Name: f&#246;rster resonance energy transfer mapping: a new methodology to elucidate global structural features
Uploaded: 2022-03-16T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about FÃ¶rster Resonance Energy Transfer Mapping: A New Methodology to Elucidate Global Structural Features at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health grant R15GM135904 (tildelt IM) og National Institutes of Health Grant GM110552 (tildelt DBO).

1. Udvælgelse af mærkningssteder
<ol><li>Identificer mindst tre potentielle mærkningssteder for at triangulere det formodede bindingssted på de eksisterende proteinstrukturer. I dette tilfælde blev SecA, SecYEG og preprotein knyttet til SecA gennem genetisk fusion identificeret2.<ol>
<li>Vælg mærkningssteder inden for 25-75 Å fra det formodede bindingssted, og i relativt statiske områder af proteinet bestemmer afstanden det specifikke FRET-farvestofpar, der skal bruges<...

Ved hjælp af FRET-kortlægningsmetoden identificerede vi signalsekvensbindingsstedet på SecA-proteinet. Det er vigtigt, at tilstedeværelsen af en 3-D krystalstruktur af komplekset i høj grad lettede vores undersøgelse. Styrken ved denne kortlægningsmetode ligger i evnen til at bruge en eksisterende struktur til at identificere steder til mærkning. Denne metode kan ikke bruges til at bestemme en 3D-struktur; bestemmelse af strukturelle elementer56, forfining af en eksisterende struktur<sup c...

For proteiner fører belysning af dynamik sammen med 3-dimensionel (3-D) strukturel viden til en forbedret forståelse af struktur-funktionsforhold mellem biomolekylære systemer. Strukturelle metoder, såsom røntgenkrystallografi og kryogen elektronmikroskopi, fanger en statisk struktur og kræver ofte bestemmelse af flere strukturer for at belyse aspekter af biomolekylebinding og dynamik1. Denne artikel diskuterer en løsningsbaseret metode til kortlægning af globale strukturelle elementer, såsom bindingssteder eller bindingsinteraktioner, der potentielt er mere forbigående og mindre lette at fange ved statiske metoder. Stærke kandidatsystemer til denne metode er dem, hvor en 3D-struktur tidligere er blevet bestemt ved røntgenkrystallografi, NMR-spektroskopi eller andre strukturelle metoder. I dette tilfælde udnytter vi røntgenkrystalstrukturen i SecA-SecYEG-komplekset, en central aktør i proteinets generelle sekretoriske vej, til at kortlægge placeringen af et signalpeptidbindingssted ved hjælp af Förster resonansenergioverførsel (FRET) inden transport af præproteinet over membranen2. Manipulation af det biologiske system gennem genetiske modifikationer kombineret med vores viden om 3D-strukturen muliggjorde bestemmelsen af konformationen af signalsekvensen og det tidlige modne område umiddelbart før indsættelse i kanal 3.
FRET involverer strålingsfri overførsel af energi fra et molekyle (donor) til et andet (acceptor) på en afstandsafhængig måde, der er gennem rum 4,5. Effektiviteten af denne overførsel overvåges gennem enten et fald i donor eller en stigning i acceptorfluorescensintensitet. Effektiviteten af energioverførsel kan beskrives som
E = R06/(R06 + R6)
hvor R0-værdien er den afstand, hvor overførslen er 50% effektiv6. Teknikken er tidligere blevet beskrevet som en molekylær lineal og er effektiv til at bestemme afstande i området 2,5-12 nm, afhængigt af identiteten af donoracceptorfarvestofferne 4,7,8,9. Donorfluorescensensensiteterne og levetiderne med eller uden acceptor gør det muligt at bestemme overførselseffektiviteten og dermed afstande 5,8. På grund af teknologiens tilgængelighed, metodens følsomhed og brugervenlighed har FRET også fundet bred anvendelse på områder som enkeltmolekyle fluorescensspektroskopi og konfokal mikroskopi6. Fremkomsten af fluorescerende proteiner såsom grønt fluorescerende protein har gjort observationen af intracellulær dynamik og levende celledannelse relativt letkøbt10,11. Mange FRET-applikationer som disse diskuteres detaljeret i dette virtuelle nummer.
I denne undersøgelse fokuserer vi især på brugen af FRET-målinger til at give afstandsværdier til bestemmelse af strukturelle detaljer. Tidligere er FRET-målinger blevet anvendt effektivt til at bestemme konformationen af DNA-molekyler, når de er bundet til protein 12,13,14, proteiners indre dynamik og proteinbindingsinteraktioner 15,16,17. Fordelene ved denne metode ligger i evnen til at bestemme fleksible og dynamiske strukturelle elementer i en løsning med relativt lave mængder materiale. Det er vigtigt, at denne metode er særlig effektiv, når den anvendes sammen med eksisterende strukturelle oplysninger og ikke kan bruges som et middel til bestemmelse af 3D-struktur. Metoden giver den bedste indsigt og forfinelse af struktur, hvis arbejdet bygger på eksisterende strukturelle oplysninger ofte kombineret med beregningssimulering18,19. Her beskrives brugen af afstande opnået fra steady-state og tidsopløste FRET-målinger til at kortlægge et bindingssted, hvis placering ikke var kendt, på en eksisterende krystallografisk struktur af SecA-SecYEG-komplekset, større proteiner i den generelle sekretoriske vej3.
Den generelle sekretoriske vej, et stærkt bevaret system fra prokaryoter til eukaryoter til arkæer, formidler transporten af proteiner enten over eller ind i membranen til deres funktionelle placering i cellen. For gramnegative bakterier, såsom E. coli, den organisme, der anvendes i vores undersøgelse, indsættes proteiner i eller translokeres over den indre membran til periplasmen. Det bakterielle SecY-kanalkompleks (kaldet translocon) koordinerer med andre proteiner for at translokere det nyligt syntetiserede protein, som er rettet mod dets korrekte placering i cellen gennem en signalsekvens, der typisk er placeret ved N-terminalen20,21. For proteiner bundet til periplasmen associeres ATPase SecA-proteinet med ribosomets udgangstunnel og med præproteinet, efter at ca. 100 rester er blevet oversat22. Sammen med SecB chaperone-proteinet opretholder det præproteinet i en udfoldet tilstand. SecA binder sig til SecYEG-translocon og letter gennem mange cyklusser af ATP-hydrolyse proteintransport over membranen23,24.
SecA er et multidomæneprotein, der findes i cytosoliske og membranbundne former. Et homodimerisk protein i cytosolen, SecA består af et præproteinbindende eller tværbindende domæne25, to nukleotidbindende domæner, et spiralformet vingedomæne, et spiralformet stilladsdomæne og to helixfinger (THF)26,27,28,29 (figur 1). I tidligere krystallografiske undersøgelser af SecA-SecYEG-komplekset antydede placeringen af THF, at det var aktivt involveret i proteintranslokation, og efterfølgende tværbindingseksperimenter med signalpeptidet fastslog yderligere betydningen af denne region i proteintranslokation30,31. Tidligere undersøgelser ved hjælp af FRET-kortlægningsmetoden viste, at eksogene signalpeptider binder til denne region af SecA 2,32. For fuldt ud at forstå konformationen og placeringen af signalsekvensen og den tidlige modne region af præproteinet inden indsættelse i SecYEG-kanalen blev der oprettet en proteinkimera, hvor signalsekvensen og resterne fra det tidlige modne område blev fastgjort til SecA gennem en Ser-Gly-linker (figur 1). Ved hjælp af denne biologisk levedygtige konstruktion blev det yderligere demonstreret, at signalsekvensen og den tidlige modne region af præproteinet binder til THF på en parallel måde2. Efterfølgende blev FRET-kortlægningsmetoden brugt til at belyse konformationen og placeringen af signalsekvensen og det tidlige modne område i nærværelse af SecYEG som beskrevet nedenfor3.
Kendskab til 3D-strukturen i SecA-SecYEG-komplekset 33,34,35 og den mulige placering af bindingsstedet gjorde det muligt for os med omtanke at placere donor-acceptor-etiketter på steder, hvor skæringspunktet mellem individuelle FRET-afstande identificerer bindingsstedets placering. Disse FRET-kortlægningsmålinger afslørede, at signalsekvensen og det tidlige modne område af præproteinet danner en hårnål med spidsen placeret ved mundingen af SecYEG-kanalen, hvilket viser, at hårnålstrukturen er skabeloniseret før kanalindsættelse.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>490 nm LED laser</td>
			<td>Horiba</td>
			<td>1684-LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 C2 Maleimide//DIBO Alkyne</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A20347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Difco</td>
			<td>DF0812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 C5 Maleimide/DIBO Alkyne</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A10254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 DIBO Alkyne</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S10904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 DIBO Alkyne</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S10906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra&#173;4 Centrifugal filter (50kDa MWCO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>UFC805008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dodecylmaltoside (DDM)</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli alkaline phosphatase signal peptide SP22</td>
			<td>Biomolecules Midwest</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Synthesized custom item</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>extended signal peptide SP41</td>
			<td>Biomolecules Midwest</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Synthesized custom item</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluorEssence</td>
			<td>Horiba</td>
			<td>version 2.4</td>
			<td>spectral acquisition program for Fluoromax4 spectrofluorometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromax 4 spectrofluorometer</td>
			<td>Horiba</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlobalsWE</td>
			<td>Laboratory for Fluorescence Dynamics, University of California, Irvine</td>
			<td></td>
			<td>spectral analysis program for time-resolved decays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H&#173;4&#173;Azido&#173;Phe&#173;OH</td>
			<td>BACHEM</td>
			<td>4020250.0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB (Miller) Broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9723</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ludox HS-40 colloidal silica (40 wt.% suspension in H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>420816</td>
			<td>dilution is needed to make a proper scattering solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTI Felix GX</td>
			<td>Horiba</td>
			<td>version 4.1.0.4096</td>
			<td>spectral acquisition program for PTI Time Master Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTI Time Master Instrument</td>
			<td>Horiba</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pymol Molecular Graphics Program</td>
			<td>Schrodinger</td>
			<td>version 2.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>NESLAB RTE 10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

f&#246;rster resonance energy transfer mapping: a new methodology to elucidate global structural features

Förster resonans energioverførsel (FRET) er en etableret fluorescensbaseret metode, der anvendes til succesfuldt at måle afstande i og mellem biomolekyler in vitro såvel som i celler. I FRET vedrører effektiviteten af energioverførsel, målt ved ændringer i fluorescensintensitet eller levetid, afstanden mellem to fluorescerende molekyler eller etiketter. Bestemmelse af dynamik og konformationsændringer fra afstandene er blot nogle eksempler på anvendelser af denne metode til biologiske systemer. Under visse omstændigheder kan denne metode tilføje til og forbedre eksisterende røntgenkrystalstrukturer ved at give information om dynamik, fleksibilitet og tilpasning til bindende overflader. Vi beskriver brugen af FRET og tilhørende afstandsbestemmelse til at belyse strukturelle egenskaber gennem identifikation af et bindingssted eller orienteringen af dimerunderenheder. Gennem velovervejet valg af mærkningssteder og ofte anvendelse af flere mærkningsstrategier har vi med succes anvendt disse kortlægningsmetoder til at bestemme globale strukturelle egenskaber i et protein-DNA-kompleks og SecA-SecYEG-proteintranslokationssystemet. I SecA-SecYEG-systemet har vi brugt FRET-kortlægningsmetoder til at identificere præproteinbindingsstedet og bestemme den lokale konformation af det bundne signalsekvensområde. Denne undersøgelse skitserer trinene til udførelse af FRET-kortlægningsundersøgelser, herunder identifikation af passende mærkningssteder, diskussion af mulige etiketter, herunder ikke-indfødte aminosyrerester, mærkningsprocedurer, hvordan man udfører målinger og fortolkning af dataene.

Denne undersøgelse fokuserede på at bestemme placeringen af præproteinbindingsstedet på SecA inden indsættelse af præproteinet i SecYEG-kanalen. For at kortlægge bindingsstedet blev FRET-eksperimenter udført mellem forskellige regioner af præproteinet og tre forskellige steder på SecA- og SecYEG-proteinerne (figur 1A-D). Fra de opnåede afstande og tredimensionelle strukturer af SecA, SecYEG og preproteinet blev placeringen af præproteinbindingsst...

Watch this Scientific Journal Video about FÃ¶rster Resonance Energy Transfer Mapping: A New Methodology to Elucidate Global Structural Features at JoVE.com

F&#246;rster Resonance Energy Transfer Mapping: A New Methodology to Elucidate Global Structural Features

Undersøgelsen beskriver metoden til FRET-kortlægning, herunder valg af mærkningssteder, valg af farvestoffer, erhvervelse og dataanalyse. Denne metode er effektiv til bestemmelse af bindingssteder, konformationsændringer og dynamiske bevægelser i proteinsystemer og er mest nyttig, hvis den udføres sammen med eksisterende 3D-strukturelle oplysninger.

Förster Resonans Energy Transfer Mapping: En ny metode til at belyse globale strukturelle træk

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) is an established fluorescence-based method used to successfully measure distances in and between ...

Vi har udviklet en FRET-kortlægningsmetode, der muliggør identifikation og karakterisering af ligandbindingssteder, underenhedsorientering, konformationsændringer forbundet med ligandbinding og dynamiske bevægelser af proteiner. En fordel ved denne teknik er, at den kan udføres i opløsning, og molekylerne kan bevæge sig frit rundt. De afstande, der måles ved denne teknik, er passende for biologiske systemer.FRET er bredt anvendelig på mange systemer. Kortlægning forbedrer overvågningen af strukturelle og dynamiske ændringer i ethvert biomolekylært system og er særlig effektiv, hvis der findes tredimensionel strukturel information. Efter rensning af proteinet er den sværeste del mærkning med høj effektivitet og fjernelse af det frie farvestof.Til eksperimenterne hjælper det at have så lidt frit farvestof som muligt. Til at begynde med skal du vælge mærkningssteder inden for 25 til 75 angstrom fra det straffende bindingssted og i relativt statiske områder af proteinet. Afstanden bestemmer det specifikke FRET-farvestofpar, der skal bruges.Find mærkningsstederne i proteinområder, der er relativt forskellige fra hinanden. Så webstederne beskriver hjørnerne af en trekant, med det straffende bindingssted placeret i midten. For at måle R0-værdierne, afhængigt af den ønskede kuvettestørrelse og volumen, skal du forberede to proteinprøver i samme koncentration af total protein.En med proteinet mærket med donorfarvestoffet kun, og en med proteinet mærket med acceptorfarvestoffet kun. Tænd for fluorometeret, og åbn spektraloptagelses- og analyseprogrammet i FluorEssence-softwaren, hvis du bruger et spektrofluorometer. Klik på det røde M for at slutte computeren til instrumentet, og vælg Emissionsspektre.Indtast scanningsparametre ved hjælp af menupunktet saml eksperiment, såsom excitationsbølgelængde, området for emissionsscanning, temperatur og prøve ændre din position. Klik på RTC og optimerede instrumentindstillinger som beskrevet i manuskriptet ved at overvåge fluorescensemissionen ved toppen ved hjælp af en excitationsbølgelængde indstillet til farvestoffets absorptionsmaksimum. Placer den donormærkede proteinprøve i prøveholderen, og klik på kør for at generere en emissionsscanning af proteinet, der kun er mærket med donorfarvestoffet, ved at spænde prøven ved farvestofabsorptionsmaksimum og scanne over emissionstoppen.Opret en basislinje for scanningen ved at forlænge scanningen med 25 til 50 nanometer forbi slutningen af toppen. Mål kvanteudbyttet af donorproteinet ved at udføre absorptioner og fluorescensmålinger på prøver af forskellige koncentrationer, som beskrevet i tekstmanuskriptet. Forbered kun donorprotein, acceptorprotein og donoracceptorproteinprøver i samme koncentration.Få donorscanningen kun for at generere fluorescensemissionsspektre. Exciter opløsningen ved donorfarveabsorptionsmaksimum, og scan over donor- og acceptoremissionstoppene. Enten udveksle prøven til acceptor kun protein, eller ændre prøven ændre din position til kuvetten indeholder acceptor kun protein.Få en emissionsscanning af proteinet, der kun er mærket med acceptorfarvestoffet. Exciter prøven ved donorens excitationsbølgelængde. Udskift prøven til donor-acceptorproteinprøven, eller skift prøven skift din position til kuvetten, der indeholder donoracceptormærket protein.Få en emissionsscanning af donor-acceptorproteinprøven ved hjælp af de samme indstillinger. For alle spektre skal du korrigere baggrundsfluorescens ved at trække baggrundstællingerne målt i slutningen af scanningen. Brug et 3D grafisk visningsprogram som PyMOL til at kortlægge afstandene til strukturen ved direkte at indtaste kommandoerne fra scriptet i kommandovinduet med de relevante afstandsoplysninger.Generer en skal for hver målt afstand og den tilhørende fejl. Kortlæg positionen gennem krydset mellem de forskellige skaller. Signalpeptidbindingsstedet blev kortlagt ved hjælp af tre forskellige placeringer på SecA og SecYEG og fire forskellige placeringer på signalpeptidet.FRET-eksperimenter mellem forskellige regioner af præproteinet og tre forskellige steder på SecA- og SecYEG-proteinerne kortlægger præproteinbindingsstedet og orienteringen. Signalpeptidets straffebindingssted blev tidligere identificeret som to-helix-fingeren, og SecA C-terminal halen foreslog en orientering parallelt med to-helix-fingeren. Steady state FRET-spektre mellem SecA37 og PhoA2 og PhoA22 blev opnået.Reduktion i donorintensiteten indikerede, at større energi overført fra PhoA22. I forhold til PhoA2-stedet, som ligger længere væk fra SecA37. Tidsopløst fluorescenshenfaldsspektre viste, at donor-acceptorkomplekset har et kortere homogent henfald i overensstemmelse med energioverførsel forbundet med en afstand.FRET-afstandskaller konstrueret mellem SecA PhoA2-resterne og de triangulerede steder viste, at hver skal skærer med to-helixfingeren, det antagne bindingssted, som er vist med grønt. Det krydsede område er mindre end hver FRET-skal og inkluderer et stort bidrag fra det spiralformede stillads. FRET-afstandskaller bestemt mellem PhoA2-resterne og de mærkede steder beskriver et mindre område placeret tættere på spidsen af to-helixfingeren og munden på SecYEG-kanalen.Dette krydsede område ligger i den modsatte ende af to-helixfingeren fra PhoA2. Vigtige ting at overveje inkluderer korrekt valg af mærkningsstederne for at triangulere interesseområdet, for at måle kvanteudbyttet for hvert sted og fjerne alt det frie farvestof. Denne metode stemmer overens med strukturelle oplysninger opnået med metoder som NMR eller røntgenkrystallografi.Når FRET-resultaterne sættes ind i en strukturel sammenhæng, kan det forbedre den eksisterende information.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Protein Complex Affinity Capture fra Cryomilled pattedyrsceller

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Brug Stillads Liposomer at Rekonstituer Lipid-proksimal protein-protein interaktioner<em&gt; In vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Atomar skala strukturelle undersøgelser af makromolekylære forsamlinger af Solid-state Kernemagnetisk resonans-spektroskopi

Supramolecular protein assemblies play fundamental roles in biological processes ranging from host-pathogen interaction, viral infection to the ...

Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation

Kvantitative immunofluorescens foranstaltning globale lokaliseret Oversættelse

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and ...

Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1

Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1

Elektrokemisk detektion af Deuterium Kinetic isotop effekt på ekstracellulære elektron Transport i Shewanella oneidensis hr.-1

Direct electrochemical detection of c-type cytochrome complexes embedded in the bacterial outer membrane (outer membrane c-type cytochrome complexes; OM ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Bruger i Vitro fluorescens resonans energioverførsel at studere dynamikken i proteinkomplekser på en millisekund tidsskala

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Removal and Replacement of Endogenous Ligands from Lipid-Bound Proteins and Allergens

Fjernelse og udskiftning af endogene ligands fra Lipid-Bound Proteiner og allergener

Many major allergens bind to hydrophobic lipid-like molecules, including Mus m 1, Bet v 1, Der p 2, and Fel d 1. These ligands are strongly retained and ...

NMR-Based Fragment Screening in a Minimum Sample but Maximum Automation Mode

NMR-baseret fragmentscreening i en minimumsprøve, men maksimal automatiseringstilstand

Fragment-based screening (FBS) is a well-validated and accepted concept within the drug discovery process both in academia and industry. The greatest ...

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis

Enkeltmolekyle fluorescens energioverførsel undersøgelse af ribosom proteinsyntese

The ribosome is a large ribonucleoprotein complex that assembles proteins processively along mRNA templates. The diameter of the ribosome is approximately ...

F&#246;rster Resonance Energy Transfer Measurements in Living Plant Cells

Förster Resonans Energioverførsel Målinger i Levende PlanteCeller

Sensitized emission-based F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) experiments are easily done but depend on the microscopic setup. Confocal laser ...