Name: double-staining method to detect pectin in plant-fungus interaction
Uploaded: 2022-02-04T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Double-Staining Method to Detect Pectin in Plant-Fungus Interaction at JoVE.com

Les auteurs tiennent à remercier le Dr Hudson W. P. de Carvalho pour le soutien apporté au développement de ce travail. Les auteurs sont également reconnaissants au Laboratoire de microscopie électronique ''Prof. Elliot Watanabe Kitajima'' d’avoir fourni l’installation de microscopie optique. Les auteurs remercient le Dr Flávia Rodrigues Alves Patrício d’avoir fourni le matériel végétal avec des lésions.

1. Préparation de la solution tampon et des réactifs
<ol><li>Préparer un tampon de cacodylate de 2 M en ajoutant 4,28 g de cacodylate de sodium à 100 mL d’eau distillée et ajuster le pH à 7,25 avec 0,2 N HCl.</li>
	<li>Préparer 100 mL de la solution fixative de Karnovsky en mélangeant 10 mL de glutaraldéhyde aqueux à 25 %, 10 mL de formaldéhyde aqueux à 10 %, 25 mL de tampon cacodylate 2 M et 0,5 mL de CaCl2 26 à 0,5 M. Porter le volume à 100 mL avec d...

<ol>
	<li>deBary, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+on+the+development+of+some+parasitic+fungi.">Research on the development of some parasitic fungi.</a> Annals of Natural Sciences. 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C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+process+and+defense+response+of+two+distinct+symptoms+of+Cercospora+leaf+spot+in+coffee+leaves.">Infection process and defense response of two distinct symptoms of Cercospora leaf spot in coffee leaves.</a> Phytoparasitica. 49 (7), 727-737 (2021).</li><li>Zambolim, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coffee+tree+diseases.">Coffee tree diseases.</a> Handbook of Phytopathology: Diseases of cultivated plants. 5th ed. , 810 (2016).</li><li>Casta&#241;o, A. J. 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Le présent travail introduit un test histochimique alternatif à double coloration pour étudier la composition en pectine des parois cellulaires qui encapsule l’haustoria dans un pathosystème biotrophique. L’objectif est également de démontrer l’efficacité de la méthode pour détecter les champignons nécrotrophes et les changements de paroi cellulaire induits par celui-ci. Ici, la pectine des parois cellulaires du parenchyme du café peut encapsuler à la fois le cou et l’haustorium du champignon de rouil...

Les mécanismes de défense de la paroi cellulaire chez les plantes sont cruciaux pour contenir l’infection fongique. Des études ont rapporté des changements dans l’épaisseur et la composition de la paroi cellulaire depuis le19ème siècle 1,2. Ces changements peuvent être induits par un agent pathogène fongique qui stimule la formation d’une papille, ce qui empêche les champignons d’entrer dans la cellule ou pourrait être utilisé pour encapsuler les hyphes afin d’isoler le protoplaste de la cellule hôte de l’haustoria fongique. La production d’une barrière dynamique de la paroi cellulaire (c.-à-d. papilles et haustorium entièrement encastré) est importante pour favoriser la résistance des plantes3. Des études histopathologiques sur les maladies liées aux champignons ont étudié l’apparition de ces mécanismes et ont décrit les polymères de la paroi cellulaire, la cellulose, l’hémicellulose (arabinoxylanes) et le callose comme mécanismes de résistance à l’attaque fongique 4,5,6,7.
La paroi cellulaire est la première barrière contre les attaques micro-organismes, altérant l’interaction plante-champignon. Les polysaccharides pectiques composent la paroi cellulaire et représentent environ 30% de la composition de la paroi cellulaire dans les cellules primaires des plantes eudicot dans lesquelles les homogalacturones sont le polymère le plus abondant (environ 60%)8. Le Golgi sécrète des composés complexes de pectine qui composent les chaînes d’acide galacturonique, qui peuvent ou non être méthylées 8,9. Depuis 2012, la littérature a souligné que le degré d’estérification de la méthyle de pectine est essentiel pour déterminer la compatibilité lors de l’infection par des enzymes pectiques microbiennes 10,11,12. Ainsi, des protocoles sont nécessaires pour vérifier la présence et la distribution de composés pectiques dans les pathosystèmes plantes-champignons.
Diverses techniques ont été utilisées pour détecter l’encapsulation des papilles ou des haustoria. Les méthodes de référence utilisées sont la microscopie électronique à transmission (TEM) des tissus fixes et la microscopie optique des tissus vivants et fixes. En ce qui concerne la TEM, plusieurs études ont démontré le rôle structurel des appositions de paroi cellulaire dans la résistance fongique 13,14,15,16, et que l’utilisation de lectines et d’anticorps est une méthode complexe pour localiser les polymères glucidiques16. Cependant, des études montrent que la microscopie optique est une approche importante et que les outils histochimiques et immunohistochimiques permettent de mieux comprendre la composition des papilles et de l’enveloppe haustorium 6,7.
Les champignons pathogènes présentent deux principaux types de modes de vie: biotrophe et nécrotrophe. Les champignons biotrophes dépendent des cellules vivantes pour leur nutrition tandis que les champignons nécrotrophes tuent les cellules hôtes, puis vivent dans les tissus morts17. En Amérique latine, la rouille des feuilles de café, causée par le champignon Hemileia vastatrix, est une maladie importante dans les cultures de café18,19. Hemileia vastatrix présente un comportement biotrophe et, parmi les changements structurels observés chez les espèces de café ou les cultivars résistants, une réponse d’hypersensibilité, un dépôt de callose, de cellulose et de lignine sur les parois cellulaires, ainsi qu’une hypertrophie cellulaire14 ont été rapportés. À la connaissance des auteurs, la littérature ne rapporte pas d’informations sur l’importance de la pectine dans la résistance à la rouille du café. D’autre part, les champignons nécrotrophes qui causent la cércospose ciblent la pectine via un ensemble d’enzymes associées à la dégradation de la paroi cellulaire, telles que les pectinases et la polygalacturonase20. La cercosposporose dans le café, causée par le champignon Cercospora coffeicola est également une menace majeure pour les cultures de café21,22. Ce champignon provoque des lésions nécrotiques dans les feuilles et les baies. Après pénétration, C. coffeicola colonise les tissus végétaux par les voies intracellulaires et intercellulaires 23,24,25.
Le présent protocole étudie la présence de structures fongiques et de pectine sur les parois cellulaires. Ce protocole est utile pour identifier la réponse végétale associée à la pectine (colorée avec du colorant rouge ruthénium, qui est spécifique aux groupes acides d’acides polyuroniques de pectine), induite par l’hôte dans une interaction biotrophique avec un champignon. Il aide également à vérifier l’effet des champignons nécrotrophes sur la dégradation des parois cellulaires pectiques. Les résultats actuels indiquent que la méthode de double coloration est efficace pour discriminer les structures et la phase de reproduction des champignons.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Blades DB80 HS</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14035838383</td>
			<td>Sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cacodylate buffer</td>
			<td>EMS</td>
			<td># 11652</td>
			<td>Fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Blue Lactophenol</td>
			<td>Metaqu&#237;mica</td>
			<td>70SOLSIG024629</td>
			<td>Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>EMS</td>
			<td>#15712</td>
			<td>Fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>EMS</td>
			<td>#16216</td>
			<td>Fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Historesin Kit</td>
			<td>Technovit /EMS</td>
			<td>#14653</td>
			<td>Historesin for embedding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>Dubesser</td>
			<td>SSCD25X30-110V</td>
			<td>Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>#490040-0030-000</td>
			<td>Image capture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome (Leica RM 2540)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>149BIO000C1 14050238005</td>
			<td>Sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic molding cup tray</td>
			<td>EMS</td>
			<td>10176-30</td>
			<td>Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ruthenium red</td>
			<td>LABHouse</td>
			<td>#006004</td>
			<td>Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software Axion Vision</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>#410130-0909-000</td>
			<td>Image capture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaccum pump</td>
			<td>Prismatec</td>
			<td>131 TIPO 2 V.C.</td>
			<td>Fixation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

double-staining method to detect pectin in plant-fungus interaction

Les cellules végétales utilisent différents mécanismes structurels, constitutifs ou inductibles, pour se défendre contre les infections fongiques. L’encapsulation est un mécanisme inductible efficace pour isoler l’haustoria fongique du protoplaste des cellules végétales. Inversement, la pectine, l’un des composants polymères de la paroi cellulaire, est la cible de plusieurs enzymes pectolytiques dans les interactions nécrotrophes. Ici, un protocole pour détecter la pectine et les hyphes fongiques par microscopie optique est présenté. L’encapsulation riche en pectine dans les cellules des feuilles de café infectées par le champignon de rouille Hemileia vastatrix et la modification de la paroi cellulaire mésophylle induite par Cercospora coffeicola sont étudiées . Les échantillons de feuilles lésionnées ont été fixés avec la solution de Karnovsky, déshydratés et incorporés dans du méthacrylate de glycol pendant 2 à 4 jours. Toutes les étapes ont été suivies par pompage sous vide pour éliminer l’air dans les espaces intercellulaires et améliorer le processus d’intégration. Les blocs incorporés ont été sectionnés en sections de 5 à 7 μm d’épaisseur, qui ont été déposées sur une lame de verre recouverte d’eau et ensuite chauffées à 40 ° C pendant 30 minutes. Ensuite, les lames ont été doublement colorées avec 5% de bleu de coton dans le lactophénol pour détecter le champignon et 0,05% de ruthénium rouge dans l’eau pour détecter la pectine (groupes acides d’acides polyuroniques de pectine). On a découvert que les haustoria fongiques d’Hemileia vastatrix étaient encapsulées par la pectine. Dans la cercosposporose du café, des cellules mésophylles ont présenté une dissolution des parois cellulaires, et des hyphes intercellulaires et des conidiophores ont été observés. La méthode présentée ici est efficace pour détecter une réponse associée à la pectine dans l’interaction plante-champignon.

La coloration au lactophénol bleu coton sur la section incorporée au GMA a révélé la présence de plusieurs structures fongiques entre et à l’intérieur des cellules mésophylles du café dans les interactions fongiques biotrophes et nécrotrophes.
Dans le pathosystème biotrophique, lorsqu’il est coloré à l’aide de la méthode de double coloration, les hyphes d’Hemileia vastatrix contenant des parois cellulaires et la teneur dense en protoplastes apparaissent en bleu ...

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Double-Staining Method to Detect Pectin in Plant-Fungus Interaction

Ce protocole décrit une méthode microscopique pour détecter la pectine dans l’interaction café-champignon.

Méthode de double coloration pour détecter la pectine dans l’interaction plante-champignon

Plant cells use different structural mechanisms, either constitutive or inducible, to defend themselves from fungal infection. Encapsulation is an ...

Ce protocole est important car il permet d’identifier l’interaction plante-champignon. En plus de colorer la pectine, il démontre également des défauts sur le polymère de paroi cellulaire pathogène et permet l’identification des structures de champignons. Cette technique simple et simple peut être réalisée en microscopie optique et ne nécessite aucun équipement coûteux tel que le microscope électronique à balayage.De plus, c’est une technique rapide qui permet d’obtenir une excellente distinction des structures végétales pour les études histopathologiques. La technique identifie l’interaction plante-champignon. Par conséquent, il collabore pour diagnostiquer les maladies causées par des champignons biotrophes et nécrotrophes tels que la rouille du café et la cércospose.Pour commencer, récoltez un échantillon de feuilles d’environ 10 millimètres carrés dans la région médiane de la lésion à l’aide d’un scalpel et d’une pince à épiler, puis immergez-le dans 30 millilitres de solution fixatrice karnovsky. Soumettre l’échantillon de feuilles à un vide faible de 500 à 600 millibars pendant 15 minutes à l’aide d’une pompe à huile, au moins quatre fois pour augmenter la perméabilité de la solution fixatrice dans le tissu foliaire. Après fixation, laver l’échantillon de feuilles trois fois dans un tampon de cacodylate de 0,5 M dilué dans de l’eau distillée pendant cinq minutes chacun, puis le transférer dans une série éthanolique graduée pendant 15 minutes à chaque concentration d’éthanol.Pour transférer progressivement les échantillons en méthacrylate de glycol, faites la solution A en mélangeant le gramme de poudre de méthacrylate de glycol avec 100 millilitres de résine de base sous agitation magnétique. Ensuite, immergez les échantillons dans le rapport un à deux de la solution A et de l’éthanol à 100% pendant trois heures. Immerger les échantillons dans un rapport un à un pour la solution A: 100% éthanol pendant trois heures, puis immergé dans une résine de base pure pendant deux à quatre jours.Soumettre l’échantillon à un vide faible au moins quatre fois par jour pendant 15 minutes, suivi d’une rotation. Mélanger 15 millilitres de solution A avec un millilitre du durcisseur dans un bécher avec rotation pendant deux minutes pour produire la solution de polymérisation B.Mettre 1,2 millilitres de cette solution de polymérisation B dans des moules en plastique. À l’aide d’un pic en bois, transférez les échantillons de feuilles sectionnées de la résine de base pure à la solution B et évitez d’utiliser une pince à épiler car elles peuvent provoquer un écrasement des tissus.Assurez-vous d’orienter rapidement les échantillons de feuilles perpendiculairement aux moules en plastique car la solution B devient rapidement visqueuse. Lorsque l’orientation perpendiculaire des échantillons de feuilles est atteinte, attendez 30 minutes, puis transférez le moule en plastique dans une chambre en plastique ou en verre contenant du gel de silice pour éviter l’humidité. Une fois que la résine et l’échantillon de feuille sont polymérisés après deux à trois heures, détachez le bloc résultant du moule en plastique en ponçant la base du bloc avec une lime de ponçage.Ensuite, collez le bloc sur un morceau de bois. Coupez le bloc en sections de cinq micromètres d’épaisseur à l’aide d’un microtome rotatif équipé de lames en acier de huit centimètres. Placez les sections sur des lames de verre recouvertes d’eau distillée.Ensuite, transférez les lames sur une plaque chauffante pour sécher à 40 degrés Celsius et favorisez l’adhérence des sections aux lames en verre. Après séchage, étiquetez les lames de verre avec le nom de référence du bloc et le numéro de la diapositive. Couvrir les sections avec deux millilitres de bleu de coton à 5% de lactophénol et les chauffer sur une plaque chauffante à 45 degrés Celsius pendant cinq minutes.Enlevez l’excès de colorant en lavant la lame trois fois dans un bécher rempli d’eau distillée. Tachez-le avec deux millilitres de 0,01% de ruthénium rouge dans l’eau pendant une minute. Enlevez l’excès de colorant en lavant la lame trois fois dans un bécher rempli d’eau distillée.Placez une goutte d’eau distillée sur les sections et couvrez les sections avec un couvercle pour effectuer une analyse en microscopie optique. Dans la méthode de double coloration, les hyphes d’Hemileia vastatrix contenant des parois cellulaires et la teneur dense en protoplastes sont apparus bleu foncé dans le parenchyme spongieux et palissade. La cellule mère haustorium et l’haustoria présentaient également une couleur bleu foncé.La contre-coloration avec du rouge ruthénium a clairement défini la distribution fongique dans les espaces intercellulaires. Au cours de l’interaction, la cellule mère d’Hemileia vastatrix haustorium a brisé la paroi de la cellule hôte et a développé un cou haustorial entouré de composés pectiques. L’encapsulation rose-rouge riche en pectine du cou haustorial ne peut empêcher la formation haustoriale.Dans certains cas, l’encapsulation riche en pectine a enveloppé l’haustorium de manière incomplète. Et dans certains cas, l’haustorium est entièrement encapsulé. La paroi cellulaire riche en pectine maintient l’intégrité à la frontière de la lésion, où le champignon n’est pas présent.La méthode de double coloration a démontré la présence d’hyphes intercellulaires. Dans les zones d’interaction, les parois cellulaires de la pectine semblaient perdre leur intégrité en raison de la dissolution. Des structures reproductrices telles que des conidies ont été trouvées dans l’épiderme adaxial.Les hyphes de Cercospora coffeicola ont été trouvés dans la chambre substomatique sous forme de structures de curling, et le parenchyme de palissade dans la région de la lésion semble subir une lyse de la paroi cellulaire. Évitez d’utiliser une pince à épiler car elles peuvent provoquer un écrasement des tissus. D’autres études histopathologiques sur les rouilles, l’anthracnose, la cércospoliose, les smuts et d’autres interactions biotrophes, hémibiotrophes et nécrotrophes entre les plantes et les champignons devraient être menées pour étudier l’utilisation potentielle de cette technique dans différents pathosystèmes.

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