该协议使用一种从孵化的蝴蝶卵中采样绒毛膜进行遗传分析的新方法。当其他组织取样技术不切实际、不可用或不允许时，它可能特别有用。该协议的总体成本相对较低，使用易于获取的耗材和靶向残留有机物质，无需暂时捕获或操纵并可能伤害生物体以获取遗传样本。
整个实验方案简单易学，但需要灵巧和对细节的严格关注，特别是成功定位、鉴定和去除非常小的目标样品，以避免样品采集事件之间的交叉污染。首先仔细查看并收集所需与收集相关的用品的完整清单。如果样本采集在多个地点或由多个个人或团队进行，请将所需的所有物资收集并组织到单独的可部署单位中。
向社区科学家或其他负责现场收集的人员运送物资。如果人员不是本地人员，请小心地将耗材装入带有完整运输标签的单独纸板运输箱中并运送。收到包括收集钓具箱在内的收集用品后，请仔细查看层压供应清单并进行完整的清点。
如果缺少任何用品，请通知项目负责人。用180微升裂解缓冲液预填充1.5毫升微量离心管。在每个微量离心管上贴上预先打印的唯一ID标签，并将所有管放入64孔微量离心管储存盒中。
装入后牢固盖紧盖子。确保所有数字设备已充满电，并已包装所有备用电池。在小型冷却器中部分装满冰块，用于现场储存和收集样品的本地运输。
将所有收集用品装入收集钓具箱或类似坚固的防风雨容器中，以便安全运输和合并存储。在进入现场之前，请查看无损基因样本收集协议和详细信息。到达现场后，使用铅笔或全天候笔记录一天中的时间、日期、整体属性名称、特定现场位置名称或描述、GPS 读数（如果有）以及防风雨现场笔记本中所有人员的全名和角色。
为物种特异性目标蝴蝶的幼虫寄主植物的存在找到合适的栖息地。使用智能手机或相机拍摄所有现场、样品采集位置、寄主植物和其他相关信息的详细照片。使用智能手机或其他记录GPS坐标的相机。
全面搜索所有幼虫寄主植物部分，如叶子、花蕾、花朵或发育中的果实，已知是由卵位成年雌蝶选择孵化卵的。对于大多数Lycaenidae，寻找白色孵化的卵，中心有一个明显的孔，类似于新生儿幼虫出现的甜甜圈。寻找颜色较深的未孵化卵，通常是绿色或蓝色，并且将完全完好无损，中间没有孔。
找到孵化的鸡蛋后，戴上丁腈手套。使用无菌和尖锐的镊子，抓住并轻轻地将孵化的鸡蛋从寄主植物上拉出，并将其直接放入预装有裂解缓冲液的标记微量离心管中。同样，可以使用和处理其他组织样本。
确保所有收集的材料完全浸没在每个1.5毫升微量离心管内的裂解缓冲液中。如果需要，在坚硬的表面上轻拍试管的底部以重新浸没任何样品。收集新样品时，丢弃用过的丁腈手套，并用干净的手套替换它们。
每次收集卵子后，仔细清洁镊子尖端，将它们浸入或浸泡在挤压瓶中的 95% 乙醇小瓶中或使用酒精湿巾。每个地点每个寄主植物补丁至少收集五个样本，每个样本包含 1 到 20 个卵，目标是在一个位置总共超过 50 个卵（如果有的话）。将来自同一宿主贴片中多个植物的一到20个孵化卵收集到单个微量离心管中，并牢固地盖上盖子。
对于使用较大草本或木本寄主物种的蝴蝶物种，如果宿主斑块有限，则从同一植物的不同位置收集多个卵。在防风雨现场笔记本中，记录分配的唯一 ID 标签以及样品类型、孵化蛋的大致数量和收集信息。将装有蛋渣样品的封闭微量离心管放回64孔微量离心机储存盒中。
在野外时，将储物盒放在装有冰块的冷却器中。将所有其他收集用品放入收集钓具箱中，以便在站点之间安全、统一地存储和运输。在这160个样品中，成功提取了88个样品，平均浓度为每微升1.67纳克，最高DNA产量为每微升26.8纳克。
按组织类型划分的DNA浓度证实，含有单个卵碎片的样品只有一个卵箱，含有多个卵箱的样本至少有两个病例，病例数从2例到20例不等，平均每个样本5.3例。收集多达563个样本的材料被发送给来自北美东部物种范围九个州的八名保护和社区科学家。材料在 2021 年当地飞行高峰期之前发送了三个多月。
共收到160份卡勒菲利斯虹膜组织样本。至关重要的是尽量减少样品之间的交叉污染，确保收集的样品完全浸没在裂解缓冲液中，并准确记录每个样品的唯一ID标签和收集数据。该协议使社区科学家能够广泛部署和使用，对稀有蝴蝶的现存种群进行无损采样，以帮助进行广泛的遗传结构分析。
