Name: f&#246;rster resonance energy transfer mapping: a new methodology to elucidate global structural features
Uploaded: 2022-03-16T13:45:00
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这项工作得到了美国国立卫生研究院拨款R15GM135904（授予IM）和美国国立卫生研究院拨款GM110552（授予DBO）的支持。

1. 标签站点的选择
<ol><li>鉴定至少三个潜在的标记位点，以对现有蛋白质结构上的假定结合位点进行三角测量。在这种情况下，鉴定出通过遗传融合附着在SecA上的SecA，SecYEG和前蛋白2。<ol>
<li>选择在推定结合位点的25-75 Å范围内的标记位点，并且在蛋白质的相对静态区域中，距离将决定要使用的特定FRET染料对36。将标记位点定位在彼此相对不同的?...

通过使用FRET映射方法，我们鉴定了SecA蛋白上的信号序列结合位点。重要的是，该复合物的3-D晶体结构的存在极大地促进了我们的研究。这种制图方法的优势在于能够使用现有结构来识别要标注的位置。这种方法不能用于确定3D结构;然而，结构元件56的测定、现有结构49的细化、结合位点位置2、32的测定或动态运动<sup ...

对于蛋白质，动力学的阐明以及3维（3-D）结构知识可以增强对生物分子系统的结构 - 功能关系的理解。结构方法，如X射线晶体学和低温电子显微镜，捕获静态结构，并且通常需要确定多个结构以阐明生物分子结合和动力学的各个方面1。本文讨论了一种基于解决方案的方法来映射全局结构元素，例如结合位点或结合相互作用，这些元素可能更短暂，并且不容易被静态方法捕获。这种方法的强候选系统是先前已通过X射线晶体学，NMR光谱或其他结构方法确定3-D结构的系统。在这种情况下，我们利用SecA-SecYEG复合物的X射线晶体结构（蛋白质一般分泌途径中的核心参与者），在前蛋白穿过膜2之前，使用Förster共振能量转移（FRET）绘制信号肽结合位点的位置。通过基因修饰对生物系统的操纵加上我们对3-D结构的了解，使得能够在插入通道 3之前立即确定信号序列和早期成熟区域的构象。
FRET涉及能量从一个分子（供体）到另一个分子（受体）的无辐射转移，其距离依赖性方式是通过空间4，5。通过供体的减少或受体荧光强度的增加来监测这种转移的效率。能量传递的效率可谓
E = R06/（R06 + R6）
其中 R0 值是传输效率为 50% 的距离6。该技术以前被描述为分子尺，并且根据供体 - 受体染料4，7，8，9的身份，有效地确定2.5-12nm范围内的距离。使用或不使用受体的供体荧光强度和寿命允许确定转移效率，因此距离为5，8。由于该技术的可用性，该方法的灵敏度和易用性，FRET在单分子荧光光谱和共聚焦显微镜6等领域也得到了广泛的应用。荧光蛋白（如绿色荧光蛋白）的出现使得细胞内动力学和活细胞成像的观察相对容易10，11。许多 FRET 应用程序（如此类）将在此虚拟问题中详细讨论。
在这项研究中，我们特别关注使用FRET测量来产生距离值以确定结构细节。以前，FRET测量已被有效地用于确定DNA分子在与蛋白质12，13，14结合时的构象，蛋白质的内部动力学以及蛋白质结合相互作用15，16，17。这种方法的优点在于能够确定具有相对较少材料量的溶液中的柔性和动态结构单元。值得注意的是，当与现有结构信息结合使用时，这种方法特别有效，不能用作3-D结构测定的手段。如果工作建立在现有的结构信息之上，并且通常与计算仿真18，19相结合，则该方法可提供最佳的结构洞察力和细化。在这里，描述了使用从稳态和时间分辨的FRET测量中获得的距离来绘制结合位点，其位置尚不清楚，在SecA-SecYEG复合物的现有晶体结构上，主要蛋白质在一般分泌途径3中。
一般分泌途径是一种高度保守的系统，从原核生物到真核生物再到古菌，介导蛋白质穿过或进入膜到其在细胞中的功能位置的运输。对于革兰氏阴性菌，例如我们研究中使用的生物体 大肠杆菌 ，蛋白质入或穿过内膜转移到周质。细菌SecY通道复合物（称为转座蛋白）与其他蛋白质协调以转移新合成的蛋白质，该蛋白质通过通常位于N端20，21的信号序列被引导到其在细胞中的正确位置。对于与围质结合的蛋白质，ATPase SecA蛋白与核糖体的出口隧道相关，并且在翻译了大约100个残基22个后与前蛋白相关。与SecB伴侣蛋白一起，它将前蛋白维持在未折叠状态。SecA与SecYEG转座结合，并通过ATP水解的许多循环，促进蛋白质在膜上的转运23，24。
SecA是一种多结构域蛋白，以胞质和膜结合形式存在。SecA是细胞质基质中的同源二甲基蛋白，由前蛋白结合或交联结构域25，两个核苷酸结合结构域，螺旋翼结构域，螺旋支架结构域和两个螺旋指（THF）26，27，28，29 组成（图1）。在先前对SecA-SecYEG复合物的晶体学研究中，THF的位置表明它积极参与蛋白质易位，随后与信号肽的交联实验进一步确定了该区域在蛋白质易位30，31中的重要性。先前使用FRET映射方法的研究表明，外源信号肽与SecA2，32的该区域结合。为了在插入SecYEG通道之前充分了解信号序列的构象和位置以及前蛋白的早期成熟区域，创建了一种蛋白质嵌合体，其中通过Ser-Gly连接子将早期成熟区域的信号序列和残基连接到SecA（图1）。使用这种生物学上可行的结构，进一步证明前蛋白的信号序列和早期成熟区域以平行的方式与THF结合2。随后，使用FRET映射方法阐明了在SecYEG存在下信号序列和早期成熟区域的构象和位置，如下所述3。
了解SecA-SecYEG复合物33，34，35的3-D结构和结合位点的可能位置，使我们能够明智地将供体 - 受体标签放置在各个FRET距离的交集识别结合位点位置的位置。这些FRET映射测量表明，信号序列和前蛋白的早期成熟区域形成发夹，尖端位于SecYEG通道的口，表明发夹结构在通道插入之前是模板化的。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>490 nm LED laser</td>
			<td>Horiba</td>
			<td>1684-LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 C2 Maleimide//DIBO Alkyne</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A20347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Difco</td>
			<td>DF0812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 C5 Maleimide/DIBO Alkyne</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A10254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 DIBO Alkyne</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S10904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 DIBO Alkyne</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S10906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra&#173;4 Centrifugal filter (50kDa MWCO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>UFC805008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dodecylmaltoside (DDM)</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli alkaline phosphatase signal peptide SP22</td>
			<td>Biomolecules Midwest</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Synthesized custom item</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>extended signal peptide SP41</td>
			<td>Biomolecules Midwest</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Synthesized custom item</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluorEssence</td>
			<td>Horiba</td>
			<td>version 2.4</td>
			<td>spectral acquisition program for Fluoromax4 spectrofluorometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromax 4 spectrofluorometer</td>
			<td>Horiba</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlobalsWE</td>
			<td>Laboratory for Fluorescence Dynamics, University of California, Irvine</td>
			<td></td>
			<td>spectral analysis program for time-resolved decays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H&#173;4&#173;Azido&#173;Phe&#173;OH</td>
			<td>BACHEM</td>
			<td>4020250.0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB (Miller) Broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9723</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ludox HS-40 colloidal silica (40 wt.% suspension in H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>420816</td>
			<td>dilution is needed to make a proper scattering solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTI Felix GX</td>
			<td>Horiba</td>
			<td>version 4.1.0.4096</td>
			<td>spectral acquisition program for PTI Time Master Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTI Time Master Instrument</td>
			<td>Horiba</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pymol Molecular Graphics Program</td>
			<td>Schrodinger</td>
			<td>version 2.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>NESLAB RTE 10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

f&#246;rster resonance energy transfer mapping: a new methodology to elucidate global structural features

Förster共振能量转移（FRET）是一种基于荧光的成熟方法，用于成功测量 体外 生物分子内和细胞内的距离。在FRET中，通过荧光强度或寿命的变化来测量能量转移的效率与两个荧光分子或标记之间的距离有关。从远处测定动力学和构象变化只是该方法应用于生物系统的一些示例。在某些条件下，该方法可以通过提供有关动力学，柔韧性和对结合表面的适应性的信息来增加和增强现有的X射线晶体结构。我们描述了使用FRET和相关距离测定来阐明结构性质，通过识别结合位点或二聚体亚基的方向。通过明智地选择标记位点，并经常采用多种标记策略，我们成功地应用了这些映射方法来确定蛋白质-DNA复合物和SecA-SecYEG蛋白质易位系统中的全局结构性质。在SecA-SecYEG系统中，我们使用FRET映射方法来识别前蛋白结合位点并确定结合信号序列区域的局部构象。本研究概述了进行FRET绘图研究的步骤，包括识别适当的标记位点，讨论可能的标记，包括非天然氨基酸残基，标记程序，如何进行测量以及解释数据。

这项研究的重点是在将前蛋白插入SecYEG通道之前确定SecA上前蛋白结合位点的位置。为了绘制结合位点，在前蛋白的不同区域和SecA和SecYEG蛋白上的三个不同位置之间进行了FRET实验（图1A-D）。从获得的距离和SecA，SecYEG和前蛋白的三维结构中，预测了前蛋白结合位点的位置。不是使用三个独立的实体（SecA，SecYEG和前蛋白）来执行这些测量，而是在掺入...

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F&#246;rster Resonance Energy Transfer Mapping: A New Methodology to Elucidate Global Structural Features

该研究详细介绍了FRET映射的方法，包括标记位点的选择，染料的选择，采集和数据分析。该方法可有效确定蛋白质系统中的结合位点、构象变化和动态运动，如果与现有的3-D结构信息结合使用，这种方法最有用。

福斯特共振能量转移映射：阐明全球结构特征的新方法

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) is an established fluorescence-based method used to successfully measure distances in and between ...

我们开发了一种FRET映射方法，可以鉴定和表征配体结合位点，亚基取向，与配体结合相关的构象变化以及蛋白质的动态运动。这种技术的一个优点是它可以在溶液中进行，分子可以自由移动。通过该技术测量的距离适用于生物系统。FRET 广泛适用于许多系统。绘图增强了对任何生物分子系统中的结构和动态变化的监测，如果存在三维结构信息，则特别有效。纯化蛋白质后，最难的部分是高效标记，并去除游离染料。对于实验，尽可能少的游离染料是有帮助的。首先，选择在惩罚性结合位点的25至75埃范围内以及蛋白质相对静态区域的标记位点。距离将决定要使用的特定FRET染料对。将标记位点定位在彼此相对不同的蛋白质区域中。因此，这些位点描述了三角形的顶点，惩罚性结合位点位于中心。为了测量R0值，根据所需的比色皿尺寸和体积，以相同总蛋白质浓度制备两个蛋白质样品。一种仅用供体染料标记蛋白质，另一种仅用受体染料标记蛋白质。如果使用光谱荧光计，请打开荧光计并在FluorEssence软件中打开光谱采集和分析程序。单击红色 M 将计算机连接到仪器，然后选择发射光谱。使用采集实验菜单项输入扫描参数，例如激发波长、发射扫描范围、温度和样品会改变您的位置。单击RTC并优化仪器设置，如手稿中所述，通过使用在染料吸收最大值处设置的激发波长监测峰值处的荧光发射。将供体标记的蛋白质样品置于样品支架中，然后单击运行以生成仅用供体染料标记的蛋白质的发射扫描，方法是在染料吸收最大值处激发样品，并在发射峰上进行扫描。通过将扫描扩展到峰值末尾的25至50纳米处，为扫描建立基线。如文本手稿中所述，通过对不同浓度的样品进行吸收和荧光测量来测量仅供体蛋白质的量子产率。以相同的浓度制备仅供体蛋白、仅受体蛋白和供体-受体蛋白样品。获得供体仅扫描即可产生荧光发射光谱。在供体染料吸收最大值处激发溶液，并在供体和受体发射峰上扫描。将样品更换为仅受体蛋白，或更改样品将您的位置更改为仅含有受体蛋白的比色皿。仅获得用受体染料标记的蛋白质的发射扫描。在供体激发波长处激发样品。将样品更换为供体-受体蛋白样品或更改样品，将位置更改为含有供体-受体标记蛋白的比色皿。使用相同的设置获得供体 - 受体蛋白样品的发射扫描。对于所有光谱，通过减去扫描结束时测量的背景计数来校正背景荧光。使用 3D 图形查看程序（如 PyMOL）将距离映射到结构上，方法是将脚本中的命令直接输入到具有相应距离信息的命令窗口中。为测量的每个距离和相关误差生成一个壳体。通过不同外壳的交集映射位置。使用SecA和SecYEG上的三个不同位置以及信号肽上的四个不同位置绘制信号肽结合位点。FRET在前蛋白的不同区域与SecA和SecYEG蛋白上的三个不同位置之间进行FRET实验，绘制了前蛋白结合位点和取向。信号肽的惩罚性结合位点先前被确定为双螺旋指，SecA C端尾巴表明方向平行于双螺旋指。得到SecA37、磷酸化钼和磷酸化钚22之间的稳态FRET光谱。供体强度的降低表明从PhoA22转移的能量更大。相对于距离SecA37更远的PhoA2站点。时间分辨荧光衰变光谱表明，供体-受体复合物具有较短的均质衰变，与与一个距离相关的能量转移一致。在SecA PhoA2残基和三角化位点之间构建的FRET距离壳表明，每个壳都与双螺旋指相交，假设的结合位点以绿色显示。相交区域小于每个FRET壳，并且包括来自螺旋支架的大量贡献。FRET在PhoA2残基和标记位点之间确定的壳的距离，描述了位于靠近双螺旋指尖和SecYEG通道口的较小区域。这个相交的区域位于PhoA2的双螺旋指的另一端。需要考虑的重要事项包括正确选择标记位点以对感兴趣区域进行三角测量，测量每个位点的量子产率，并去除所有游离染料。该方法与通过NMR或X射线晶体学等方法获得的结构信息一致。当FRET结果被放入结构上下文中时，它可以增强现有信息。

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