Name: f&#246;rster resonance energy transfer mapping: a new methodology to elucidate global structural features
Uploaded: 2022-03-16T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about FÃ¶rster Resonance Energy Transfer Mapping: A New Methodology to Elucidate Global Structural Features at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענק R15GM135904 של המכונים הלאומיים לבריאות (הוענק ל- IM) ומענק המכונים הלאומיים לבריאות GM110552 (הוענק ל- DBO).

1. בחירת אתרי תיוג
<ol><li>זהה לפחות שלושה אתרי תיוג פוטנציאליים כדי לשלש את אתר הקשירה הפוטטיבי על מבני החלבונים הקיימים. במקרה זה, SecA, SecYEG ופרפרוטאין המחוברים ל- SecA באמצעות איחוי גנטי זוהו2.<ol>
<li>בחר אתרי תיוג בטווח של 25-75 Å מאתר הקשירה הפוטטיבי ובאזורים סטטיים יחסית של ה...

באמצעות שימוש במתודולוגיית המיפוי של FRET, זיהינו את אתר קשירת רצף האותות בחלבון SecA. חשוב לציין שנוכחותו של מבנה גבישי תלת-ממדי של המתחם הקלה מאוד על המחקר שלנו. כוחה של מתודולוגיית מיפוי זו טמון ביכולת להשתמש במבנה קיים כדי לזהות מיקומים לתיוג. לא ניתן להשתמש במתודולוגיה זו כדי לקבוע מבנה ת?...

עבור חלבונים, הבהרת הדינמיקה יחד עם ידע מבני תלת-ממדי (תלת-ממדי) מובילה להבנה משופרת של יחסי מבנה-תפקוד של מערכות ביו-מולקולריות. שיטות מבניות, כגון קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן ומיקרוסקופיית אלקטרונים קריוגנית, לוכדות מבנה סטטי ולעתים קרובות דורשות קביעת מבנים מרובים כדי להבהיר היבטים של קשירת ביו-מולקולציה ודינמיקה1. מאמר זה דן בשיטה מבוססת פתרון למיפוי אלמנטים מבניים גלובליים, כגון אתרי קשירה או אינטראקציות איגוד, שעשויים להיות ארעיים יותר ופחות קלים ללכידה בשיטות סטטיות. מערכות מועמדות חזקות למתודולוגיה זו הן כאלה שבהן מבנה תלת-ממדי נקבע בעבר על ידי קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן, ספקטרוסקופיה של NMR או שיטות מבניות אחרות. במקרה זה, אנו מנצלים את המבנה הגבישי של קרני הרנטגן של קומפלקס SecA-SecYEG, שחקן מרכזי במסלול ההפרשה הכללי של חלבונים, כדי למפות את מיקומו של אתר קשירת פפטידי אותות באמצעות העברת אנרגיית תהודה של Förster (FRET) לפני הובלת הפרפרוטאין על פני הממברנה2. מניפולציה של המערכת הביולוגית באמצעות שינויים גנטיים יחד עם הידע שלנו על המבנה התלת-ממדי אפשרו את קביעת הקונפורמציה של רצף האותות והאזור הבוגר המוקדם מיד לפני ההחדרה לערוץ 3.
FRET כולל העברה נטולת קרינה של אנרגיה ממולקולה אחת (תורם) לאחרת (מקבל) באופן תלוי מרחק שנמצא דרך חלל 4,5. היעילות של העברה זו מנוטרת באמצעות ירידה בתורם או עלייה בעוצמת הפלואורסצנציה של המקבלים. ניתן לתאר את היעילות של העברת אנרגיה כ
E = R06/(R06 + R6)
שבו ערך R0 הוא המרחק שבו ההעברה יעילה ב-50%6. הטכניקה תוארה בעבר כשליט מולקולרי והיא יעילה בקביעת מרחקים בטווח של 2.5-12 ננומטר, בהתאם לזהותם של צבעי התורם-מקבל 4,7,8,9. עוצמות הפלואורסצנציה של התורם ואורך החיים עם או בלי מקבל מאפשרים קביעת יעילות ההעברה וכתוצאה מכך, מרחקים 5,8. בשל זמינות הטכנולוגיה, רגישות השיטה וקלות השימוש, FRET מצאה יישום רחב גם בתחומים כגון ספקטרוסקופיה פלואורסצנטית של מולקולה אחת ומיקרוסקופיה קונפוקלית6. הופעתם של חלבונים פלואורסצנטיים כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק הפכה את התצפית על דינמיקה תוך-תאית והדמיה של תאים חיים לקלה יחסיתל-10,11. יישומי FRET רבים כגון אלה נדונים בפירוט בנושא וירטואלי זה.
במחקר זה, אנו מתמקדים במיוחד בשימוש במדידות FRET כדי להניב ערכי מרחק כדי לקבוע פרטים מבניים. בעבר, נעשה שימוש יעיל במדידות FRET כדי לקבוע את הקונפורמציה של מולקולות דנ"א כאשר הן קשורות לחלבון 12,13,14, לדינמיקה הפנימית של חלבונים ולאינטראקציות קושרות חלבונים 15,16,17. היתרונות של שיטה זו טמונים ביכולת לקבוע אלמנטים מבניים גמישים ודינמיים בתמיסה עם כמויות נמוכות יחסית של חומר. באופן משמעותי, שיטה זו יעילה במיוחד כאשר משתמשים בה בשילוב עם מידע מבני קיים ואינה יכולה לשמש כאמצעי לקביעת מבנה תלת-ממדי. השיטה מספקת את התובנה הטובה ביותר ואת העידון של המבנה אם העבודה מתבססת על מידע מבני קיים שלעתים קרובות בשילוב עם סימולציה חישובית18,19. כאן מתואר השימוש במרחקים המתקבלים ממדידות FRET במצב יציב ובזמן לפתרון זמן כדי למפות אתר מחייב, שמיקומו לא היה ידוע, על מבנה קריסטלוגרפי קיים של קומפלקס SecA-SecYEG, חלבונים עיקריים במסלול ההפרשה הכללי3.
מסלול ההפרשה הכללי, מערכת שמורה מאוד, מפרוקריוטים דרך אאוקריוטים ועד ארכיאה, מתווך את העברת החלבונים לרוחב או לתוך הממברנה למיקומה התפקודי של התא. עבור חיידקים גראם-שליליים, כגון E. coli, האורגניזם ששימש במחקר שלנו, חלבונים מוחדרים לתוך הממברנה הפנימית או עוברים טרנסלוקציה על פני הממברנה הפנימית לפריפלסמה. קומפלקס תעלות ה-SecY החיידקי (המכונה טרנסלוקון) מתאם עם חלבונים אחרים כדי לבצע טרנסלוקציה של החלבון המסונתז החדש, המופנה למיקומו הנכון בתא באמצעות רצף אותות הממוקם בדרך כלל ב-N-terminus20,21. עבור חלבונים הקשורים לפריפלזמה, החלבון ATPase SecA מתחבר למנהרת היציאה של הריבוזום, ועם הפריפרוטאין לאחר שכ-100 שאריות תורגמו22. יחד עם חלבון המלווה של SecB, הוא שומר על הפרפרוטאין במצב של התגלגלות. SecA נקשר לטרנסלוקון SecYEG, ובאמצעות מחזורים רבים של הידרוליזה של ATP, מאפשר הובלת חלבונים על פני הממברנה23,24.
SecA הוא חלבון רב-תחומי שקיים בצורות ציטוזוליות וממברנה הקשורות לממברנה. החלבון ההומודימרי בציטוזול, SecA מורכב מתחום קשירת פרפרוטאין או קישור צולב25, שני תחומים קושרי נוקלאוטידים, תחום כנף סלילית, תחום פיגומים סליליים ושתי אצבעות סליל (THF)26,27,28,29 (איור 1). במחקרים קריסטלוגרפיים קודמים של קומפלקס SecA-SecYEG, מיקומו של ה-THF הציע כי הוא היה מעורב באופן פעיל בטרנסלוקציה של חלבונים וניסויים צולבים שלאחר מכן עם פפטיד האותות ביססו עוד יותר את המשמעות של אזור זה בטרנסלוקציה של חלבונים30,31. מחקרים קודמים, שהשתמשו במתודולוגיית המיפוי FRET, הראו כי פפטידי אותות אקסוגניים נקשרים לאזור זה של SecA 2,32. כדי להבין באופן מלא את הקונפורמציה והמיקום של רצף האותות והאזור הבוגר המוקדם של הפרה-פרוטאין לפני ההחדרה לתעלת SecYEG, נוצרה כימרה חלבונית שבה רצף האותות והשאריות של האזור הבוגר המוקדם חוברו ל-SecA באמצעות מקשר Ser-Gly (איור 1). באמצעות מבנה בר-קיימא ביולוגית זה, הוכח עוד יותר כי רצף האותות והאזור הבוגר המוקדם של הפרפרוטאין נקשרים ל-THF באופן מקביל2. לאחר מכן, מתודולוגיית מיפוי FRET שימשה כדי להבהיר את הקונפורמציה והמיקום של רצף האותות והאזור הבוגר המוקדם בנוכחות SecYEG כמתואר להלן3.
הידע על המבנה התלת-ממדי של מתחם SecA-SecYEG 33,34,35 והמיקום האפשרי של אתר הכריכה אפשרו לנו למקם באופן שיפוטי תוויות תורמים-מקבלים במיקומים שבהם ההצטלבות של מרחקי FRET בודדים מזהה את מיקום אתר הכריכה. מדידות מיפוי FRET אלה גילו כי רצף האותות והאזור הבוגר המוקדם של הפרפרוטאין יוצרים סיכת שיער עם הקצה הממוקם בפתחו של ערוץ SecYEG, מה שמדגים כי מבנה סיכות השיער מעוצב לפני החדרת התעלה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>490 nm LED laser</td>
			<td>Horiba</td>
			<td>1684-LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 C2 Maleimide//DIBO Alkyne</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A20347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Difco</td>
			<td>DF0812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 C5 Maleimide/DIBO Alkyne</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A10254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 DIBO Alkyne</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S10904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 DIBO Alkyne</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S10906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra&#173;4 Centrifugal filter (50kDa MWCO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>UFC805008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dodecylmaltoside (DDM)</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli alkaline phosphatase signal peptide SP22</td>
			<td>Biomolecules Midwest</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Synthesized custom item</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>extended signal peptide SP41</td>
			<td>Biomolecules Midwest</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Synthesized custom item</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluorEssence</td>
			<td>Horiba</td>
			<td>version 2.4</td>
			<td>spectral acquisition program for Fluoromax4 spectrofluorometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromax 4 spectrofluorometer</td>
			<td>Horiba</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlobalsWE</td>
			<td>Laboratory for Fluorescence Dynamics, University of California, Irvine</td>
			<td></td>
			<td>spectral analysis program for time-resolved decays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H&#173;4&#173;Azido&#173;Phe&#173;OH</td>
			<td>BACHEM</td>
			<td>4020250.0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB (Miller) Broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9723</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ludox HS-40 colloidal silica (40 wt.% suspension in H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>420816</td>
			<td>dilution is needed to make a proper scattering solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTI Felix GX</td>
			<td>Horiba</td>
			<td>version 4.1.0.4096</td>
			<td>spectral acquisition program for PTI Time Master Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTI Time Master Instrument</td>
			<td>Horiba</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pymol Molecular Graphics Program</td>
			<td>Schrodinger</td>
			<td>version 2.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>NESLAB RTE 10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

f&#246;rster resonance energy transfer mapping: a new methodology to elucidate global structural features

העברת אנרגיית תהודה של פורסטר (FRET) היא שיטה מבוססת פלואורסצנטיות מבוססת המשמשת למדידה מוצלחת של מרחקים בתוך ובין ביו-מולקולות במבחנה , כמו גם בתוך תאים. ב-FRET, היעילות של העברת אנרגיה, הנמדדת על ידי שינויים בעוצמת הפלואורסצנציה או באורך החיים, מתייחסת למרחק בין שתי מולקולות או תוויות פלואורסצנטיות. קביעת דינמיקה ושינויים קונפורמיים מהמרחקים הם רק כמה דוגמאות ליישומים של שיטה זו למערכות ביולוגיות. בתנאים מסוימים, מתודולוגיה זו יכולה להוסיף ולשפר מבנים גבישיים קיימים של קרני רנטגן על ידי מתן מידע לגבי דינמיקה, גמישות והתאמה למשטחי קישור. אנו מתארים את השימוש ב-FRET ובקביעות מרחק נלוות כדי להבהיר תכונות מבניות, באמצעות זיהוי אתר איגוד או אוריינטציות של תת-יחידות דימר. באמצעות בחירה מושכלת של אתרי תיוג, ולעתים קרובות שימוש באסטרטגיות תיוג מרובות, יישמנו בהצלחה שיטות מיפוי אלה כדי לקבוע תכונות מבניות גלובליות בקומפלקס חלבון-DNA ובמערכת טרנסלוקציה של חלבונים SecA-SecYEG. במערכת SecA-SecYEG, השתמשנו בשיטות מיפוי FRET כדי לזהות את אתר קישור הפרה-פרוטאין ולקבוע את ההתאמה המקומית של אזור רצף האותות המאוגדים. מחקר זה מתאר את השלבים לביצוע מחקרי מיפוי FRET, כולל זיהוי אתרי תיוג מתאימים, דיון בתוויות אפשריות, כולל שאריות של חומצות אמינו שאינן מקומיות, הליכי תיוג, כיצד לבצע מדידות ופירוש הנתונים.

מחקר זה התמקד בקביעת המיקום של אתר קשירת הפרהפרוטאין ב- SecA לפני הכנסת הפרפרוטאין לערוץ SecYEG. כדי למפות את אתר הקשירה, ניסויי FRET בוצעו בין אזורים שונים של הפרפרוטאין ושלושה מיקומים נפרדים בחלבוני SecA ו-SecYEG (איור 1A-D). מהמרחקים שהתקבלו והמבנים התלת-ממדיים של SecA...

Watch this Scientific Journal Video about FÃ¶rster Resonance Energy Transfer Mapping: A New Methodology to Elucidate Global Structural Features at JoVE.com

F&#246;rster Resonance Energy Transfer Mapping: A New Methodology to Elucidate Global Structural Features

המחקר מפרט את המתודולוגיה של מיפוי FRET כולל בחירת אתרי תיוג, בחירת צבעים, רכישה וניתוח נתונים. מתודולוגיה זו יעילה בקביעת אתרי קשירה, שינויים קונפורמיים ותנועות דינמיות במערכות חלבונים, והיא שימושית ביותר אם היא מבוצעת בשילוב עם מידע מבני תלת-ממדי קיים.

מיפוי העברת אנרגיית תהודה של Förster: מתודולוגיה חדשה להבהרת תכונות מבניות גלובליות

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) is an established fluorescence-based method used to successfully measure distances in and between ...

פיתחנו מתודולוגיית מיפוי FRET המאפשרת זיהוי ואפיון של אתרי קשירת ליגנד, אוריינטציה של תת-יחידות, שינויים קונפורמיים הקשורים לקשירת ליגנד ותנועות דינמיות של חלבונים. יתרון של טכניקה זו הוא שניתן לבצע אותה בתמיסה והמולקולות יכולות לנוע בחופשיות. המרחקים הנמדדים בטכניקה זו מתאימים למערכות ביולוגיות.FRET ישים באופן נרחב למערכות רבות. מיפוי משפר את הניטור של שינויים מבניים ודינמיים בכל מערכת ביומולקולרית, והוא יעיל במיוחד אם קיים מידע מבני תלת מימדי. לאחר טיהור החלבון, החלק הקשה ביותר הוא תיוג ביעילות גבוהה, והסרת הצבע החופשי.עבור הניסויים, זה עוזר לקבל כמה שפחות צבע חופשי. כדי להתחיל, בחר אתרי תיוג בטווח של 25 עד 75 אנגסטרום מאתר הקשירה הענישתי, ובאזורים סטטיים יחסית של החלבון. המרחק יקבע את זוג צבעי ה-FRET הספציפי שישמש.אתר את אתרי הסימון באזורי חלבונים הנבדלים יחסית זה מזה. אז האתרים מתארים את הקודקודים של משולש, כאשר אתר הקשירה הענישתי ממוקם במרכז. כדי למדוד את ערכי ה-R0, בהתאם לגודל ולנפח הרצויים, הכינו שתי דגימות חלבון באותו ריכוז של סך החלבון.אחד עם החלבון המסומן בצבע התורם בלבד, ואחד עם החלבון המסומן בצבע המקבל בלבד. הפעל את הפלואורומטר ופתח את תוכנית הרכישה והניתוח הספקטרלית בתוכנת FluorEssence, אם אתה משתמש בספקטרופלואורומטר. לחץ על M האדום כדי לחבר את המחשב למכשיר ובחר ספקטרום פליטה.הזן פרמטרי סריקה באמצעות פריט תפריט הניסויים של האיסוף, כגון אורך גל של עירור, הטווח לסריקת פליטה, טמפרטורה ומדגם משנים את מיקומך. לחץ על RTC ועל הגדרות מכשיר אופטימליות כמתואר בכתב היד, על ידי ניטור פליטת הפלואורסצנציה בשיא באמצעות אורך גל עירור שנקבע במקסימום הקליטה של הצבע. הניחו את דגימת החלבון המסומנת על ידי התורם במחזיק הדגימה, ולחצו על Run כדי ליצור סריקת פליטה של החלבון המסומן בצבע התורם בלבד, על ידי הזזת הדגימה למקסימום ספיגת הצבעים, וסריקה מעל שיא הפליטה.קבעו קו בסיס לסריקה על ידי הארכת הסריקה ב-25 עד 50 ננומטר מעבר לסוף הפסגה. מדוד את התפוקה הקוונטית של החלבון התורם היחיד על ידי ביצוע ספיגות ומדידות פלואורסצנטיות על דגימות בריכוזים שונים, כמתואר בכתב היד של הטקסט. הכינו חלבון תורם בלבד, חלבון מקבל בלבד ודגימות חלבון המקבל-תורם, באותו ריכוז.קבל את התורם רק סריקה כדי ליצור ספקטרום פליטה פלואורסצנטית. להלהיב את התמיסה במקסימום ספיגת הצבעים של התורם, ולסרוק את שיאי הפליטה של התורם והמקבל. החלף את הדגימה בחלבון המקבל בלבד, או שנה את הדגימה שנה את מיקומך לקובט המכיל את החלבון המקבל בלבד.קבל סריקת פליטה של החלבון המסומן בצבע המקבל בלבד. לעורר את הדגימה באורך הגל של עירור התורם. החלף את הדגימה לדגימת החלבון המקבלת-תורם או שנה את הדגימה שנה את מיקומך ל-cuvette המכיל את החלבון המסומן על ידי התורם-מקבל.קבל סריקת פליטה של דגימת החלבון המקבלת-תורם באמצעות אותן הגדרות. עבור כל הספקטרום, תקן את הפלואורסצנציה ברקע על-ידי הפחתת ספירות הרקע שנמדדו בסוף הסריקה. השתמש בתוכנית צפייה גרפית תלת-ממדית כגון PyMOL כדי למפות את המרחקים למבנה, על-ידי הזנה ישירה של הפקודות מסקריפט ה- Script לחלון הפקודה עם מידע המרחק המתאים.צור מעטפת עבור כל מרחק שנמדד והשגיאה המשויכת. מפה את המיקום דרך ההצטלבות של הקונכיות השונות. אתר קשירת פפטיד האותות מופה באמצעות שלושה מיקומים שונים ב-SecA וב-SecYEG, וארבעה מיקומים שונים על פפטיד האות.ניסויי FRET בין אזורים שונים של הקדם-חלבון ושלושה מיקומים שונים בחלבוני SecA ו-SecYEG ממפים את האתר והכיוון של טרום-קשירת החלבון. אתר הקשירה הענישתי של פפטיד האות זוהה בעבר כאצבע בעלת שני הסלילים, וזנב ה-SecA C-terminal הציע כיוון מקביל לאצבע בעלת שני הסלילים. ספקטרום FRET במצב יציב בין SecA37, לבין PhoA2, ו- PhoA22, הושגו.ירידה בעוצמת התורם הצביעה על כך שאנרגיה גדולה יותר הועברה מ-PhoA22. יחסית לאתר PhoA2, שנמצא רחוק יותר מ- SecA37. ספקטרום דעיכה פלואורסצנטית שנפתר בזמן הראה כי לקומפלקס התורם-מקבל יש דעיכה הומוגנית קצרה יותר התואמת להעברת אנרגיה הקשורה למרחק אחד.פגזי מרחק FRET שנבנו בין שאריות SecA PhoA2, לבין האתרים המשולשים, הראו כי כל פגז מצטלב עם האצבע בעלת שני הסלילים, אתר הקשירה המשוער, המוצג בירוק. השטח המצטלב קטן יותר מכל מעטפת FRET וכולל תרומה גדולה מהפיגום הסלילי. פגזי מרחק FRET שנקבעו בין שאריות PhoA2 לבין האתרים המסומנים, מתארים שטח קטן יותר הממוקם קרוב יותר לקצה האצבע בעלת שני הסלילים ולפה של תעלת SecYEG.אזור מצטלב זה ממוקם בקצה הנגדי של אצבע שני הסלילים מ- PhoA2. דברים חשובים שיש לקחת בחשבון כוללים בחירה נכונה של אתרי הסימון כדי לשלש את תחום העניין, למדוד את התשואות הקוונטיות עבור כל אתר ולהסיר את כל הצבעים החופשיים. שיטה זו מתיישרת עם מידע מבני המתקבל בשיטות כמו NMR או קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן.כאשר מכניסים את תוצאות ה- FRET להקשר מבני זה יכול לשפר את המידע הקיים.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

לכידת חלבון זיקה מורכבת מ בתאי יונקי Cryomilled

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

באמצעות הפיגום ליפוזומים כדי לשקם אינטראקציות ליפידים-הפרוקסימלי חלבונים<em&gt; במבחנה</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

מחקרים מבניים אטומי בקנה מידה של הרכבות Macromolecular על ידי תהודה מגנטית גרעינית solid-state ספקטרוסקופיה

Supramolecular protein assemblies play fundamental roles in biological processes ranging from host-pathogen interaction, viral infection to the ...

Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation

Immunofluorescence כמותי מודדים הגלובלי לשפות אחרות תרגום

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and ...

Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1

Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1

אלקטרוכימי זיהוי של דאוטריום קינטי איזוטופ אפקט על חוץ-תאית אלקטרון התחבורה מר Shewanella oneidensis -1

Direct electrochemical detection of c-type cytochrome complexes embedded in the bacterial outer membrane (outer membrane c-type cytochrome complexes; OM ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

שימוש בהעברת אנרגיה פלורסצנטיות תהודה חוץ גופית ללמוד את הדינמיקה של חלבון מתחמי בקנה מידה הזמן אלפיות השנייה

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Removal and Replacement of Endogenous Ligands from Lipid-Bound Proteins and Allergens

הסרה והחלפה של ליגנדים אנדוגניים מחלבונים ואלרגנים הקשורים לשומנים

Many major allergens bind to hydrophobic lipid-like molecules, including Mus m 1, Bet v 1, Der p 2, and Fel d 1. These ligands are strongly retained and ...

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis

מולקולה בודדת פלואורסצנטית העברת אנרגיה מחקר של סינתזת חלבון ריבוזום

The ribosome is a large ribonucleoprotein complex that assembles proteins processively along mRNA templates. The diameter of the ribosome is approximately ...

F&#246;rster Resonance Energy Transfer Measurements in Living Plant Cells

מדידות העברת אנרגיה תהודה Förster בתאי צמח חיים

Sensitized emission-based F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) experiments are easily done but depend on the microscopic setup. Confocal laser ...

Time-resolved F&#246;rster Resonance Energy Transfer Assays for Measurement of Endogenous Phosphorylated STAT Proteins in Human Cells

בדיקות העברת אנרגיה תהודה Förster נפתר זמן למדידה של חלבונים STAT זרחן אנדוגני בתאים אנושיים

The Janus kinase (JAK)/signal transducer and activator of transcription (STAT) signaling pathway plays a crucial role in mediating cellular responses to ...