis.</a> BMC Genomics. 12, 1-11 (2011).</li><li>Han, Y., Khu, D. M., Monteros, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+melting+analysis+for+SNP+genotyping+and+mapping+in+tetraploid+alfalfa+(Medicago+sativa+L.).">High-resolution melting analysis for SNP genotyping and mapping in tetraploid alfalfa (Medicago sativa L.).</a> Molecular Breeding. 29 (2), 489-501 (2012).</li><li>Peng, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+and+quick+PCR-based+method+to+genotype+mice+with+a+leptin+receptor+mutation+(db/db+mice).">A novel and quick PCR-based method to genotype mice with a leptin receptor mutation (db/db mice).</a> Acta Pharmacologica Sinica. 39 (1), 117-123 (2018).</li><li>Haeussler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+off-target+and+on-target+scoring+algorithms+and+integration+into+the+guide+RNA+selection+tool+CRISPOR.">Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR.</a> Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).</li><li>Concordet, J. P., Haeussler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPOR:+Intuitive+guide+selection+for+CRISPR/Cas9+genome+editing+experiments+and+screens.">CRISPOR: Intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens.</a> Nucleic Acids Research. 46 (1), 242-245 (2018).</li><li>Hsu, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+targeting+specificity+of+RNA-guided+Cas9+nucleases.">DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.</a> Nature Biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>Paquet, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+introduction+of+specific+homozygous+and+heterozygous+mutations+using+CRISPR/Cas9.">Efficient introduction of specific homozygous and heterozygous mutations using CRISPR/Cas9.</a> Nature. 533 (7601), 125-129 (2016).</li><li>Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , (2014).</li><li>Pomp, D., Critser, E. S., Rutledge, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lower+sodium+lactate+in+Whitten's+medium+improves+in+vitro+developmental+capacity+of+one-cell+mouse+embryos.">Lower sodium lactate in Whitten's medium improves in vitro developmental capacity of one-cell mouse embryos.</a> Theriogenology. 29 (5), 1019-1025 (1988).</li><li>Summers, M. C., McGinnis, L. K., Lawitts, J. A., Raffin, M., Biggers, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IVF+of+mouse+ova+in+a+simplex+optimized+medium+supplemented+with+amino+acids.">IVF of mouse ova in a simplex optimized medium supplemented with amino acids.</a> Human Reproduction. 15 (8), 1791-1801 (2000).</li><li>Green, M. R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition). , (2012).</li><li>Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Huang, Z., Harata, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+genotyping+of+animals+followed+by+establishing+primary+cultures+of+brain+neurons.">Rapid genotyping of animals followed by establishing primary cultures of brain neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. 95. (95), e51879 (2015).</li><li>Iyer, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=No+unexpected+CRISPR-Cas9+off-target+activity+revealed+by+trio+sequencing+of+gene-edited+mice.">No unexpected CRISPR-Cas9 off-target activity revealed by trio sequencing of gene-edited mice.</a> PLoS Genetics. 14 (7), 1007503 (2018).</li><li>Nature Medicine. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keep+off-target+effects+in+focus.">Keep off-target effects in focus.</a> Nature Medicine. 24 (8), 1081 (2018).</li><li>Mayer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+EcoRI-activity+of+EcoRI+endonuclease.">Optimization of the EcoRI-activity of EcoRI endonuclease.</a> FEBS Letters. 90 (2), 341-344 (1978).</li><li>Kozak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Point+mutations+close+to+the+AUG+initiator+codon+affect+the+efficiency+of+translation+of+rat+preproinsulin+in+vivo.">Point mutations close to the AUG initiator codon affect the efficiency of translation of rat preproinsulin in vivo.</a> Nature. 308 (5956), 241-246 (1984).</li><li>Kozak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Point+mutations+define+a+sequence+flanking+the+AUG+initiator+codon+that+modulates+translation+by+eukaryotic+ribosomes.">Point mutations define a sequence flanking the AUG initiator codon that modulates translation by eukaryotic ribosomes.</a> Cell. 44 (2), 283-292 (1986).</li><li>Basheer, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+response+protein+GJA1-20k+promotes+mitochondrial+biogenesis,+metabolic+quiescence,+and+cardioprotection+against+ischemia/reperfusion+injury.">Stress response protein GJA1-20k promotes mitochondrial biogenesis, metabolic quiescence, and cardioprotection against ischemia/reperfusion injury.</a> JCI Insight. 3 (20), 121900 (2018).</li><li>Shimura, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+mitochondrial+fission+induced+by+stress-responsive+protein+GJA1-20k.">Protective mitochondrial fission induced by stress-responsive protein GJA1-20k.</a> Elife. 10, 69207 (2021).</li></ol>

En genmodifierad musmodell är ett vanligt tillvägagångssätt för att förstå genfunktionen. Men eftersom GJA1-20k internt översatt isoform översätts från samma Gja1 mRNA som Cx43 i full längd, utarbetades en kreativ strategi för att behålla Cx43-uttryck i full längd men ändå undertrycka GJA1-20k-uttryck. Tillvägagångssättet är baserat på en mutation av det interna startkodonet GJA1-20k. Med en enda punktmutation byttes M213 till L på Gja1 mRNA, vilket lyckades undertrycka GJA1-20k-u...

Connexin 43 (Cx43) i full längd och N-terminus stympad isoform, GJA1-20k, kodad av samma GJA1 mRNA men använder olika startkodoner1 för att initiera översättning. Cx43-översättning sker vid det första AUG-startkodonet, medan GJA1-20k-översättningen initieras vid AUG vid rest 213. Det har tidigare visat sig att GJA1-20k har viktiga roller för Cx43-handel i full längd, aktinstabilisering och reglering av mitokondriell morfologi in vitro 1,2,3.
För att förstå rollen som GJA1-20k in vivo genererades en GJA1-20k "knock-out" musmodell som behöll möjligheten att skapa Cx43 i full längd. Tillvägagångssättet var att använda CRISPR-Cas9-systemet för att ersätta den enskilda återstoden vid 213 från en metionin (M) till en leucin (L) (Gja1M213L / M213L)4. En intern M till L-mutation minskar dramatiskt sannolikheten för intern översättning men behåller ändå översättningen och funktionen av protein i full längd4. Eftersom den vilda typen (WT) och den muterade allelen har identiska storlekar och nästan identiska mRNA-produkter, finns det stora svårigheter att bekräfta genotypen hos mössen. DNA-sekvensering kan identifiera mutationen men är för dyr och tidskrävande för rutinmässig användning. I allmänhet har flera snabbare genotypningsmetoder etablerats, såsom realtidspolymeraskedjereaktion (RT-PCR), minisekvensering-ligering, högupplöst smältanalys och tetra-primerförstärkning eldfast mutationssystem PCR (ARMS-PCR)5,6,7,8. Ändå kräver dessa alternativa metoder flera steg, unika resurser och / eller flera specifika primeruppsättningar som kan inducera icke-specifika PCR-produkter.
Detta protokoll introducerar en detaljerad geninriktning och redigeringsmetod av CRISPR-Cas9 för att skapa en enda aminosyramutation, och snabb genotypning presenteras för att bekräfta mutationen. Genotypidentifiering innebär kreativ användning av restriktionsenzymer som endast använder en enda uppsättning primers för att identifiera målgenen. Läsare hänvisas till referens4 för att observera den djupa elektrofysiologiska effekten av plötslig hjärtdöd orsakad av en rest Gja1M213L / M213L substitutionsmutation som fortfarande genererar protein i full längd men misslyckas med att generera en mindre internt översatt trunkeringsisoform. Detta protokoll kommer att bidra till att få andra mössmodeller att använda en punktmutation för att minska den interna översättningen av en isoform av intresse samtidigt som uttrycket av det endogena fullängdsproteinet bibehålls.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL 8-Strip PCR tube</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1148A28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-038</td>
			<td>For pronuclear micorinjection buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x CutSmart buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7204S</td>
			<td>Digestion buffer for NlaIII</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Tris-HCl pH 7.5</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15567-027</td>
			<td>For pronuclear micorinjection buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50x TAE Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>24710-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Thermal cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>Model # 9902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>664</td>
			<td>mouse strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemidoc MP imaging system</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td>To take gel image by 302 nm UV light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eSpCas9 protein</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>ESPCAS9PRO-50UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Lading Dye Purple (6x)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7024S</td>
			<td>Loading buffer for electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gloves</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hCG (human chorionic gonadotropin)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>23-073-425G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>H3884-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Lab software</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td>To analyze gel image</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted stereo microscope whit plasDIC</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axiovert A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA Mouse Genotyping Kits</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>KK7352</td>
			<td>For tissue or cell lysis, DNA extraction, and PCR master mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KSOM</td>
			<td>LifeGlobal</td>
			<td>ZEKS-050</td>
			<td>embryo culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab coart</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M2 medium</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>MR015D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NlaIII</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0125S</td>
			<td>To digest PCR product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9937</td>
			<td>To dilute reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin oil</td>
			<td>Nacalai USA</td>
			<td>2613785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plugged 20 &#956;L fine pipette tip</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>02-707-171</td>
			<td>To pick up blastocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSG (pregnant mare&#8217;s serum gonadotropin)</td>
			<td>ProSpec-Tany</td>
			<td>HOR-272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9760G</td>
			<td>For pronuclear micorinjection buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR safe DNA Gel Stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S33102</td>
			<td>To detect bands in gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tracrRNA</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>U-002000-120</td>
			<td>Guid RNA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

removal of an internal translational start site from mrna while retaining expression of the full-length protein

GENREDIGERINGSSYSTEMET CRISPR-Cas9, baserat på genomreparationsmekanismer, möjliggör generering av genmodifierade musmodeller snabbare och enklare i förhållande till traditionell homolog rekombination. CRISPR-Cas9-systemet är särskilt attraktivt när en enpunktsmutation önskas. Gap junction proteinet, Connexin 43 (Cx43), kodas av genen Gja1, som har en enda kodande exon och inte kan skarvas. Gja1 producerar emellertid inte bara Cx43-protein i full längd utan upp till sex N-terminus trunkerade isoformer genom en process som kallas intern översättning, resultatet av ribosomal översättningsinitiering vid interna AUG (metionin) startplatser. GJA1-20k är den vanligast genererade trunkerade isoformen av Cx43 initierad vid AUG-kodonet vid position 213 av Gja1 mRNA. Eftersom rest 213 inträffar i slutet av den sista transmembrandomänen av Cx43, är GJA1-20k effektivt 20 kDa C-terminus svansen av Cx43 som ett oberoende protein. Tidigare utredare identifierade, i celler, att en kritisk roll för GJA1-20k är att underlätta handel med Cx43-gapkorsningsmikanaler i full längd till plasmamembranet. För att undersöka detta fenomen in vivo genererades en muterad mus med en Gja1-punktmutation som ersätter ATG (metionin) vid rest 213 med TTA (Leucin, M213L-mutation). Resultatet av M213L är att Gja1 mRNA och Cx43 i full längd fortfarande genereras, men översättningen av Gja1-20k reduceras avsevärt. Denna rapport fokuserar på att välja restriktionsenzymstället för att utveckla en musmodell med en aminosyra muterad (Gja1 M213L / M213L). Detta protokoll beskriver genetiskt modifierade möss av CRISPR-Cas9-systemet och snabb genotypning genom att kombinera PCR- och restriktionsenzymbehandlingar.

GENREDIGERINGSSYSTEMET CRISPR/Cas9 producerar en ATG till TTA-mutation och en tyst TCC till TCG-mutation vid 56 264 279 till 56 264 281 och vid 56 264 291 till 56 264 293 på muskromosomen 10, eller vid 869 till 871 respektive 881 till 883 på Gja1 mRNA. Dessa mutationer resulterar i en metionin 213 till leucin (M213L) mutation på GJA1-protein och TTC till TTG-mutationen stör en närliggande PAM-sekvens för att undvika oönskad genupplaga (Figur 1). Detaljerna i mutationen beskrivs i en t...

Watch this Scientific Journal Video about Removal of an Internal Translational Start Site from mRNA While Retaining Expression of the Full-Length Protein at JoVE.com

Removal of an Internal Translational Start Site from mRNA While Retaining Expression of the Full-Length Protein

Det nuvarande protokollet beskriver en enda M213L-mutation i Gja1 som behåller Connexin43-generationen i full längd men förhindrar översättning av den mindre GJA1-20k internt översatta isoformen.

Avlägsnande av ett internt translationellt startplats från mRNA samtidigt som uttrycket av proteinet i full längd bibehålls

The CRISPR-Cas9 gene-editing system, based on genome repair mechanisms, enables the generation of gene-modified mouse models more quickly and easily ...

Svårigheten med en enda restsubstitution är att genotypa djur effektivt trots skillnaden i enstaka rester. Speciell användning av ett restriktionsenzym lägger bara till ett enda, snabbt och billigt steg till typisk PCR-baserad genotypning. Detta protokoll kan tillämpas på alla andra musmodeller med en mutationspunkt om målsekvensen känns igen av ett restriktionsenzym, vilket vanligtvis är fallet.Klipp en till tre millimeter av svansspetsen med ren sax och överför den till ett 0,2 milliliter åtta-remsa PCR-rör. Efter att ha innehåller svansprovet som beskrivs i manuskriptet, förvara det vid T-minus 20 grader Celsius tills extraktionen, upp till ungefär en vecka. Tillsätt 100 mikroliter vävnadslyslösning per rör och blanda väl, följt av spin-down med en bordsminicentrifug vid 2 200 gånger G i 10 sekunder vid rumstemperatur.Se till att svansproverna är nedsänkta i lösningen. Ställ rören på en termisk cykel som ställts in genom att programmera parametrarna för vävnadslys, inaktivering och hållning. Förvara vävnadslysatet vid fyra grader Celsius i upp till en vecka om PCR inte kan utföras omedelbart.Förbered en PCR-lösning som innehåller fem mikroliter nukleasfritt vatten, 0,75 mikroliter 10 mikromolära framåt- och bakåtprimrar och 7,5 mikroliter PCR-masterblandning per prov i ett nytt PCR-rör. Tillsätt en mikroliter av det tidigare beredda vävnadslysatet till PCR-lösningen. Blanda PCR-lösningen väl och snurra ner med en bordsminicentrifug vid 2 200 gånger G i 10 sekunder vid rumstemperatur.Ställ rören på en programmerad termisk cykel. När reaktionen är klar, förvara PCR-produkterna vid fyra grader Celsius i en till två månader eller ungefär ett år vid minus 20 grader Celsius. Förbered enzymlösningen innehållande sju mikroliter nukleasfritt vatten, två mikroliter CutSmart-buffert med 10X styrka och en mikroliter NlaIII-restriktionsenzym.Om det finns flera prover, multiplicera varje innehåll för att göra blandningen och alikvot 10 mikroliter per rör. Tillsätt 10 mikroliter PCR-produkt som tidigare erhållits till enzymlösningen per rör. Blanda väl och snurra ner med bordsskivans minicentrifug som visats tidigare.Ställ rören på en programmerad termisk cykel eller värmeblock. Förvara produkten efter inkubation under kalla förhållanden. Tillsätt 0,75 gram agaros i 50 ml taebuffert med en styrka.Blanda och värm agarosen i mikrovågsugnen tills den löser sig helt. Efter att ha svalnat det, tillsätt fem mikroliter DNA-fläck och blanda försiktigt. Häll 25 ml agarosgel i gelformen och låt gelén stelna.Ladda 10 mikroliter smält PCR-produkt till brunnen. Kör gelén med 100 volt i 35 minuter. Bild agarosgelen under ultraviolett ljus.Agaroselektroforesen utförd med användning av den smälta PCR-produkten resulterade i flera band av olika storlekar i varje genotyp, med två band i vild typ, tre i heterozygot respektive ett i homozygot. Testinjektion med blastocystanalys resulterade i en framgångsgrad på 76,9% vid injektion av 50 nanogram per mikroliter av givaroligos och en 25% framgångsgrad vid injektion av 25 nanogram per mikroliter av samma givaroligos. Slutligen injicerade 50 nanogram per mikroliter av donatoroligos med etanolutfällning erhållna grunddjur med en framgångsgrad på 50%.Rening av oligodonatorer genom etanolutfällning sänkte toxiciteten samtidigt som hög genomredigeringseffektivitet bibehålls. Noggrann hantering och tillsats av en låg mängd reagenser är mycket viktigt. Se till att de är korrekt tillsatta och blandas väl.

Research

JoVE Journal

Biology

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

Beredningen av primära hematopoietisk cell kulturer från Murine Bone Marrow för elektroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Homemade Site Directed Mutagenesis of Whole Plasmids

Homemade Site Riktad mutagenes av Whole Plasmids

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Färgning av proteinerna i geler med Coomassie G-250 utan organiska lösningsmedel och ättiksyra

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

Hjälp av ett automatiserat celltalsräknare att förenkla Studier Gene Expression: siRNA Knockdown av IL-4 beroende genuttryck i Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins

GST-Hans rening: En två-stegs Affinity Purification protokoll Flytfullängds renade proteiner

Key assays in enzymology for the biochemical characterization of proteins in vitro necessitate high concentrations of the purified protein of interest. ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Spirande jästprotein extraktion och rening för studien av funktion, interaktioner, och post-translationella modifieringar

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Identifiering av posttranslationella modifieringar av växtproteinkomplex

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

siRNA Screening för att identifiera Ubiquitin och Ubiquitin-liknande system Regulatorer av biologiska banor i odlade däggdjursceller

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

In vitro Syntes av modifierade mRNA för induktion av proteinuttryck i humana celler

The exogenous delivery of coding synthetic messenger RNA (mRNA) for induction of protein synthesis in desired cells has enormous potential in the fields ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Grönt fluorescerande protein-baserad expressions Screening av membranproteiner i<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...