Name: development of organoids from mouse pituitary as in vitro model to explore pituitary stem cell biology
Uploaded: 2022-02-25T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Development of Organoids from Mouse Pituitary as In Vitro Model to Explore Pituitary Stem Cell Biology at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra KU Leuven Research Fund og Fund for Scientific Research (FWO) - Flandern. E.L. (11A3320N) og C.N. (1S14218N) støttes av et ph.d.-stipend fra FWO/FWO-SB.

Dyreforsøk for denne studien ble godkjent av KU Leuven Etisk komité for dyreforsøk (P153/2018). Alle musene ble plassert på universitetets dyreanlegg under standardiserte forhold (konstant temperatur på 23 ± 1,5 °C, relativ luftfuktighet 40%-60%, og en dag / natt syklus på 12 timer), med tilgang til vann og mat ad libitum.
1. Mus
<ol><li>Bruk kommersielt tilgjengelige musestammer, for eksempel C57BL/6J-mus, av ung voksen alder (8-12 uker gammel). Generelt gi...

<ol>
	<li>Melmed, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The pituitary. 3rd ed. , 1 (2011).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adult+pituitary+contains+a+cell+population+displaying+stem/progenitor+cell+and+early-embryonic+characteristics.">The adult pituitary contains a cell population displaying stem/progenitor cell and early-embryonic characteristics.</a> Endocrinology. 146 (9), 3985-3998 (2005).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pituitary+progenitor+cells+tracked+down+by+side+population+dissection.">Pituitary progenitor cells tracked down by side population dissection.</a> Stem Cells. 27 (5), 1182-1195 (2009).</li><li>Fauquier, T., Rizzoti, K., Dattani, M., Lovell-Badge, R., Robinson, I. C. A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX2-expressing+progenitor+cells+generate+all+of+the+major+cell+types+in+the+adult+mouse+pituitary+gland.">SOX2-expressing progenitor cells generate all of the major cell types in the adult mouse pituitary gland.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (8), 2907-2912 (2008).</li><li>Rizzoti, K., Akiyama, H., Lovell-Badge, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mobilized+adult+pituitary+stem+cells+contribute+to+endocrine+regeneration+in+response+to+physiological+demand.">Mobilized adult pituitary stem cells contribute to endocrine regeneration in response to physiological demand.</a> Cell Stem Cell. 13 (4), 419-432 (2013).</li><li>Andoniadou, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox2++stem/progenitor+cells+in+the+adult+mouse+pituitary+support+organ+homeostasis+and+have+tumor-inducing+potential.">Sox2+ stem/progenitor cells in the adult mouse pituitary support organ homeostasis and have tumor-inducing potential.</a> Cell Stem Cell. 13 (4), 433-445 (2013).</li><li>Nys, C., Vankelecom, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pituitary+disease+and+recovery:+How+are+stem+cells+involved.">Pituitary disease and recovery: How are stem cells involved.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 525 (4), 111176 (2021).</li><li>Schneider, H. J., Aimaretti, G., Kreitschmann-Andermahr, I., Stalla, G. K., Ghigo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypopituitarism.">Hypopituitarism.</a> Lancet. 369 (9571), 1461-1470 (2007).</li><li>Fu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adult+pituitary+shows+stem/progenitor+cell+activation+in+response+to+injury+and+is+capable+of+regeneration.">The adult pituitary shows stem/progenitor cell activation in response to injury and is capable of regeneration.</a> Endocrinology. 153 (7), 3224-3235 (2012).</li><li>Willems, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+in+the+pituitary+after+cell-ablation+injury:+time-related+aspects+and+molecular+analysis.">Regeneration in the pituitary after cell-ablation injury: time-related aspects and molecular analysis.</a> Endocrinology. 157 (2), 705-721 (2016).</li><li>Gremeaux, L., Fu, Q., Chen, J., Vankelecom, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+phenotype+of+the+pituitary+stem/progenitor+cell+compartment+during+the+early-postnatal+maturation+phase+of+the+gland.">Activated phenotype of the pituitary stem/progenitor cell compartment during the early-postnatal maturation phase of the gland.</a> Stem Cells and Development. 21 (5), 801-813 (2012).</li><li>Zhu, X., Tollkuhn, J., Taylor, H., Rosenfeld, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch-dependent+pituitary+SOX2++stem+cells+exhibit+a+timed+functional+extinction+in+regulation+of+the+postnatal+gland.">Notch-dependent pituitary SOX2+ stem cells exhibit a timed functional extinction in regulation of the postnatal gland.</a> Stem Cell Reports. 5 (6), 1196-1209 (2015).</li><li>Russell, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pituitary+stem+cells+produce+paracrine+WNT+signals+to+control+the+expansion+of+their+descendant+progenitor+cells.">Pituitary stem cells produce paracrine WNT signals to control the expansion of their descendant progenitor cells.</a> eLife. 10 (1), 59142 (2021).</li><li>Vennekens, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-6+is+an+activator+of+pituitary+stem+cells+upon+local+damage,+a+competence+quenched+in+the+aging+gland.">Interleukin-6 is an activator of pituitary stem cells upon local damage, a competence quenched in the aging gland.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (25), 2100052118 (2021).</li><li>Mertens, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pituitary+tumors+contain+a+side+population+with+tumor+stem+cell-associated+characteristics.">Pituitary tumors contain a side population with tumor stem cell-associated characteristics.</a> Endocrine-Related Cancer. 22 (4), 481-504 (2015).</li><li>Laporte, E., Vennekens, A., Vankelecom, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pituitary+remodeling+throughout+life:+are+resident+stem+cells+involved.">Pituitary remodeling throughout life: are resident stem cells involved.</a> Frontiers in Endocrinology. 11 (1), 604519 (2021).</li><li>Yoshida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+adult+pituitary+stem/progenitor+cell+clusters+located+in+the+parenchyma+of+the+rat+anterior+lobe.">Isolation of adult pituitary stem/progenitor cell clusters located in the parenchyma of the rat anterior lobe.</a> Stem Cell Research. 17 (2), 318-329 (2016).</li><li>Cox, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+from+pituitary+as+novel+research+model+to+study+pituitary+stem+cell+biology.">Organoids from pituitary as novel research model to study pituitary stem cell biology.</a> Journal of Endocrinology. 240 (2), 287-308 (2019).</li><li>Denef, C., Hautekeete, E., De Wolf, A., Vanderschueren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pituitary+basophils+from+immature+male+and+female+rats:+distribution+of+gonadotrophs+and+thyrotrophs+as+studied+by+unit+gravity+sedimentation.">Pituitary basophils from immature male and female rats: distribution of gonadotrophs and thyrotrophs as studied by unit gravity sedimentation.</a> Endocrinology. 130 (3), 724-735 (1978).</li><li>Vander Schueren, B., Denef, C., Cassiman, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+and+functional+characteristics+of+rat+pituitary+cell+aggregates.">Ultrastructural and functional characteristics of rat pituitary cell aggregates.</a> Endocrinology. 110 (2), 513-523 (1982).</li><li>Claes, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+stem+cell-derived+monocytes+and+microglia-like+cells+reveal+impaired+amyloid+plaque+clearance+upon+heterozygous+or+homozygous+loss+of+TREM2.">Human stem cell-derived monocytes and microglia-like cells reveal impaired amyloid plaque clearance upon heterozygous or homozygous loss of TREM2.</a> Alzheimer's and Dementia. 15 (3), 453-464 (2019).</li><li>Trompeter, H. -. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+miR-26a,+miR-26b,+and+miR-29b+accelerate+osteogenic+differentiation+of+unrestricted+somatic+stem+cells+from+human+cord+blood.">MicroRNAs miR-26a, miR-26b, and miR-29b accelerate osteogenic differentiation of unrestricted somatic stem cells from human cord blood.</a> BMC Genomics. 14, 111 (2013).</li><li>Suga, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-formation+of+functional+adenohypophysis+in+three-dimensional+culture.">Self-formation of functional adenohypophysis in three-dimensional culture.</a> Nature. 480 (7375), 57-62 (2011).</li><li>Matsumoto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congenital+pituitary+hypoplasia+model+demonstrates+hypothalamic+OTX2+regulation+of+pituitary+progenitor+cells.">Congenital pituitary hypoplasia model demonstrates hypothalamic OTX2 regulation of pituitary progenitor cells.</a> Journal of Clinical Investigation. 130 (2), 641-654 (2019).</li><li>Kanie, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+anti-PIT-1+antibody+syndrome:+PIT-1+presentation+by+HLA+class+I+on+anterior+pituitary+cells.">Pathogenesis of anti-PIT-1 antibody syndrome: PIT-1 presentation by HLA class I on anterior pituitary cells.</a> Journal of the Endocrine Society. 3 (11), 1969-1978 (2019).</li><li>Lee, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+evolution+and+drug+response+in+patient-derived+organoid+models+of+bladder+cancer.">Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer.</a> Cell. 173 (2), 515-528 (2018).</li><li>Yan, H. H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+human+gastric+cancer+organoid+biobank+captures+tumor+subtype+heterogeneity+and+enables+therapeutic+screening.">A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening.</a> Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).</li><li>Nolan, L. A., Kavanagh, E., Lightman, S. L., Levy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anterior+pituitary+cell+population+control:+basal+cell+turnover+and+the+effects+of+adrenalectomy+and+dexamethasone+treatment.">Anterior pituitary cell population control: basal cell turnover and the effects of adrenalectomy and dexamethasone treatment.</a> Journal of Neuroendocrinology. 10 (3), 207-215 (1998).</li></ol>

De AL-avledede organoidene, som beskrevet her, representerer en kraftig forskningsmodell for å studere hypofyse stamceller in vitro. For tiden er denne organoid tilnærmingen det eneste tilgjengelige verktøyet for pålitelig og robust å vokse og utvide primære hypofyse stamceller. En hypofyse organoid modell avledet fra embryonale stamceller (ESC) eller induserte pluripotente stamceller (iPSC) har blitt rapportert tidligere, som nøye recapitulates hypofyse embryonal organogenese23; ...

Hypofysen er en liten endokrine kjertel som ligger ved foten av hjernen, hvor den er koblet til hypothalamus. Kjertelen integrerer perifere og sentrale (hypothalamus) innganger for å generere en innstilt og koordinert hormonfrigjøring, og regulerer dermed nedstrøms mål endokrine organer (som binyrene og gonadene) for å produsere passende hormoner til rett tid. Hypofysen er nøkkelregulatoren til det endokrine systemet og kalles derfor med rette masterkjertelen1.
Mus hypofysen består av tre lober (figur 1), det vil si fremre lobe (AL), mellomloben (IL) og bakre lobe (PL). Den store endokrine AL inneholder fem hormonelle celletyper, inkludert somatotroper som produserer veksthormon (GH); laktotroper som genererer prolaktin (PRL); kortikotroper som skiller ut adrenocorticotropisk hormon (ACTH); thyrotropes ansvarlig for skjoldbruskstimulerende hormon (TSH) produksjon; og gonadotroper som gjør luteiniserende hormon (LH) og follikkelstimulerende hormon (FSH). PL består av axonale projeksjoner fra hypothalamus der hormonene oksytocin og vasopressin (antidiuretisk hormon) lagres. IL ligger mellom AL og PL og huser melanotroper som produserer melanocyttstimulerende hormon (MSH). I den menneskelige hypofysen går IL tilbake under utvikling, og melanotroper spres innenfor AL1. I tillegg til de endokrine cellene inneholder hypofysen også et basseng med stamceller, i hovedsak preget av transkripsjonsfaktoren SOX2 2,3,4,5,6. Disse SOX2+ cellene ligger i marginalsonen (MZ), epitelforingen av kløften (en embryonal rest lumen mellom AL og IL), eller spres som klynger gjennom parenchyma av AL, og foreslår dermed to stamcellenisjer i kjertelen (figur 1)2,3,4,5,6.
Gitt hypofysens uunnværlige natur, er funksjonsfeil i kjertelen forbundet med alvorlig sykelighet. Hyperpituitarisme (preget av over-sekresjon av ett eller flere hormoner) og hypopituitarisme (defekt eller manglende produksjon av ett eller flere hormoner) kan være forårsaket av hypofysen nevroendokrine svulster (PitNETs; f.eks. ACTH-produserende svulster som fører til Cushings sykdom) eller ved genetiske defekter (f.eks. GH-mangel som resulterer i dvergisme)7. I tillegg hypofysekirurgi (f.eks. for å fjerne svulster), infeksjoner (f.eks. hypothalamus-hypofyse tuberkulose, eller infeksjoner etter bakteriell meningitt eller encefalitt), Sheehans syndrom (nekrose på grunn av utilstrekkelig blodstrøm på grunn av kraftig blodtap ved fødsel), hypofyse apoplexy og traumatisk hjerneskade er andre viktige årsaker til hypofyse hypofuktighet8 . Det har vist seg at musen hypofysen har regenerativ kapasitet, å kunne reparere lokal skade introdusert ved transgen ablasjon av endokrine celler 9,10. SOX2+-stamcellene reagerer akutt på den påførte skaden som viser en aktivert fenotype, preget av forbedret spredning (som resulterer i stamcelleutvidelse) og økt uttrykk for stamcellerelaterte faktorer og veier (f.eks. Videre begynner stamcellene å uttrykke det ablerte hormonet, noe som til slutt resulterer i betydelig restaurering av den utarmede cellepopulasjonen i løpet av følgende (5 til 6) måneder 9,10. Også under neonatal modningsfasen av kjertelen (de første 3 ukene etter fødselen) blomstrer hypofysen stamceller i en aktivert tilstand 6,11,12,13, mens organismal aldring er forbundet med redusert in situ stamcellefunksjonalitet, på grunn av et økende inflammatorisk (mikro-) miljø ved aldring (eller 'inflammaging')10,14 . I tillegg er tumorigenesis i kjertelen også forbundet med stamcelleaktivering 7,15. Selv om stamcelleaktivering har blitt påvist i flere situasjoner med hypofyseoppussing (gjennomgått i 7,16), er underliggende mekanismer fortsatt uklare. Siden in vivo-tilnærminger (for eksempel avstamningssporing hos transgene mus) ikke har gitt et klart eller omfattende bilde av hypofyse stamceller, er utviklingen av pålitelige in vitro-modeller for å utforske stamcellebiologi i normal og syk hypofyse viktig. Standard in vitrokultur av primære hypofyse stamceller forblir utilstrekkelig på grunn av svært begrenset vekstkapasitet og ikke-fysiologiske (2D) forhold med raskt tap av fenotype (for en mer detaljert oversikt, se16). 3D-sfærekulturer (pituispheres) er etablert fra hypofyse stamceller som identifisert av sidepopulasjon og SOX2 + fenotype 2,3,4. Pituisfærene vokser clonally fra stamcellene, uttrykker stemnessmarkører og viser differensieringskapasitet i de endokrine celletypene. Imidlertid utvides de ikke betydelig mens de bare viser begrenset passasje (2-3 passasjer)3,4. Sfærelignende strukturer ble også hentet fra ikke-dissosierte hypofyse stamcelleklynger når de ble dyrket i 50% fortynnet Matrigel i 1 uke, men utvidelsesmuligheter ble ikke vist17. Pituisphere-tilnærmingen brukes for det meste som et avlesningsverktøy for stamcellenumre, men ytterligere applikasjoner er begrenset av dårligere utvidelseskapasitet16.
For å adressere og overvinne disse manglene har en ny 3D-modell nylig blitt etablert, det vil si organoider, fra den store endokrine AL av mus som inneholder MZ og parenchymale stamceller. Det har vist seg at organoidene faktisk er avledet fra hypofysens stamceller og trofast rekapitulerer deres fenotype18. Videre er organoidene langsiktige utvidbare, samtidig som de opprettholder sin stemness natur på en robust måte. Derfor gir de en pålitelig metode for å utvide primære hypofyse stamceller for dyp utforskning. Slik utforskning kan ikke oppnås med det begrensede antallet stamceller som kan isoleres fra en hypofyse, som heller ikke kan utvides under 2D-forhold16. Det har vist seg at organoidene er verdifulle og pålitelige verktøy for å avdekke nye hypofyse stamcellefunksjoner (oversettbar til in vivo)14,18. Viktigst, den organoide modellen speiler trofast hypofysen stamcelleaktiveringsstatus som oppstår under lokal vevsskade og neonatal modning, som viser forbedret formasjonseffektivitet og replikerer oppregulerte molekylære veier14,18. Derfor er den hypofyse-avledede organoidmodellen en innovativ og kraftig forskningsmodell for hypofyse stamcellebiologi samt et stamcelleaktiveringsavlesningsverktøy.
Denne protokollen beskriver i detalj etableringen av mus hypofyse-avledede organoider. Til dette målet er AL isolert og dissosiert i enkeltceller, som er innebygd i ekstracellulær matrise-etterligning Matrigel (heretter referert til som ECM). Celle-ECM-samlingen dyrkes deretter i et definert medium, som i hovedsak inneholder stamcellevekstfaktorer og hypofysære embryonale regulatorer (videre referert til som 'hypofysen organoid medium' (PitOM)18; Tabell 1). Når organoidene er fullt utviklet (etter 10-14 dager), kan de utvides ytterligere gjennom sekvensiell passivisering og utsettes for omfattende nedstrømsutforskning (f.eks. immunfluorescens, RT-qPCR og bulk- eller encellet transkripsjonsomikk; Figur 1). På lengre sikt forventes det at hypofysens stamcelleorganoider vil bane vei for vevsreparasjonsmetoder og regenerativ medisin.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well plates, TC treated, individually wrapped</td>
			<td>Costar</td>
			<td>734-1607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML0788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12491023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin Bovine (cell culture grade)</td>
			<td>Serva</td>
			<td>47330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), minus vitamin A</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Base moulds</td>
			<td>VWR</td>
			<td>720-1918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer RLT</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cassettes, Q Path Microtwin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>720-2191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer, 40 &#181;m mesh, disposable</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin from Vibrio cholerae</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, powder, high glucose</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>52100039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epredia SuperFrost Plus Adhesion slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epredia HistoStar Embedding Workstation, 220 to 240Vac</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12587976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol Absolute 99.8+%</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10342652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InSolution Y-27632</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>688001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, LDEV-Free</td>
			<td>Corning</td>
			<td>15505739</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty Freezing Container</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetyl-L-cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>375353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde for synthesis (PFA)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>818715</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin G sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red</td>
			<td>Merck</td>
			<td>107241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human EGF Protein, CF</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>236-EG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF basic/FGF2/bFGF (157 aa) Protein</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>234-FSE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF-10</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IGF-1</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-6</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Noggin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>120-10C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human R-Spondin-1</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>120-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human/Murine FGF-8b</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse Sonic Hedgehog/Shh (C25II) N-Terminus</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>464-SH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy micro kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeaKem LE Agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>BDH</td>
			<td>102415K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium di-Hydrogen Phosphate 1-hydrate</td>
			<td>PanReac-AppliChem</td>
			<td>A1047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydrogen Carbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium-Pyruvate (C3H3NaO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stericup-GP, 0.22 &#181;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPU02RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit, 0.22 &#956;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile water</td>
			<td>Fresenius</td>
			<td>B230531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin sulfate salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, with BD Microlance needle with intradermal bevel, 26G</td>
			<td>BD Plastipak</td>
			<td>BDAM303176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Excelsior ES Tissue Processor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12505356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titriplex III</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypL Express Enzyme (1X), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12605028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin solution 2.5 %</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15090046</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of organoids from mouse pituitary as in vitro model to explore pituitary stem cell biology

Hypofysen er den viktigste endokrine kjertelen som regulerer viktige fysiologiske prosesser, inkludert kroppsvekst, metabolisme, kjønnsmodning, reproduksjon og stressrespons. For mer enn et tiår siden ble stamceller identifisert i hypofysen. Til tross for anvendelsen av transgene in vivo-tilnærminger , forblir deres fenotype, biologi og rolle uklar. For å takle denne gåten utvikles en ny og innovativ organoid in vitro-modell for å dypt avdekke hypofyse stamcellebiologi. Organoider representerer 3D-cellestrukturer som under definerte kulturforhold utvikler seg selv fra vevets (epiteliale) stamceller og rekapitulerer flere kjennetegn på disse stamcellene og deres vev. Det er vist her at mus hypofyse-avledede organoider utvikler seg fra kjertelens stamceller og trofast rekapitulere sine in vivo fenotypiske og funksjonelle egenskaper. Blant annet reproduserer de stamcellens aktiveringstilstand som in vivo som oppstår som svar på transgenisk påført lokal skade. Organoidene er langsiktige utvidbare, samtidig som de beholder sin stemness fenotype på en robust måte. Den nye forskningsmodellen er svært verdifull for å dechiffrere stamcellenes fenotype og oppførsel under viktige forhold for hypofyseoppussing, alt fra neonatal modning til aldringsrelatert falming, og fra sunne til syke kjertler. Her presenteres en detaljert protokoll for å etablere mus hypofyse-avledede organoider, som gir et kraftig verktøy for å dykke inn i den ennå gåtefulle verden av hypofyse stamceller.

Etter isolasjon og dissosiasjon av AL blir de oppnådde enkeltcellene sådd i ECM og dyrket i PitOM (figur 1, tabell 1). Figur 3A viser cellekulturen og tettheten ved såing (dag 0). Noen små rusk kan være til stede (figur 3A, hvite pilspisser), men vil forsvinne ved passivring. Fjorten dager etter sådd er de AL-avledede organoidene fullt utviklet (figur 3A). Organoidene viser en cys...

Watch this Scientific Journal Video about Development of Organoids from Mouse Pituitary as In Vitro Model to Explore Pituitary Stem Cell Biology at JoVE.com

Development of Organoids from Mouse Pituitary as In Vitro Model to Explore Pituitary Stem Cell Biology

Hypofysen er nøkkelregulatoren til kroppens endokrine system. Denne artikkelen beskriver utviklingen av organoider fra musen hypofysen som en ny 3D in vitro modell for å studere kjertelens stamcellepopulasjon som biologien og funksjonen forblir dårlig forstått.

Utvikling av organoider fra mus hypofyse som in vitro modell for å utforske hypofysen stamcellebiologi

The pituitary is the master endocrine gland regulating key physiological processes, including body growth, metabolism, sexual maturation, reproduction, ...

Vår organoide modell er svært verdifull for å utforske hypofyse stamcellebiologi i homeostatisk samt hypofyse ombyggingsforhold, for eksempel i neonatal modning av kjertelen, aldringsrelatert funksjonell nedgang og tumorvekst i kjertelen. Til dags dato er vår hypofyse organoid teknikk det eneste tilgjengelige verktøyet for pålitelig og robust å vokse og utvide primære mus hypofyse stamceller. Å demonstrere prosedyren vil være Emma Laporte og Charlotte Nys, ph.d.-studenter i min forskningsgruppe.Til å begynne med, vask musehodet med deionisert vann for å fjerne blodet. Spray 70% etanol på hodet for å generere et sterilt miljø. Fjern deretter huden mellom ørene ved hjelp av sterile kirurgiske verktøy.For å åpne kraniet, bryt nesebroen med steril saks. Åpne kraniet ytterligere fra nesebroen mot ørene på begge sider. Fjern kraniet og hjernen med sterile pinsett uten å berøre hypofysen.Fjern diafragma sellae med stump pinsett. Deretter, under et stereomikroskop, skille den fremre lobe fra bakre og mellomliggende lobes. Isoler forsiktig den fremre lobe med stump pinsett og samle den i en 10 milliliter Erlenmeyer kolbe som inneholder tre milliliter middels A.Tilsett to milliliter forvarmet 2,5% trypsinoppløsning.Inkuber ved 37 grader Celsius i 15 minutter. Tilsett to milliliter forvarmet DNAse-løsning og virvle Erlenmeyer-kolben 10 ganger. La hypofysen synke til bunnen og fjern supernatanten.Tilsett to milliliter forvarmet trypsinhemmerløsning og inkuber ved 37 grader Celsius i 10 minutter. Fjern supernatanten når hypofysen synker til bunnen. Tilsett to milliliter forvarmet medium B og inkuber i fem minutter.Tilsett to milliliter forvarmet medium C til dette og inkuber i 15 minutter. La hypofysen synke til bunnen og fjern supernatanten. Skyll den deretter tre ganger med forvarmet medium C.Tilsett to milliliter forvarmet medium C.Aspirate og utvis hypofysen med en steril, flammepolert Pasteur pipette flere ganger til fragmenter ikke er synlige lenger.Overfør suspensjonen til et 15 milliliter rør som inneholder 4,5 milliliter forvarmet DNAse-løsning. Skyll kolben tre ganger med to milliliter forvarmet medium C og overfør suspensjonen til røret. Bland den oppsamlede cellefjæringen og filtrer den gjennom en 40-mikron cellesil i et 30 milliliterrør.Skyll røret og cellesilen tre ganger med to milliliter middels C og overfør suspensjonen til røret. Fyll en pasteurpipette i glass med to milliliter BSA. Plasser tuppen av pipetten nederst på røret og rør forsiktig ut for å danne et synlig tetthetslag.Sentrifuge ved 190 ganger G i 10 minutter ved fire grader Celsius. Fjern supernatanten og resuspend cellepellet i en milliliter iskald avansert DMEM / F-12. Deretter kvantifiserer du cellene med en celleteller.Sentrifuger cellefjæringen ved 190 ganger G i 10 minutter ved fire grader Celsius og fjern supernatanten. Resuspend cellepellet i avansert DMEM / F-12 for å nå en celletetthet på 1,1 ganger 10 til sjette celler per milliliter. Legg ECM til ønsket volum av celleoppheng med et forhold på 30:70 og bland godt.Deponer en 30-mikroliter dråpe av denne blandingen i hver brønn av en forvarmet 48-brønns plate. Snu platen opp ned og la ECM størkne ved 37 grader Celsius i 20 minutter. Etter inkubasjonen, tilsett forsiktig 250 mikroliter av forvarmet hypofyse organoid medium supplert med 10-mikromolar ROCK-hemmer.Hver annen til tre dager, bytt mediet uten ROCK-hemmer i 10 til 14 dager til organoidene er fullt vokst. For å passere organoidene aspirerer du først mediet forsiktig og tilsetter 400 mikroliter iskald avansert DMEM / F-12 for å oppløse ECM. Samle deretter organoidene i et mikrocentrifugerør.Vask brønnen med 400 mikroliter iskald avansert DMEM/F-12. Sentrifuger røret ved 200 ganger G i fem minutter ved fire grader Celsius. Fjern supernatanten og tilsett 400 mikroliter forhåndsvarmet TrypLE Express-enzym.Bland ved å invertere røret flere ganger og inkubere ved 37 grader Celsius i fem minutter. Tilsett 400 mikroliter iskald avansert DMEM/F-12. Sentrifuge ved 200 ganger G i fem minutter ved fire grader Celsius og fjern supernatanten.Resuspend pellet med 100 mikroliter av iskald avansert DMEM / F-12. Smal en P-200 spiss og bruk spissen til å fjerne organoidene ved kraftig pipettering til organoidfragmenter er oppnådd. Tilsett 800 mikroliter avanserte DMEM/F-12.Sentrifuge ved 190 ganger G i 10 minutter ved fire grader Celsius og fjern supernatanten. For å passere organoidene, resuspend pellet i et tilstrekkelig volum av avansert DMEM / F-12 og legg til ECM i et forhold på 30:70. Bland godt.Fortsett å frø og kultur organoidene som beskrevet i tekstmanuskriptet. Dissosierte enkeltceller fra den fremre loben ble sådd i ECM og dyrket i hypofysen organoid medium. 14 dager etter sådd ble organoidene fullt utviklet og nådde en diameter på opptil 500 mikrometer.På dette stadiet viste organoidene cystisk morfologi med et epitellag som omslutter en lumen. Det anbefales ikke å bruke brønnene der tette strukturer vises etter vekst. For passivring ble organoidfragmenter brukt til såing.Syv dager etter passivitet ble gunstig organoid gjenvekst observert med cystiske strukturer. Tette organoider bør kastes, da de ugunstige organoidene kan overta kulturen. Immunfluorescensfargingsanalyse for epitelmarkørene E-kadherin og cytokeratiner 8 og 18 bekreftet organoidenes epitelkarakter.Uttrykk for hypofyse stamcellemarkører Sox2 og Trop2 demonstrerte stemness, og hypofysespesifikk markør LHX3 viste hypofyse fenotype av organoidene. Uttrykk for markøren Ki67 viste at de organoidkonstituerende cellene er i proliferativ tilstand. RTQ PCR-analyse viste høyere uttrykk for stemnessmarkører i organoidene enn i den fremre lobe selv etter flere passasjer, og validerte berikelsen av stamceller.Det er viktig å plate riktig antall enkeltceller i ECM-kuppelen ved første sådd, og når man passerer organoidene, må man huske å re-frøfragmenter og ikke enkeltceller.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Development of Organoids from Mouse Pituitary as In Vitro Model to Explore Pituitary Stem Cell Biology

Epigenetic Conversion as a Safe and Simple Method to Obtain Insulin-secreting Cells from Adult Skin Fibroblasts

Epigenetisk konvertering som en trygg og enkel metode for å skaffe insulin-sekresjon celler fra voksne hudfibroblaster

Regenerative medicine requires new, fully functional cells that are delivered to patients in order to repair degenerated or damaged tissues. When such ...

Effective Isolation of Functional Islets from Neonatal Mouse Pancreas

Effektiv Isolering av funksjonelle holmer fra Neonatal Mouse Pancreas

Perfusion-based islet-isolation protocols from large mammalian pancreata are well established. Such protocols are readily conducted in many laboratories ...

Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos

Avledning av stamcelleforskningen linjer fra mus Preimplantation embryo

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines ...

Dissection and Coronal Slice Preparation of Developing Mouse Pituitary Gland

Disseksjon og koronale del forberedelse for å utvikle musen hypofysen

The pituitary gland or hypophysis is an important endocrine organ secreting hormones essential for homeostasis. It consists of two glands with separate ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generasjon av stillaset-fri, tredimensjonale Insulin uttrykke Pancreatoids fra musen bukspyttkjertelen Progenitors In Vitro

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

Analyse av Cardiac kammer utvikling under musen Embryogenesis bruke hele Mount Epifluorescence

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

Vurdering av oksidativ skade i primær mus okulære overflateceller / stamceller som svar på ultrafiolett-C (UV-C) skade

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...

A Static Self-Directed Method for Generating Brain Organoids from Human Embryonic Stem Cells

En statisk selvrettet metode for å generere hjerneorganoider fra humane embryonale stamceller

Human brain organoids differentiated from embryonic stem cells offer the unique opportunity to study complicated interactions of multiple cell types in a ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

Utarbeidelse av små RNA biblioteker for sekvensering fra tidlig mus embryoer

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...