Name: removal of an internal translational start site from mrna while retaining expression of the full-length protein
Uploaded: 2022-03-16T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Removal of an Internal Translational Start Site from mRNA While Retaining Expression of the Full-Length Protein at JoVE.com

Proje, RMS'ye Ulusal Sağlık Enstitüleri hibeleri (R01HL152691, R01HL138577 ve R01HL159983) tarafından desteklenmiştir.

"Tüm hayvan bakımı ve çalışma protokolleri, Cedars-Sinai Tıp Merkezi ve Utah Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komiteleri tarafından onaylandı. Deneyler için 8-9 haftalıkken ticari kaynaklardan elde edilen C57BL/6J dişi fareler (bakınız Malzeme Tablosu) kullanılmıştır.
1. Gen hedefleme için hazırlık
<ol><li> CRISPOR web algoritması 4,9,10 kullanarak M213'ü kodlayan hedeflenen mutasyo...

<ol>
	<li>Smyth, J. W., Shaw, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoregulation+of+connexin43+gap+junction+formation+by+internally+translated+isoforms.">Autoregulation of connexin43 gap junction formation by internally translated isoforms.</a> Cell Reports. 5 (3), 611-618 (2013).</li><li>Basheer, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GJA1-20k+arranges+actin+to+guide+Cx43+delivery+to+cardiac+intercalated+discs.">GJA1-20k arranges actin to guide Cx43 delivery to cardiac intercalated discs.</a> Circulation Research. 121 (9), 1069-1080 (2017).</li><li>Fu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cx43+isoform+GJA1-20k+promotes+microtubule+dependent+mitochondrial+transport.">Cx43 isoform GJA1-20k promotes microtubule dependent mitochondrial transport.</a> Frontiers in Physiology. 8, 905 (2017).</li><li>Xiao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auxiliary+trafficking+subunit+GJA1-20k+protects+connexin-43+from+degradation+and+limits+ventricular+arrhythmias.">Auxiliary trafficking subunit GJA1-20k protects connexin-43 from degradation and limits ventricular arrhythmias.</a> Journal of Clinical Investigation. 130 (9), 4858-4870 (2020).</li><li>Syvanen, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+gels+to+chips:+&amp;#34;minisequencing&amp;#34;+primer+extension+for+analysis+of+point+mutations+and+single+nucleotide+polymorphisms.">From gels to chips: &amp;#34;minisequencing&amp;#34; primer extension for analysis of point mutations and single nucleotide polymorphisms.</a> Human Mutation. 13 (1), 1-10 (1999).</li><li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+SNP+discovery+in+tetraploid+alfalfa+using+454+sequencing+and+high+resolution+melting+analysis.">Genome-wide SNP discovery in tetraploid alfalfa using 454 sequencing and high resolution melting analysis.</a> BMC Genomics. 12, 1-11 (2011).</li><li>Han, Y., Khu, D. M., Monteros, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+melting+analysis+for+SNP+genotyping+and+mapping+in+tetraploid+alfalfa+(Medicago+sativa+L.).">High-resolution melting analysis for SNP genotyping and mapping in tetraploid alfalfa (Medicago sativa L.).</a> Molecular Breeding. 29 (2), 489-501 (2012).</li><li>Peng, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+and+quick+PCR-based+method+to+genotype+mice+with+a+leptin+receptor+mutation+(db/db+mice).">A novel and quick PCR-based method to genotype mice with a leptin receptor mutation (db/db mice).</a> Acta Pharmacologica Sinica. 39 (1), 117-123 (2018).</li><li>Haeussler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+off-target+and+on-target+scoring+algorithms+and+integration+into+the+guide+RNA+selection+tool+CRISPOR.">Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR.</a> Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).</li><li>Concordet, J. P., Haeussler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPOR:+Intuitive+guide+selection+for+CRISPR/Cas9+genome+editing+experiments+and+screens.">CRISPOR: Intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens.</a> Nucleic Acids Research. 46 (1), 242-245 (2018).</li><li>Hsu, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+targeting+specificity+of+RNA-guided+Cas9+nucleases.">DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.</a> Nature Biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>Paquet, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+introduction+of+specific+homozygous+and+heterozygous+mutations+using+CRISPR/Cas9.">Efficient introduction of specific homozygous and heterozygous mutations using CRISPR/Cas9.</a> Nature. 533 (7601), 125-129 (2016).</li><li>Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , (2014).</li><li>Pomp, D., Critser, E. S., Rutledge, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lower+sodium+lactate+in+Whitten's+medium+improves+in+vitro+developmental+capacity+of+one-cell+mouse+embryos.">Lower sodium lactate in Whitten's medium improves in vitro developmental capacity of one-cell mouse embryos.</a> Theriogenology. 29 (5), 1019-1025 (1988).</li><li>Summers, M. C., McGinnis, L. K., Lawitts, J. A., Raffin, M., Biggers, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IVF+of+mouse+ova+in+a+simplex+optimized+medium+supplemented+with+amino+acids.">IVF of mouse ova in a simplex optimized medium supplemented with amino acids.</a> Human Reproduction. 15 (8), 1791-1801 (2000).</li><li>Green, M. R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition). , (2012).</li><li>Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Huang, Z., Harata, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+genotyping+of+animals+followed+by+establishing+primary+cultures+of+brain+neurons.">Rapid genotyping of animals followed by establishing primary cultures of brain neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. 95. (95), e51879 (2015).</li><li>Iyer, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=No+unexpected+CRISPR-Cas9+off-target+activity+revealed+by+trio+sequencing+of+gene-edited+mice.">No unexpected CRISPR-Cas9 off-target activity revealed by trio sequencing of gene-edited mice.</a> PLoS Genetics. 14 (7), 1007503 (2018).</li><li>Nature Medicine. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keep+off-target+effects+in+focus.">Keep off-target effects in focus.</a> Nature Medicine. 24 (8), 1081 (2018).</li><li>Mayer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+EcoRI-activity+of+EcoRI+endonuclease.">Optimization of the EcoRI-activity of EcoRI endonuclease.</a> FEBS Letters. 90 (2), 341-344 (1978).</li><li>Kozak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Point+mutations+close+to+the+AUG+initiator+codon+affect+the+efficiency+of+translation+of+rat+preproinsulin+in+vivo.">Point mutations close to the AUG initiator codon affect the efficiency of translation of rat preproinsulin in vivo.</a> Nature. 308 (5956), 241-246 (1984).</li><li>Kozak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Point+mutations+define+a+sequence+flanking+the+AUG+initiator+codon+that+modulates+translation+by+eukaryotic+ribosomes.">Point mutations define a sequence flanking the AUG initiator codon that modulates translation by eukaryotic ribosomes.</a> Cell. 44 (2), 283-292 (1986).</li><li>Basheer, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+response+protein+GJA1-20k+promotes+mitochondrial+biogenesis,+metabolic+quiescence,+and+cardioprotection+against+ischemia/reperfusion+injury.">Stress response protein GJA1-20k promotes mitochondrial biogenesis, metabolic quiescence, and cardioprotection against ischemia/reperfusion injury.</a> JCI Insight. 3 (20), 121900 (2018).</li><li>Shimura, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+mitochondrial+fission+induced+by+stress-responsive+protein+GJA1-20k.">Protective mitochondrial fission induced by stress-responsive protein GJA1-20k.</a> Elife. 10, 69207 (2021).</li></ol>

Gen modifiye edilmiş bir fare modeli, gen fonksiyonunu anlamak için yaygın bir yaklaşımdır. Bununla birlikte, GJA1-20k dahili olarak çevrilmiş izoform, tam uzunluktaki Cx43 ile aynı Gja1 mRNA'sından çevrildiğinden, tam uzunlukta Cx43 ekspresyonunu korumak ancak GJA1-20k ekspresyonunu bastırmak için yaratıcı bir strateji geliştirilmiştir. Yaklaşım, GJA1-20k'nın iç başlangıç kodonunun mutasyonuna dayanmaktadır. Tek noktalı bir mutasyonla M213, GJA1-20k ekspresyonunu baskılamayı başara...

Tam uzunluktaki Connexin 43 (Cx43) ve N-terminus kesilmiş izoform, GJA1-20k, aynı GJA1 mRNA tarafından kodlanır, ancak translasyonu başlatmak için farklı başlangıç kodonları1 kullanır. Cx43 çevirisi ilk AUG başlangıç kodonunda gerçekleşirken, GJA1-20k çevirisi AUG'da kalıntı 213'te başlar. Daha önce GJA1-20k'nın tam uzunlukta Cx43 kaçakçılığı, aktin stabilizasyonu ve mitokondriyal morfolojinin in vitro 1,2,3 düzenlenmesi için önemli rollere sahip olduğu bulunmuştur.
GJA1-20k'nın in vivo rolünü anlamak için, tam uzunlukta Cx43 oluşturma yeteneğini koruyan bir GJA1-20k "nakavt" fare modeli oluşturuldu. Yaklaşım, 213'teki tek kalıntıyı bir Metiyonin'den (M) bir Lösin (L) 'ye (Gja1 M213L / M213L) (Gja1M213L / M213L) 4 ikame etmek için CRISPR-Cas9 sistemini kullanmaktı. Bir iç M'den L'ye mutasyon, iç translasyonun meydana gelme olasılığını önemli ölçüde azaltır, ancak tam uzunlukta protein4'ün translasyonunu ve işlevini korur. Vahşi tip (WT) ve mutasyona uğramış alel aynı boyutlara ve neredeyse aynı mRNA ürünlerine sahip olduğundan, farelerde genotipi doğrulamada önemli zorluklar vardır. DNA dizilimi mutasyonu tanımlayabilir, ancak rutin kullanım için çok pahalı ve zaman alıcıdır. Genel olarak, Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu (RT-PCR), minisekanslama-ligasyon, yüksek çözünürlüklü erime analizi ve tetra-primer amplifikasyon refrakter mutasyon sistemi PCR (ARMS-PCR)5,6,7,8 gibi birkaç hızlı genotipleme yöntemi oluşturulmuştur. Yine de bu alternatif yöntemler, spesifik olmayan PCR ürünlerini indükleyebilecek birden fazla adım, benzersiz kaynaklar ve / veya birkaç spesifik primer seti gerektirir.
Bu protokol, tek bir amino asit mutasyonu oluşturmak için CRISPR-Cas9 tarafından ayrıntılı bir gen hedefleme ve düzenleme yaklaşımı sunar ve mutasyonu doğrulamak için hızlı genotipleme sunulur. Genotip tanımlama, hedef geni tanımlamak için sadece tek bir primer seti kullanan kısıtlama enzimlerinin yaratıcı kullanımını içerir. Okuyucular, hala tam uzunlukta protein üreten, ancak daha küçük bir dahili olarak çevrilmiş kesme izoformu üretemeyen bir kalıntıGja1 M213L / M213L ikame mutasyonunun neden olduğu ani kardiyak ölümün derin elektrofizyolojik etkisini gözlemlemek için Referans4'e yönlendirilmektedir. Bu protokol, diğer fare modellerinin, endojen tam uzunluktaki proteinin ekspresyonunu korurken, ilgilenilen bir izoformun iç translasyonunu azaltmak için bir nokta mutasyonu kullanmasına yardımcı olacaktır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL 8-Strip PCR tube</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1148A28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-038</td>
			<td>For pronuclear micorinjection buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x CutSmart buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7204S</td>
			<td>Digestion buffer for NlaIII</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Tris-HCl pH 7.5</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15567-027</td>
			<td>For pronuclear micorinjection buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50x TAE Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>24710-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Thermal cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>Model # 9902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>664</td>
			<td>mouse strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemidoc MP imaging system</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td>To take gel image by 302 nm UV light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eSpCas9 protein</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>ESPCAS9PRO-50UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Lading Dye Purple (6x)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7024S</td>
			<td>Loading buffer for electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gloves</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hCG (human chorionic gonadotropin)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>23-073-425G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>H3884-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Lab software</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td>To analyze gel image</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted stereo microscope whit plasDIC</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axiovert A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA Mouse Genotyping Kits</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>KK7352</td>
			<td>For tissue or cell lysis, DNA extraction, and PCR master mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KSOM</td>
			<td>LifeGlobal</td>
			<td>ZEKS-050</td>
			<td>embryo culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab coart</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M2 medium</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>MR015D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NlaIII</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0125S</td>
			<td>To digest PCR product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9937</td>
			<td>To dilute reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin oil</td>
			<td>Nacalai USA</td>
			<td>2613785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plugged 20 &#956;L fine pipette tip</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>02-707-171</td>
			<td>To pick up blastocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSG (pregnant mare&#8217;s serum gonadotropin)</td>
			<td>ProSpec-Tany</td>
			<td>HOR-272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9760G</td>
			<td>For pronuclear micorinjection buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR safe DNA Gel Stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S33102</td>
			<td>To detect bands in gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tracrRNA</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>U-002000-120</td>
			<td>Guid RNA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

removal of an internal translational start site from mrna while retaining expression of the full-length protein

Genom onarım mekanizmalarına dayanan CRISPR-Cas9 gen düzenleme sistemi, gen modifiye fare modellerinin geleneksel homolog rekombinasyona göre daha hızlı ve kolay bir şekilde üretilmesini sağlar. CRISPR-Cas9 sistemi, tek noktalı bir mutasyon istendiğinde özellikle çekicidir. Boşluk bağlantı proteini Connexin 43 (Cx43), tek bir kodlayan ekzona sahip olan ve eklenemeyen Gja1 geni tarafından kodlanır. Bununla birlikte, Gja1 sadece tam uzunlukta Cx43 proteini üretmekle kalmaz, aynı zamanda iç AUG (Metiyonin) başlangıç bölgelerinde ribozomal translasyonun başlatılmasının sonucu olan iç çeviri olarak bilinen bir işlemle altı N-terminus kesilmiş izoform üretir. GJA1-20k, Gja1 mRNA'nın 213 pozisyonunda AUG kodonunda başlatılan Cx43'ün en yaygın olarak üretilen kesilmiş izoformudur. Kalıntı 213, Cx43'ün son transmembran alanının sonunda meydana geldiğinden, GJA1-20k, bağımsız bir protein olarak Cx43'ün 20 kDa C-terminus kuyruğudur. Önceki araştırmacılar, hücrelerde, GJA1-20k'nın kritik bir rolünün, tam uzunlukta Cx43 boşluk bağlantı hemikanallarının plazma zarına ticaretini kolaylaştırmak olduğunu tespit ettiler. Bu fenomeni in vivo olarak incelemek için, kalıntı 213'teki ATG'yi (Metiyonin) TTA (Lösin, M213L mutasyonu) ile değiştiren Gja1 nokta mutasyonuna sahip mutant bir fare üretildi. M213L'nin sonucu, Gja1 mRNA ve tam uzunlukta Cx43'ün hala üretilmesidir, ancak Gja1-20k'nın translasyonu önemli ölçüde azalır. Bu rapor, bir amino asit mutasyona uğramış (Gja1M213L / M213L) fare modeli geliştirmek için kısıtlama enzim bölgesini seçmeye odaklanmaktadır. Bu protokol, CRISPR-Cas9 sistemi tarafından genetiği değiştirilmiş fareleri ve PCR ve restriksiyon enzim tedavilerini birleştirerek hızlı genotiplemeyi tanımlar.

CRISPR / Cas9 gen düzenleme sistemi, sırasıyla 56.264.279 ila 56.264.281 ve fare kromozomu 10'da 56.264.291 ila 56.264.293 veya Gja1 mRNA'da 869 ila 871 ve 881 ila 883'te bir ATG'den TTA'ya mutasyon ve TCG mutasyonuna sessiz bir TCC üretir. Bu mutasyonlar, GJA1 proteini üzerinde bir Metiyonin 213 ila Lösin (M213L) mutasyonu ile sonuçlanır ve TTC'den TTG'ye mutasyon, istenmeyen gen baskısını önlemek için yakındaki bir PAM dizisini bozar (Şekil 1). Mutasyonun ayrıntıları önc...

Watch this Scientific Journal Video about Removal of an Internal Translational Start Site from mRNA While Retaining Expression of the Full-Length Protein at JoVE.com

Removal of an Internal Translational Start Site from mRNA While Retaining Expression of the Full-Length Protein

Mevcut protokol, Gja1'de tam uzunlukta Connexin43 jenerasyonunu koruyan, ancak daha küçük GJA1-20k dahili olarak çevrilmiş izoformun translasyonunu önleyen tek bir M213L mutasyonunu tanımlamaktadır.

Tam Boy Proteinin İfadesini Korurken mRNA'dan Bir İç Translasyonel Başlangıç Bölgesinin Çıkarılması

The CRISPR-Cas9 gene-editing system, based on genome repair mechanisms, enables the generation of gene-modified mouse models more quickly and easily ...

Tek bir kalıntı ikamesinin zorluğu, tek kalıntıdaki farklılığa rağmen hayvanları verimli bir şekilde genotiplemektir. Bir kısıtlama enziminin özel kullanımı, tipik PCR tabanlı genotiplemeye sadece tek, hızlı ve düşük maliyetli bir adım ekler. Bu protokol, hedef dizi genellikle böyle olan bir kısıtlama enzimi tarafından tanınırsa, mutasyon noktasına sahip başka herhangi bir fare modeline uygulanabilir.Kuyruk ucunun bir ila üç milimetresini temiz makasla kesin ve 0,2 mililitrelik sekiz şeritli PCR tüpüne aktarın. Kuyruk örneğini el yazmasında açıklandığı gibi içerdikten sonra, ekstraksiyona kadar, yaklaşık bir haftaya kadar T-eksi 20 santigrat derecede saklayın. Tüp başına 100 mikrolitre doku lizis çözeltisi ekleyin ve iyice karıştırın, ardından oda sıcaklığında 10 saniye boyunca 2.200 kez G'de bir masa üstü minisantrifüj kullanarak spin-down yapın.Kuyruk numunelerinin çözeltiye batırıldığından emin olun. Tüpleri, doku lizisi, inaktivasyon ve tutma parametrelerini programlayarak bir termal döngü setine ayarlayın. PCR hemen yapılamazsa doku lizatını dört santigrat derecede bir haftaya kadar saklayın.Beş mikrolitre nükleaz içermeyen su, 0.75 mikrolitre 10 mikromolar ileri ve geri primerler ve numune başına 7.5 mikrolitre PCR ana karışımı içeren bir PCR çözeltisini yeni bir PCR tüpüne hazırlayın. Önceden hazırlanmış doku lizatının bir mikrolitresini PCR çözeltisine ekleyin. PCR solüsyonunu iyice karıştırın ve oda sıcaklığında 10 saniye boyunca 2.200 kez G'de bir masa üstü minisantrifüj ile aşağı doğru döndürün.Tüpleri programlanmış bir termal döngüleyiciye yerleştirin. Reaksiyon tamamlandıktan sonra, PCR ürünlerini bir ila iki ay boyunca dört santigrat derecede veya eksi 20 santigrat derecede yaklaşık bir yıl saklayın. Yedi mikrolitre nükleaz içermeyen su, 10X gücünde iki mikrolitre CutSmart tamponu ve bir mikrolitre NlaIII kısıtlama enzimi içeren enzim çözeltisini hazırlayın.Birkaç örnek varsa, karışımı yapmak için her içeriği çarpın ve tüp başına 10 mikrolitre aliquot yapın. Daha önce elde edilen 10 mikrolitre PCR ürününü tüp başına enzim çözeltisine ekleyin. İyice karıştırın ve daha önce gösterildiği gibi masa üstü minisantrifüj ile aşağı doğru döndürün.Tüpleri programlanmış bir termal döngü veya ısı bloğu üzerine ayarlayın. Ürünü inkübasyondan sonra soğuk koşullarda saklayın. 50 mililitre tek mukavemetli TAE tamponuna 0.75 gram agaroz ekleyin.Agarozu mikrodalgada tamamen çözünene kadar karıştırın ve ısıtın. Soğuduktan sonra, beş mikrolitre DNA lekesi ekleyin ve yavaşça karıştırın. Agaroz jelinin 25 mililitresini jel kalıbına dökün ve jelin katılaşmasını bekleyin.Kuyuya 10 mikrolitre sindirilmiş PCR ürünü yükleyin. Jeli 35 dakika boyunca 100 volt ile çalıştırın. Agaroz jelini ultraviyole ışık altında görüntüleyin.Sindirilmiş PCR ürünü kullanılarak gerçekleştirilen agaroz elektroforezi, sırasıyla vahşi tipte iki, heterozigotta üç ve homozigotta bir bant ile her genotipte farklı boyutlarda birkaç bant ile sonuçlandı. Blastosist analizi ile test enjeksiyonu, donör oligoların mikrolitresi başına 50 nanogram enjekte edilmesinde% 76.9'luk bir başarı oranı ve aynı donör oligoların mikrolitresi başına 25 nanogram enjekte edilmesinde% 25'lik bir başarı oranı ile sonuçlandı. Son olarak, donör oligoların mikrolitresi başına 50 nanogramın etanol çökeltilmesi ile enjekte edilmesi, kurucu hayvanların% 50'lik bir başarı oranına sahip olmasını sağlamıştır.Oligo donörlerinin etanol çökeltme ile saflaştırılması, yüksek genom düzenleme verimliliğini korurken toksisiteyi azaltmıştır. Dikkatli kullanım ve düşük miktarda reaktif eklenmesi çok önemlidir. Doğru şekilde eklendiğinden ve iyice karıştırıldığından emin olun.

Research

JoVE Journal

Biology

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

Hazırlık Elektroporasyon murin Kemik İliği itibaren İlköğretim Hematopoetik Hücre Kültürleri

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Biyoloji

Homemade Site Directed Mutagenesis of Whole Plasmids

Tüm Plazmidler Homemade Sitesi Yönetmen Mutagenez

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Organik Solvent ve Asetik Asit olmadan Jeller Coomassie G-250 ile Proteinlerin Boyama

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

Gen İfadesi Çalışmaları basitleştirin Otomatik Hücre Sayıcı kullanma: Namalwa Hücreler IL-4 Bağımlı Gen İfadesi siRNA demonte

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins

GST-His saflaştırma: Tam boy Saflaştırılmış Proteinler Verim iki aşamalı bir saflaştırma protokolü Affinity

Key assays in enzymology for the biochemical characterization of proteins in vitro necessitate high concentrations of the purified protein of interest. ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Fonksiyon Çalışma, Etkileşimler, ve Post-translasyonel değişiklikler için tomurcuklanan Maya Protein Ekstraksiyonu ve Saflaştırılması

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Plant protein kompleksleri, çevirim sonrası değişikliklerin belirlenmesi

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Kültür Memeli Hücrelerde Biyolojik tanımında ubikitin ve Ubiquitin benzeri Sistemi Regülatörleri tanımak siRNA Eleme

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

In vitro sentezi insan hücrelerinde protein sentezlenmesinin uyarımından için mRNA&#39;nın Değiştirilmiş

The exogenous delivery of coding synthetic messenger RNA (mRNA) for induction of protein synthesis in desired cells has enormous potential in the fields ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Membran proteinlerinin Yeşil floresan proteini temelli Ekspresyon elemesinde<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...