Name: development of organoids from mouse pituitary as in vitro model to explore pituitary stem cell biology
Uploaded: 2022-02-25T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Development of Organoids from Mouse Pituitary as In Vitro Model to Explore Pituitary Stem Cell Biology at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del KU Leuven Research Fund e del Fund for Scientific Research (FWO) - Fiandre. E.L. (11A3320N) e C.N. (1S14218N) sono supportati da una borsa di dottorato della FWO/FWO-SB.

Gli esperimenti sugli animali per questo studio sono stati approvati dal Comitato etico per la sperimentazione animale della KU Leuven (P153/2018). Tutti i topi sono stati ospitati presso la struttura per animali dell'università in condizioni standardizzate (temperatura costante di 23 ± 1,5 ° C, umidità relativa 40% -60% e un ciclo giorno / notte di 12 ore), con accesso all'acqua e al cibo ad libitum.
1. Topi
<ol><li>Utilizzare ceppi di topo disponibili in comme...

<ol>
	<li>Melmed, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The pituitary. 3rd ed. , 1 (2011).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adult+pituitary+contains+a+cell+population+displaying+stem/progenitor+cell+and+early-embryonic+characteristics.">The adult pituitary contains a cell population displaying stem/progenitor cell and early-embryonic characteristics.</a> Endocrinology. 146 (9), 3985-3998 (2005).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pituitary+progenitor+cells+tracked+down+by+side+population+dissection.">Pituitary progenitor cells tracked down by side population dissection.</a> Stem Cells. 27 (5), 1182-1195 (2009).</li><li>Fauquier, T., Rizzoti, K., Dattani, M., Lovell-Badge, R., Robinson, I. C. A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX2-expressing+progenitor+cells+generate+all+of+the+major+cell+types+in+the+adult+mouse+pituitary+gland.">SOX2-expressing progenitor cells generate all of the major cell types in the adult mouse pituitary gland.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (8), 2907-2912 (2008).</li><li>Rizzoti, K., Akiyama, H., Lovell-Badge, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mobilized+adult+pituitary+stem+cells+contribute+to+endocrine+regeneration+in+response+to+physiological+demand.">Mobilized adult pituitary stem cells contribute to endocrine regeneration in response to physiological demand.</a> Cell Stem Cell. 13 (4), 419-432 (2013).</li><li>Andoniadou, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox2++stem/progenitor+cells+in+the+adult+mouse+pituitary+support+organ+homeostasis+and+have+tumor-inducing+potential.">Sox2+ stem/progenitor cells in the adult mouse pituitary support organ homeostasis and have tumor-inducing potential.</a> Cell Stem Cell. 13 (4), 433-445 (2013).</li><li>Nys, C., Vankelecom, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pituitary+disease+and+recovery:+How+are+stem+cells+involved.">Pituitary disease and recovery: How are stem cells involved.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 525 (4), 111176 (2021).</li><li>Schneider, H. J., Aimaretti, G., Kreitschmann-Andermahr, I., Stalla, G. K., Ghigo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypopituitarism.">Hypopituitarism.</a> Lancet. 369 (9571), 1461-1470 (2007).</li><li>Fu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adult+pituitary+shows+stem/progenitor+cell+activation+in+response+to+injury+and+is+capable+of+regeneration.">The adult pituitary shows stem/progenitor cell activation in response to injury and is capable of regeneration.</a> Endocrinology. 153 (7), 3224-3235 (2012).</li><li>Willems, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+in+the+pituitary+after+cell-ablation+injury:+time-related+aspects+and+molecular+analysis.">Regeneration in the pituitary after cell-ablation injury: time-related aspects and molecular analysis.</a> Endocrinology. 157 (2), 705-721 (2016).</li><li>Gremeaux, L., Fu, Q., Chen, J., Vankelecom, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+phenotype+of+the+pituitary+stem/progenitor+cell+compartment+during+the+early-postnatal+maturation+phase+of+the+gland.">Activated phenotype of the pituitary stem/progenitor cell compartment during the early-postnatal maturation phase of the gland.</a> Stem Cells and Development. 21 (5), 801-813 (2012).</li><li>Zhu, X., Tollkuhn, J., Taylor, H., Rosenfeld, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch-dependent+pituitary+SOX2++stem+cells+exhibit+a+timed+functional+extinction+in+regulation+of+the+postnatal+gland.">Notch-dependent pituitary SOX2+ stem cells exhibit a timed functional extinction in regulation of the postnatal gland.</a> Stem Cell Reports. 5 (6), 1196-1209 (2015).</li><li>Russell, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pituitary+stem+cells+produce+paracrine+WNT+signals+to+control+the+expansion+of+their+descendant+progenitor+cells.">Pituitary stem cells produce paracrine WNT signals to control the expansion of their descendant progenitor cells.</a> eLife. 10 (1), 59142 (2021).</li><li>Vennekens, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-6+is+an+activator+of+pituitary+stem+cells+upon+local+damage,+a+competence+quenched+in+the+aging+gland.">Interleukin-6 is an activator of pituitary stem cells upon local damage, a competence quenched in the aging gland.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (25), 2100052118 (2021).</li><li>Mertens, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pituitary+tumors+contain+a+side+population+with+tumor+stem+cell-associated+characteristics.">Pituitary tumors contain a side population with tumor stem cell-associated characteristics.</a> Endocrine-Related Cancer. 22 (4), 481-504 (2015).</li><li>Laporte, E., Vennekens, A., Vankelecom, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pituitary+remodeling+throughout+life:+are+resident+stem+cells+involved.">Pituitary remodeling throughout life: are resident stem cells involved.</a> Frontiers in Endocrinology. 11 (1), 604519 (2021).</li><li>Yoshida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+adult+pituitary+stem/progenitor+cell+clusters+located+in+the+parenchyma+of+the+rat+anterior+lobe.">Isolation of adult pituitary stem/progenitor cell clusters located in the parenchyma of the rat anterior lobe.</a> Stem Cell Research. 17 (2), 318-329 (2016).</li><li>Cox, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+from+pituitary+as+novel+research+model+to+study+pituitary+stem+cell+biology.">Organoids from pituitary as novel research model to study pituitary stem cell biology.</a> Journal of Endocrinology. 240 (2), 287-308 (2019).</li><li>Denef, C., Hautekeete, E., De Wolf, A., Vanderschueren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pituitary+basophils+from+immature+male+and+female+rats:+distribution+of+gonadotrophs+and+thyrotrophs+as+studied+by+unit+gravity+sedimentation.">Pituitary basophils from immature male and female rats: distribution of gonadotrophs and thyrotrophs as studied by unit gravity sedimentation.</a> Endocrinology. 130 (3), 724-735 (1978).</li><li>Vander Schueren, B., Denef, C., Cassiman, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+and+functional+characteristics+of+rat+pituitary+cell+aggregates.">Ultrastructural and functional characteristics of rat pituitary cell aggregates.</a> Endocrinology. 110 (2), 513-523 (1982).</li><li>Claes, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+stem+cell-derived+monocytes+and+microglia-like+cells+reveal+impaired+amyloid+plaque+clearance+upon+heterozygous+or+homozygous+loss+of+TREM2.">Human stem cell-derived monocytes and microglia-like cells reveal impaired amyloid plaque clearance upon heterozygous or homozygous loss of TREM2.</a> Alzheimer's and Dementia. 15 (3), 453-464 (2019).</li><li>Trompeter, H. -. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+miR-26a,+miR-26b,+and+miR-29b+accelerate+osteogenic+differentiation+of+unrestricted+somatic+stem+cells+from+human+cord+blood.">MicroRNAs miR-26a, miR-26b, and miR-29b accelerate osteogenic differentiation of unrestricted somatic stem cells from human cord blood.</a> BMC Genomics. 14, 111 (2013).</li><li>Suga, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-formation+of+functional+adenohypophysis+in+three-dimensional+culture.">Self-formation of functional adenohypophysis in three-dimensional culture.</a> Nature. 480 (7375), 57-62 (2011).</li><li>Matsumoto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congenital+pituitary+hypoplasia+model+demonstrates+hypothalamic+OTX2+regulation+of+pituitary+progenitor+cells.">Congenital pituitary hypoplasia model demonstrates hypothalamic OTX2 regulation of pituitary progenitor cells.</a> Journal of Clinical Investigation. 130 (2), 641-654 (2019).</li><li>Kanie, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+anti-PIT-1+antibody+syndrome:+PIT-1+presentation+by+HLA+class+I+on+anterior+pituitary+cells.">Pathogenesis of anti-PIT-1 antibody syndrome: PIT-1 presentation by HLA class I on anterior pituitary cells.</a> Journal of the Endocrine Society. 3 (11), 1969-1978 (2019).</li><li>Lee, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+evolution+and+drug+response+in+patient-derived+organoid+models+of+bladder+cancer.">Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer.</a> Cell. 173 (2), 515-528 (2018).</li><li>Yan, H. H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+human+gastric+cancer+organoid+biobank+captures+tumor+subtype+heterogeneity+and+enables+therapeutic+screening.">A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening.</a> Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).</li><li>Nolan, L. A., Kavanagh, E., Lightman, S. L., Levy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anterior+pituitary+cell+population+control:+basal+cell+turnover+and+the+effects+of+adrenalectomy+and+dexamethasone+treatment.">Anterior pituitary cell population control: basal cell turnover and the effects of adrenalectomy and dexamethasone treatment.</a> Journal of Neuroendocrinology. 10 (3), 207-215 (1998).</li></ol>

Gli organoidi derivati da AL, come descritto qui, rappresentano un potente modello di ricerca per studiare le cellule staminali ipofisarie in vitro. Allo stato attuale, questo approccio organoide è l'unico strumento disponibile per far crescere ed espandere in modo affidabile e robusto le cellule staminali ipofisarie primarie. In precedenza è stato riportato un modello organoide ipofisario derivato da cellule staminali embrionali (ESC) o cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC), che ricapitola strettamen...

L'ipofisi è una piccola ghiandola endocrina situata alla base del cervello, dove è collegata all'ipotalamo. La ghiandola integra input periferici e centrali (ipotalamici) per generare un rilascio ormonale sintonizzato e coordinato, regolando così gli organi endocrini bersaglio a valle (come ghiandole surrenali e gonadi) per produrre ormoni appropriati al momento giusto. L'ipofisi è il regolatore chiave del sistema endocrino ed è quindi giustamente definita la ghiandola principale1.
L'ipofisi del topo è costituita da tre lobi (Figura 1), cioè il lobo anteriore (AL), il lobo intermedio (IL) e il lobo posteriore (PL). Il principale AL endocrino contiene cinque tipi di cellule ormonali, compresi i somatotropi che producono l'ormone della crescita (GH); lattotropi che generano prolattina (PRL); corticotropi che secernono ormone adrenocorticotropo (ACTH); tireotropi responsabili della produzione di ormone stimolante la tiroide (TSH); e gonadotropi che producono l'ormone luteinizzante (LH) e l'ormone follicolo-stimolante (FSH). Il PL consiste in proiezioni assonali dall'ipotalamo in cui sono immagazzinati gli ormoni ossitocina e vasopressina (ormone antidiuretico). L'IL si trova tra l'AL e il PL e ospita melanotropi che producono l'ormone stimolante i melanociti (MSH). Nell'ipofisi umana, l'IL regredisce durante lo sviluppo e i melanotropi si diffondono all'interno dell'AL1. Oltre alle cellule endocrine, la ghiandola pituitaria contiene anche un pool di cellule staminali, essenzialmente contrassegnate dal fattore di trascrizione SOX2 2,3,4,5,6. Queste cellule SOX2+ si trovano nella zona marginale (MZ), il rivestimento epiteliale della fessura (un lume residuo embrionale tra AL e IL), o sono diffuse come cluster in tutto il parenchima dell'AL, proponendo così due nicchie di cellule staminali nella ghiandola (Figura 1)2,3,4,5,6.
Data la natura indispensabile dell'ipofisi, il malfunzionamento della ghiandola è associato a una grave morbilità. L'iperpituitarismo (caratterizzato da eccessiva secrezione di uno o più ormoni) e l'ipopituitarismo (produzione difettosa o mancante di uno o più ormoni) possono essere causati da tumori neuroendocrini ipofisari (PitNET; ad esempio, tumori che producono ACTH che portano alla malattia di Cushing) o da difetti genetici (ad esempio, deficit di GH con conseguente nanismo)7. Inoltre, la chirurgia ipofisaria (ad esempio, per rimuovere i tumori), le infezioni (ad esempio, la tubercolosi ipotalamo-ipofisaria o le infezioni a seguito di meningite batterica o encefalite), la sindrome di Sheehan (necrosi a causa di un flusso sanguigno insufficiente a causa della forte perdita di sangue alla nascita), l'apoplessia ipofisaria e la lesione cerebrale traumatica sono altre importanti cause di ipofunzione ipofisaria8 . È stato dimostrato che l'ipofisi del topo possiede la capacità rigenerativa, essendo in grado di riparare il danno locale introdotto dall'ablazione transgenica delle cellule endocrine 9,10. Le cellule staminali SOX2+ reagiscono acutamente alla lesione inflitta mostrando un fenotipo attivato, caratterizzato da una maggiore proliferazione (con conseguente espansione delle cellule staminali) e da una maggiore espressione di fattori e percorsi correlati alla staminalità (ad esempio, WNT / NOTCH). Inoltre, le cellule staminali iniziano ad esprimere l'ormone ablato, con conseguente ripristino sostanziale della popolazione cellulare impoverita nei successivi (da 5 a 6) mesi 9,10. Inoltre, durante la fase di maturazione neonatale della ghiandola (le prime 3 settimane dopo la nascita), le cellule staminali ipofisarie prosperano in uno stato attivato 6,11,12,13, mentre l'invecchiamento dell'organismo è associato a una ridotta funzionalità delle cellule staminali in situ, a causa di un crescente ambiente infiammatorio (micro-) all'invecchiamento (o 'inflammaging')10,14 . Inoltre, la tumorigenesi nella ghiandola è anche associata all'attivazione delle cellule staminali 7,15. Sebbene l'attivazione delle cellule staminali sia stata rilevata in diverse situazioni di rimodellamento ipofisario (esaminata in 7,16), i meccanismi sottostanti rimangono poco chiari. Poiché gli approcci in vivo (come il tracciamento del lignaggio nei topi transgenici) non hanno fornito un quadro chiaro o completo delle cellule staminali ipofisarie, lo sviluppo di modelli in vitro affidabili per esplorare la biologia delle cellule staminali nell'ipofisi normale e malata è essenziale. La coltura standard in vitro di cellule staminali ipofisarie primarie rimane inadeguata a causa della capacità di crescita molto limitata e delle condizioni non fisiologiche (2D) con rapida perdita di fenotipo (per una panoramica più dettagliata, vedere16). Colture di sfere 3D (pituisfere) sono state stabilite da cellule staminali ipofisarie identificate dalla popolazione laterale e dal fenotipoSOX2+ 2,3,4. Le pituisfere crescono clonalmente dalle cellule staminali, esprimono marcatori di staminalità e mostrano capacità di differenziazione nei tipi di cellule endocrine. Tuttavia, non si espandono considerevolmente mentre mostrano solo una limitata passabilità (2-3 passaggi)3,4. Strutture simili a sfere sono state ottenute anche da cluster di cellule staminali ipofisarie non dissociate quando coltivate in Matrigel diluito al 50% per 1 settimana, ma l'espandibilità non è stata mostrata17. L'approccio della pituisfera è utilizzato principalmente come strumento di lettura per il numero di cellule staminali, ma ulteriori applicazioni sono limitate da una capacità di espansione inferiore16.
Per affrontare e superare queste carenze, è stato recentemente stabilito un nuovo modello 3D, ovvero gli organoidi, a partire dal principale AL endocrino dei topi contenenti MZ e cellule staminali parenchimali. È stato dimostrato che gli organoidi sono effettivamente derivati dalle cellule staminali dell'ipofisi e ricapitolano fedelmente il loro fenotipo18. Inoltre, gli organoidi sono espandibili a lungo termine, pur mantenendo robustamente la loro natura di stelo. Pertanto, forniscono un metodo affidabile per espandere le cellule staminali ipofisarie primarie per un'esplorazione profonda. Tale esplorazione non è realizzabile con il numero limitato di cellule staminali che possono essere isolate da un'ipofisi, che non sono espandibili in condizioni 2D16. È stato dimostrato che gli organoidi sono strumenti preziosi e affidabili per scoprire nuove caratteristiche delle cellule staminali ipofisarie (traducibili in vivo)14,18. È importante sottolineare che il modello organoide rispecchia fedelmente lo stato di attivazione delle cellule staminali ipofisarie che si verifica durante il danno tissutale locale e la maturazione neonatale, mostrando una maggiore efficienza di formazione e replicando percorsi molecolari sovraregolati14,18. Quindi, il modello organoide derivato dall'ipofisi è un modello di ricerca innovativo e potente sulla biologia delle cellule staminali ipofisarie, nonché uno strumento di lettura dell'attivazione delle cellule staminali.
Questo protocollo descrive in dettaglio la creazione di organoidi derivati dall'ipofisi di topo. A tal fine, l'AL è isolato e dissociato in singole cellule, che sono incorporate in Matrigel che imita la matrice extracellulare (di seguito denominata ECM). L'assemblaggio cellulare-ECM viene quindi coltivato in un mezzo definito, contenente essenzialmente fattori di crescita delle cellule staminali e regolatori embrionali ipofisari (ulteriormente denominato "mezzo organoide ipofisario" (PitOM)18; Tabella 1). Una volta che gli organoidi sono completamente sviluppati (dopo 10-14 giorni), possono essere ulteriormente espansi attraverso il passaggio sequenziale e sottoposti a un'ampia esplorazione a valle (ad esempio, immunofluorescenza, RT-qPCR e trascrittomica di massa o monocellulare; Figura 1). A lungo termine, si prevede che gli organoidi delle cellule staminali ipofisarie apriranno la strada agli approcci di riparazione dei tessuti e alla medicina rigenerativa.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well plates, TC treated, individually wrapped</td>
			<td>Costar</td>
			<td>734-1607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML0788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12491023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin Bovine (cell culture grade)</td>
			<td>Serva</td>
			<td>47330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), minus vitamin A</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Base moulds</td>
			<td>VWR</td>
			<td>720-1918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer RLT</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cassettes, Q Path Microtwin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>720-2191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer, 40 &#181;m mesh, disposable</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin from Vibrio cholerae</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, powder, high glucose</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>52100039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epredia SuperFrost Plus Adhesion slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epredia HistoStar Embedding Workstation, 220 to 240Vac</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12587976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol Absolute 99.8+%</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10342652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InSolution Y-27632</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>688001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, LDEV-Free</td>
			<td>Corning</td>
			<td>15505739</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty Freezing Container</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetyl-L-cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>375353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde for synthesis (PFA)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>818715</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin G sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red</td>
			<td>Merck</td>
			<td>107241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human EGF Protein, CF</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>236-EG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF basic/FGF2/bFGF (157 aa) Protein</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>234-FSE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF-10</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IGF-1</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-6</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Noggin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>120-10C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human R-Spondin-1</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>120-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human/Murine FGF-8b</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse Sonic Hedgehog/Shh (C25II) N-Terminus</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>464-SH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy micro kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeaKem LE Agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>BDH</td>
			<td>102415K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium di-Hydrogen Phosphate 1-hydrate</td>
			<td>PanReac-AppliChem</td>
			<td>A1047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydrogen Carbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium-Pyruvate (C3H3NaO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stericup-GP, 0.22 &#181;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPU02RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit, 0.22 &#956;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile water</td>
			<td>Fresenius</td>
			<td>B230531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin sulfate salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, with BD Microlance needle with intradermal bevel, 26G</td>
			<td>BD Plastipak</td>
			<td>BDAM303176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Excelsior ES Tissue Processor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12505356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titriplex III</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypL Express Enzyme (1X), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12605028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin solution 2.5 %</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15090046</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of organoids from mouse pituitary as in vitro model to explore pituitary stem cell biology

L'ipofisi è la ghiandola endocrina principale che regola i processi fisiologici chiave, tra cui la crescita del corpo, il metabolismo, la maturazione sessuale, la riproduzione e la risposta allo stress. Più di un decennio fa, le cellule staminali sono state identificate nella ghiandola pituitaria. Tuttavia, nonostante l'applicazione di approcci transgenici in vivo , il loro fenotipo, la biologia e il ruolo rimangono poco chiari. Per affrontare questo enigma, viene sviluppato un nuovo e innovativo modello organoide in vitro per svelare in profondità la biologia delle cellule staminali ipofisarie. Gli organoidi rappresentano strutture cellulari 3D che, in condizioni di coltura definite, si auto-sviluppano dalle cellule staminali (epiteliali) di un tessuto e ricapitolano molteplici segni distintivi di tali cellule staminali e del loro tessuto. È mostrato qui che gli organoidi derivati dall'ipofisi di topo si sviluppano dalle cellule staminali della ghiandola e ricapitolano fedelmente le loro caratteristiche fenotipiche e funzionali in vivo . Tra gli altri, riproducono lo stato di attivazione delle cellule staminali come in vivo che si verifica in risposta al danno locale inflitto transgenicamente. Gli organoidi sono espandibili a lungo termine pur mantenendo robustamente il loro fenotipo di staminalità. Il nuovo modello di ricerca è molto prezioso per decifrare il fenotipo e il comportamento delle cellule staminali durante le condizioni chiave del rimodellamento ipofisario, che vanno dalla maturazione neonatale allo sbiadimento associato all'invecchiamento e dalle ghiandole sane a quelle malate. Qui, viene presentato un protocollo dettagliato per stabilire organoidi derivati dall'ipofisi di topo, che forniscono un potente strumento per immergersi nel mondo ancora enigmatico delle cellule staminali ipofisarie.

Dopo l'isolamento e la dissociazione dell'AL, le singole cellule ottenute vengono seminate in ECM e coltivate in PitOM (Figura 1, Tabella 1). La Figura 3A mostra la coltura cellulare e la densità alla semina (Giorno 0). Alcuni piccoli detriti possono essere presenti (Figura 3A, punte di freccia bianche), ma scompariranno al passaggio. Quattordici giorni dopo la semina, gli organoidi derivati da AL sono completament...

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Development of Organoids from Mouse Pituitary as In Vitro Model to Explore Pituitary Stem Cell Biology

La ghiandola pituitaria è il regolatore chiave del sistema endocrino del corpo. Questo articolo descrive lo sviluppo di organoidi dall'ipofisi del topo come un nuovo modello 3D in vitro per studiare la popolazione di cellule staminali della ghiandola di cui la biologia e la funzione rimangono poco comprese.

Sviluppo di organoidi dall'ipofisi di topo come modello in vitro per esplorare la biologia delle cellule staminali ipofisarie

The pituitary is the master endocrine gland regulating key physiological processes, including body growth, metabolism, sexual maturation, reproduction, ...

Il nostro modello organoide è molto prezioso per esplorare la biologia delle cellule staminali pituitarie in condizioni omeostatiche e di rimodellamento ipofisario, come nella maturazione neonatale della ghiandola, nel declino funzionale associato all'invecchiamento e nella crescita tumorale nella ghiandola. Ad oggi, la nostra tecnica organoide ipofisaria è l'unico strumento disponibile per far crescere ed espandere in modo affidabile e robusto le cellule staminali ipofisarie primarie del topo. A dimostrare la procedura saranno Emma Laporte e Charlotte Nys, dottorandi del mio gruppo di ricerca.Per iniziare, lavare la testa del topo con acqua deionizzata per rimuovere il sangue. Spruzzare il 70% di etanolo sulla testa per generare un ambiente sterile. Quindi, rimuovere la pelle tra le orecchie utilizzando strumenti chirurgici sterili.Per aprire il cranio, rompere il ponte nasale con forbici sterili. Aprire ulteriormente il cranio partendo dal ponte nasale verso le orecchie su entrambi i lati. Rimuovere il cranio e il cervello con una pinzetta sterile senza toccare la ghiandola pituitaria.Rimuovere il diaframma sellae con pinzette smussate. Quindi, sotto uno stereomicroscopio, separare il lobo anteriore dai lobi posteriori e intermedi. Isolare accuratamente il lobo anteriore con una pinzetta smussata e raccoglierlo in un matraccio Erlenmeyer da 10 millilitri contenente tre millilitri di A medio.Aggiungere due millilitri di soluzione di tripsina al 2,5% preriscaldata.Incubare a 37 gradi Celsius per 15 minuti. Aggiungere due millilitri di soluzione di DNAse preriscaldata e ruotare il matraccio Erlenmeyer 10 volte. Lasciare che l'ipofisi affondi sul fondo e rimuovere il surnatante.Aggiungere due millilitri di soluzione di inibitore della tripsina preriscaldata e incubare a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Rimuovere il surnatante quando l'ipofisi affonda sul fondo. Aggiungere due millilitri di mezzo B preriscaldato e incubare per cinque minuti.Aggiungere due millilitri di mezzo C preriscaldato a questo e incubare per 15 minuti. Lasciare che l'ipofisi affondi sul fondo e rimuovere il surnatante. Quindi, risciacquare tre volte con un mezzo preriscaldato C.Aggiungere due millilitri di mezzo preriscaldato C.Aspirare ed espellere la ghiandola pituitaria con una pipetta Pasteur sterile e lucidata a fiamma più volte fino a quando i frammenti non sono più visibili.Trasferire la sospensione in un tubo da 15 millilitri contenente 4,5 millilitri di soluzione di DNAse preriscaldata. Risciacquare il matraccio tre volte con due millilitri di mezzo C preriscaldato e trasferire la sospensione sul tubo. Mescolare la sospensione cellulare raccolta e filtrarla attraverso un filtro cellulare da 40 micron in un tubo da 30 millilitri.Risciacquare il tubo e il filtro cellulare tre volte con due millilitri di mezzo C e trasferire la sospensione al tubo. Riempire una pipetta Pasteur di vetro con due millilitri di BSA. Posizionare la punta della pipetta nella parte inferiore del tubo e pipettare delicatamente per formare uno strato di densità visibile.Centrifugare a 190 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Rimuovere il surnatante e risospese il pellet cellulare in un millilitro di DMEM/F-12 avanzato ghiacciato. Quindi, quantificare le celle con un contatore di celle.Centrifugare la sospensione cellulare a 190 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius e rimuovere il surnatante. Risospesere il pellet cellulare in DMEM/F-12 avanzato per raggiungere una densità cellulare di 1,1 volte 10 alla 6a cella per millilitro. Aggiungere ECM al volume desiderato di sospensione cellulare con un rapporto di 30:70 e mescolare bene.Depositare una goccia di 30 microlitri di questa miscela in ogni pozzetto di una piastra preriscaldata da 48 pozzetti. Capovolgere la piastra e lasciare che l'ECM si solidifichi a 37 gradi Celsius per 20 minuti. Dopo l'incubazione, aggiungere con attenzione 250 microlitri di mezzo organoide ipofisario preriscaldato integrato con inibitore ROCK 10-micromolare.Ogni due o tre giorni, cambiare il mezzo senza inibitore ROCK per 10-14 giorni fino a quando gli organoidi sono completamente cresciuti. Per passare gli organoidi, aspirare prima delicatamente il mezzo e aggiungere 400 microlitri di DMEM/F-12 avanzato ghiacciato per disintegrare l'ECM. Quindi, raccogliere gli organoidi in un tubo di microcentrifuga.Lavare il pozzetto con 400 microlitri di DMEM/F-12 avanzato ghiacciato. Centrifugare il tubo a 200 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Rimuovere il surnatante e aggiungere 400 microlitri dell'enzima TrypLE Express preriscaldato.Mescolare invertendo il tubo più volte e incubare a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Aggiungi 400 microlitri di DMEM/F-12 avanzato ghiacciato. Centrifugare a 200 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius e rimuovere il surnatante.Risospesciare il pellet con 100 microlitri di DMEM/F-12 avanzato ghiacciato. Restringere una punta P-200 e utilizzare la punta per dissociare gli organoidi mediante pipettaggio vigoroso fino ad ottenere frammenti organoidi. Aggiungi 800 microlitri di DMEM/F-12 avanzato.Centrifugare a 190 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius e rimuovere il surnatante. Per passare gli organoidi, risospesciare il pellet in un volume adeguato di DMEM/F-12 avanzato e aggiungere ECM con un rapporto di 30:70. Mescolare bene.Continuare a seminare e coltivare gli organoidi come descritto nel manoscritto di testo. Le singole cellule dissociate dal lobo anteriore sono state seminate in ECM e coltivate in mezzo organoide ipofisario. 14 giorni dopo la semina, gli organoidi sono stati completamente sviluppati e hanno raggiunto un diametro fino a 500 micrometri.In questa fase, gli organoidi mostravano morfologia cistica con uno strato epiteliale che racchiudeva un lume. Non è consigliabile utilizzare i pozzetti in cui appaiono strutture dense dopo la crescita. Per il passaging, i frammenti organoidi sono stati utilizzati per la semina.Sette giorni dopo il passaggio, è stata osservata una ricrescita organoide favorevole con strutture cistiche. Gli organoidi densi devono essere scartati, poiché gli organoidi sfavorevoli possono assumere il controllo della coltura. L'analisi di colorazione immunofluorescenza per i marcatori epiteliali E-caderina e citocheratine 8 e 18 ha confermato il carattere epiteliale degli organoidi.L'espressione dei marcatori delle cellule staminali ipofisarie Sox2 e Trop2 ha dimostrato la staminalità e il marcatore ipofisario specifico LHX3 ha mostrato il fenotipo ipofisario degli organoidi. L'espressione del marcatore Ki67 ha mostrato che le cellule organoidiche sono in uno stato proliferativo. L'analisi RTQ PCR ha mostrato una maggiore espressione di marcatori di staminalità negli organoidi rispetto al lobo anteriore anche dopo passaggi multipli, convalidando l'arricchimento delle cellule staminali.È importante placcare il numero appropriato di singole cellule nella cupola ECM alla semina iniziale, e quando si passano gli organoidi, bisogna ricordarsi di riseminare frammenti e non singole cellule.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Development of Organoids from Mouse Pituitary as In Vitro Model to Explore Pituitary Stem Cell Biology

Epigenetic Conversion as a Safe and Simple Method to Obtain Insulin-secreting Cells from Adult Skin Fibroblasts

La conversione epigenetico come un metodo semplice e sicuro per ottenere cellule che secernono insulina da adulti fibroblasti cutanei

Regenerative medicine requires new, fully functional cells that are delivered to patients in order to repair degenerated or damaged tissues. When such ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Effective Isolation of Functional Islets from Neonatal Mouse Pancreas

Efficace isolamento di isole funzionali da neonatali mouse Pancreas

Perfusion-based islet-isolation protocols from large mammalian pancreata are well established. Such protocols are readily conducted in many laboratories ...

Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos

Derivazione di linee di cellule staminali da embrioni di Preimplantation Mouse

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines ...

Dissection and Coronal Slice Preparation of Developing Mouse Pituitary Gland

Dissezione e preparazione coronale fetta di sviluppare la ghiandola pituitaria del Mouse

The pituitary gland or hypophysis is an important endocrine organ secreting hormones essential for homeostasis. It consists of two glands with separate ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

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Generazione di insulina senza impalcatura, tridimensionale esprimendo Pancreatoids dal Mouse progenitori pancreatico In Vitro

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Valutazione dei danni ossidativi nelle cellule primarie della superficie oculare del topo/cellule staminali in risposta ai danni ultravioletti-C (UV-C)

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...

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Preparazione di piccole librerie di RNA per il sequenziamento da embrioni di topo precoce

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...