Name: f&#246;rster resonance energy transfer mapping: a new methodology to elucidate global structural features
Uploaded: 2022-03-16T13:45:00
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이 연구는 국립 보건원 보조금 R15GM135904 (IM에 수여)와 국립 보건원 GM110552 (DBO에 수여)에 의해 지원되었습니다.

1. 라벨링 사이트 선택
<ol><li>기존 단백질 구조 상의 추정적 결합 부위를 삼각 측량하기 위해 적어도 세 개의 잠재적 표지 부위를 동정한다. 이 경우, 유전자 융합을 통해 SecA에 부착된 SecA, SecYEG 및 프리단백질이 확인되었다2.<ol>
<li>추정적 결합 부위의 25-75 Å 이내 및 단백질의 비교적 정적 영역 내에서 표지 부위를 선택하고, 거리는 사용되는 특정 FRET 염료 쌍을 결?...

FRET 매핑 방법론의 사용을 통해, 우리는 SecA 단백질 상의 신호 서열 결합 부위를 동정하였다. 중요하게도, 복합체의 3-D 결정 구조의 존재는 우리의 연구를 크게 촉진했습니다. 이 매핑 방법론의 강점은 기존 구조를 사용하여 레이블링을 위한 위치를 식별하는 능력에 있습니다. 이 방법론은 3-D 구조를 결정하는 데 사용할 수 없습니다. 그러나, 구조 요소(56)의 결정, 기존 구조물(49)?...

단백질의 경우, 3차원(3차원) 구조 지식과 함께 역학의 해명은, 생체분자 시스템의 구조-기능 관계에 대한 이해를 향상시킨다. X선 결정학 및 극저온 전자 현미경과 같은 구조적 방법은 정적 구조를 포착하고 종종 생체 분자 결합 및 역학의 측면을 밝히기 위해 여러 구조의 결정을 필요로합니다1. 이 문서에서는 결합 부위 또는 결합 상호 작용과 같은 전역 구조 요소를 매핑하는 솔루션 기반 방법에 대해 설명합니다.이 요소는 잠재적으로 더 일시적이며 정적 방법에 의해 덜 쉽게 캡처됩니다. 이 방법론에 대한 강력한 후보 시스템은 3-D 구조가 이전에 X선 결정학, NMR 분광법 또는 기타 구조적 방법에 의해 결정된 시스템이다. 이 경우, 우리는 단백질 일반 분비 경로의 중심자인 SecA-SecYEG 복합체의 X선 결정 구조를 활용하여프리단백질을 멤브레인을 가로지르는 수송 전에 Förster 공명 에너지 전달(FRET)을 사용하여 신호 펩티드 결합 부위의 위치를 매핑합니다. 3-D 구조에 대한 우리의 지식과 결합 된 유전 적 변형을 통한 생물학적 시스템의 조작은 채널 3에 삽입되기 직전에 신호 서열 및 초기 성숙 영역의 입체 형태를 결정할 수있었습니다.
FRET는 공간 4,5를 통과하는 거리 의존적 방식으로 한 분자(공여체)로부터 다른 분자(수용체)로 에너지의 방사선 없는 전달을 포함한다. 이 전달의 효율은 공여체의 감소 또는 수용체 형광 강도의 증가를 통해 모니터링됩니다. 에너지 전달의 효율은 다음과 같이 설명 할 수 있습니다.
E = R0 6/(R06 +R6)
여기서 R0 값은 전사가50% 효율인 거리이다(6). 이 기술은 이전에 분자 통치자로서 기술되었으며, 공여체-수용체 염료 4,7,8,9의 동일성에 따라 2.5-12 nm 범위의 거리를 결정하는데 효과적이다. 공여체 형광 강도 및 수명은 수용체 유무에 관계없이 전달 효율의 결정을 허용하고 결과적으로 거리 5,8을 허용한다. 기술의 가용성, 방법의 감도 및 사용 편의성으로 인해 FRET는 단일 분자 형광 분광법 및 공초점 현미경6과 같은 분야에서 광범위한 적용을 발견했습니다. 녹색 형광 단백질과 같은 형광 단백질의 출현은 세포 내 역학 및 살아있는 세포 이미징의 관찰을 비교적 용이하게10,11로 만들었다. 이와 같은 많은 FRET 응용 프로그램은이 가상 문제에서 자세히 설명합니다.
이 연구에서는 특히 FRET 측정을 사용하여 구조적 세부 사항을 결정하기 위해 거리 값을 산출하는 데 중점을 둡니다. 이전에는 FRET 측정이 단백질 12,13,14에 결합할 때 DNA 분자의 입체형태, 단백질의 내부 역학 및 단백질 결합 상호작용 15,16,17을 결정하는데 효과적으로 사용되었다. 이 방법의 장점은 상대적으로 적은 양의 재료를 가진 솔루션에서 유연하고 역동적 인 구조 요소를 결정할 수있는 능력에 있습니다. 중요한 것은이 방법이 기존 구조 정보와 함께 사용될 때 특히 효과적이며 3-D 구조 결정 수단으로 사용할 수 없다는 것입니다. 이 방법은 작업이 종종 계산 시뮬레이션18,19와 결합 된 기존 구조 정보를 기반으로하는 경우 구조의 최상의 통찰력과 구체화를 제공합니다. 여기서, 정상 상태 및 시간-분해능 FRET 측정으로부터 수득된 거리의 사용은 일반적인 분비 경로에서 SecA-SecYEG 복합체의 기존 결정학적 구조 상에서, 주요 단백질의 위치를 알려지지 않았던 결합 부위를 맵핑하기 위해 기술된다3.
원핵생물에서 진핵생물, 고세균에 이르기까지 고도로 보존된 시스템인 일반 분비 경로는 단백질을 세포에서 기능적 위치로 또는 막으로 운반하는 것을 매개합니다. 우리의 연구에 사용 된 유기체 인 대장균과 같은 그람 음성 박테리아의 경우 단백질은 내막을 가로 질러 주변 세포로 삽입되거나 전좌됩니다. 박테리아 SecY 채널 복합체 (트랜스로콘이라고 함)는 새로 합성 된 단백질을 전좌시키기 위해 다른 단백질과 협조하며, 이는 일반적으로 N 말단20,21에 위치한 신호 서열을 통해 세포 내의 정확한 위치로 향합니다. 주변형질에 결합된 단백질의 경우, ATPase SecA 단백질은 리보솜의 출구 터널과 연관되고, 약 100개의 잔기가 번역된 후 프리단백질과 연관된다(22). SecB 샤페론 단백질과 함께, 프리단백질을 펼쳐진 상태로 유지한다. SecA는 SecYEG 트랜스로콘에 결합하고, ATP 가수분해의 많은 사이클을 통해, 막(23,24)을 가로지르는 단백질 수송을 용이하게 한다.
SecA는 세포질 및 막 결합 형태로 존재하는 다중 도메인 단백질이다. 시토졸 내의 동종이량체 단백질로서, SecA는 프리단백질 결합 또는 가교 도메인25, 2개의 뉴클레오티드-결합 도메인, 나선형 날개 도메인, 나선형 스캐폴드 도메인, 및 2개의 나선 손가락(THF)26,27,28,29로 구성된다(도 1). SecA-SecYEG 복합체의 이전의 결정학적 연구에서, THF의 위치는 단백질 전좌 및 신호 펩티드를 사용한 후속 가교 실험에 적극적으로 관여하였음을 시사하였고, 단백질 전좌30,31에서 이 영역의 중요성을 더욱 확립하였다. FRET 매핑 방법론을 사용한 이전의 연구들은 외인성 신호 펩티드가 SecA2,32의 이 영역에 결합한다는 것을 입증하였다. SecYEG 채널 내로 삽입하기 전에 예비단백질의 신호 서열 및 초기 성숙 영역의 입체 형태 및 위치를 완전히 이해하기 위해, 초기 성숙 영역의 신호 서열 및 잔기가 Ser-Gly 링커를 통해 SecA에 부착되는 단백질 키메라가 생성되었다(도 1). 이러한 생물학적으로 실행 가능한 구축물을 사용하여, 예비단백질의 신호 서열 및 초기 성숙 영역이 병렬 방식으로 THF에 결합한다는 것을 추가로 입증하였다2. 이어서, FRET 매핑 방법론을사용하여 후술하는 바와 같이 SecYEG의 존재 하에 신호 서열 및 초기 성숙 영역의 입체 형태 및 위치를 밝히기 위해 사용되었다.
SecA-SecYEG 복합체33,34,35의 3-D 구조와 결합 부위의 가능한 위치에 대한 지식을 통해 개별 FRET 거리의 교차점이 결합 부위 위치를 식별하는 위치에 기증자 - 수용체 라벨을 신중하게 배치 할 수있었습니다. 이러한 FRET 매핑 측정은 프리단백질의 신호 서열 및 초기 성숙 영역이 SecYEG 채널의 입에 위치한 팁과 함께 헤어핀을 형성한다는 것을 밝혀내고, 헤어핀 구조가 채널 삽입 전에 템플리트된다는 것을 입증한다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>490 nm LED laser</td>
			<td>Horiba</td>
			<td>1684-LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 C2 Maleimide//DIBO Alkyne</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A20347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Difco</td>
			<td>DF0812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 C5 Maleimide/DIBO Alkyne</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A10254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 DIBO Alkyne</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S10904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 DIBO Alkyne</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S10906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra&#173;4 Centrifugal filter (50kDa MWCO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>UFC805008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dodecylmaltoside (DDM)</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli alkaline phosphatase signal peptide SP22</td>
			<td>Biomolecules Midwest</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Synthesized custom item</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>extended signal peptide SP41</td>
			<td>Biomolecules Midwest</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Synthesized custom item</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluorEssence</td>
			<td>Horiba</td>
			<td>version 2.4</td>
			<td>spectral acquisition program for Fluoromax4 spectrofluorometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromax 4 spectrofluorometer</td>
			<td>Horiba</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlobalsWE</td>
			<td>Laboratory for Fluorescence Dynamics, University of California, Irvine</td>
			<td></td>
			<td>spectral analysis program for time-resolved decays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H&#173;4&#173;Azido&#173;Phe&#173;OH</td>
			<td>BACHEM</td>
			<td>4020250.0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB (Miller) Broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9723</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ludox HS-40 colloidal silica (40 wt.% suspension in H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>420816</td>
			<td>dilution is needed to make a proper scattering solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTI Felix GX</td>
			<td>Horiba</td>
			<td>version 4.1.0.4096</td>
			<td>spectral acquisition program for PTI Time Master Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTI Time Master Instrument</td>
			<td>Horiba</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pymol Molecular Graphics Program</td>
			<td>Schrodinger</td>
			<td>version 2.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>NESLAB RTE 10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

f&#246;rster resonance energy transfer mapping: a new methodology to elucidate global structural features

Förster 공명 에너지 전달 (FRET)은 생체 관 내 뿐만 아니라 세포 내에서도 생체 분자 사이의 거리를 성공적으로 측정하는 데 사용되는 확립 된 형광 기반 방법입니다. FRET에서, 형광 강도 또는 수명의 변화에 의해 측정되는 에너지 전달의 효율은 두 형광 분자 또는 라벨 사이의 거리와 관련된다. 거리로부터의 역학 및 형태 변화의 결정은 생물학적 시스템에 대한 이 방법의 적용의 몇 가지 예에 불과하다. 특정 조건 하에서, 이 방법론은 결합 표면에 대한 역학, 유연성 및 적응에 관한 정보를 제공함으로써 기존의 X선 결정 구조를 추가하고 향상시킬 수 있다. 우리는 결합 부위의 식별 또는 이량체 서브유닛의 배향을 통해 구조적 특성을 밝히기 위한 FRET와 연관된 거리 결정의 사용을 기술한다. 라벨링 부위의 신중한 선택과 종종 여러 라벨링 전략의 고용을 통해, 우리는 단백질-DNA 복합체 및 SecA-SecYEG 단백질 전좌 시스템에서 글로벌 구조적 특성을 결정하기 위해 이러한 매핑 방법을 성공적으로 적용했습니다. SecA-SecYEG 시스템에서, 우리는 프리단백질 결합 부위를 확인하고 결합된 신호 서열 영역의 국소 입체형태를 결정하기 위해 FRET 매핑 방법을 사용하였다. 이 연구는 적절한 라벨링 부위의 식별, 비천연 아미노산 잔기를 포함한 가능한 라벨에 대한 논의, 라벨링 절차, 측정 수행 방법 및 데이터 해석을 포함하여 FRET 매핑 연구를 수행하는 단계를 간략하게 설명합니다.

이 연구는 SecYEG 채널 내로 프리단백질을 삽입하기 전에 SecA 상의 프리단백질 결합 부위의 위치를 결정하는 데 초점을 맞추었다. 결합 부위를 매핑하기 위해, 프리단백질의 상이한 영역과 SecA 및 SecYEG 단백질 상의 세 개의 별개의 위치 사이에서 FRET 실험을 수행하였다(도 1A-D). SecA, SecYEG, 및 프리단백질의 거리 및 입체 구조로부터 프리단백질 결합 부?...

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F&#246;rster Resonance Energy Transfer Mapping: A New Methodology to Elucidate Global Structural Features

이 연구는 라벨링 사이트 선택, 염료 선택, 수집 및 데이터 분석을 포함한 FRET 매핑의 방법론을 자세히 설명합니다. 이 방법론은 단백질 시스템에서 결합 부위, 형태 변화 및 동적 운동을 결정하는 데 효과적이며 기존 3-D 구조 정보와 함께 수행 할 때 가장 유용합니다.

Förster 공명 에너지 전달 매핑: 글로벌 구조적 특징을 밝히기 위한 새로운 방법론

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) is an established fluorescence-based method used to successfully measure distances in and between ...

우리는 리간드 결합 부위의 확인 및 특성화, 서브유닛 배향, 리간드 결합과 관련된 형태적 변화, 단백질의 동적 운동을 허용하는 FRET 매핑 방법론을 개발했습니다. 이 기술의 장점은 용액에서 수행 할 수 있고 분자가 자유롭게 움직일 수 있다는 것입니다. 이 기술로 측정 된 거리는 생물학적 시스템에 적합합니다.FRET는 많은 시스템에 광범위하게 적용됩니다. 매핑은 모든 생체 분자 시스템의 구조적 및 동적 변화에 대한 모니터링을 향상 시키며 입체 구조 정보가 존재하는 경우 특히 효과적입니다. 단백질을 정제 한 후, 가장 어려운 부분은 고효율로 라벨링하고 자유 염료를 제거하는 것입니다.실험을 위해, 가능한 한 적은 자유 염료를 갖는 것이 도움이됩니다. 시작하려면 징벌적 결합 부위의 25 ~ 75 옹스트롬 이내와 단백질의 비교적 정적 인 영역에서 표지 부위를 선택하십시오. 거리는 사용될 특정 FRET 염료 쌍을 결정할 것이다.서로 비교적 구별되는 단백질 영역에서 표지 부위를 찾습니다. 따라서 사이트는 삼각형의 꼭짓점을 설명하며 징벌적 바인딩 사이트는 중앙에 있습니다. 원하는 큐벳 크기와 부피에 따라 R0 값을 측정하려면 전체 단백질의 동일한 농도에서 두 개의 단백질 샘플을 준비하십시오.하나는 공여체 염료로만 표지된 단백질로, 다른 하나는 수용체 염료로만 표지된 단백질이다. 분광계를 사용하는 경우 형광계를 켜고 FluorEssence 소프트웨어에서 스펙트럼 수집 및 분석 프로그램을 엽니다. 빨간색 M을 클릭하여 컴퓨터를 계측기에 연결하고 방출 스펙트럼을 선택합니다.여기 파장, 방출 스캔 범위, 온도 및 샘플 위치 변경과 같은 실험 메뉴 항목을 사용하여 스캔 매개 변수를 입력합니다. RTC를 클릭하고 원고에 설명된 대로 최적화된 기기 설정을 클릭하고, 염료의 흡수 최대치에 설정된 여기 파장을 사용하여 피크에서의 형광 방출을 모니터링합니다. 공여체 표지된 단백질 샘플을 샘플 홀더에 넣고, 클릭 실행을 실행하여 공여체 염료만으로 표지된 단백질의 방출 스캔을 생성하고, 샘플을 염료 흡수 최대치에서 흥분시켜, 방출 피크 위로 주사한다.피크의 끝을 지나서 25 내지 50 나노미터에서 스캔을 연장함으로써 스캔에 대한 기준선을 확립한다. 텍스트 원고에 기재된 바와 같이, 상이한 농도의 샘플에 대한 흡수 및 형광 측정을 수행하여 공여체 단백질만의 양자 수율을 측정한다. 공여체 단백질, 수용체 전용 단백질 및 공여체 수용체 단백질 샘플을 동일한 농도로 준비하십시오.형광 방출 스펙트럼을 생성하기 위해 주사된 공여체만을 얻는다. 용액을 공여체 염료 흡수 최대치에서 여기시키고, 공여체 및 수용체 방출 피크를 통해 스캔한다. 샘플을 수용체 전용 단백질로 교환하거나 샘플을 변경하여 수용체 전용 단백질을 포함하는 큐벳으로 위치를 변경하십시오.수용체 염료만으로 표지된 단백질의 방출 주사를 얻는다. 기증자 여기 파장에서 샘플을 흥분시킨다. 샘플을 공여체-수용체 단백질 샘플로 교환하거나 샘플을 변경하여 공여체-수용체 표지된 단백질을 함유하는 큐벳으로 위치를 변경한다.동일한 설정을 사용하여 공여체-수용체 단백질 샘플의 방출 스캔을 얻는다. 모든 스펙트럼에 대해, 스캔이 끝날 때 측정된 배경 카운트를 빼서 배경 형광을 보정하십시오. PyMOL과 같은 3D 그래픽 보기 프로그램을 사용하여 스크립트의 명령을 적절한 거리 정보와 함께 명령 창에 직접 입력하여 거리를 구조에 매핑합니다.측정된 각 거리 및 관련 오류에 대한 셸을 생성합니다. 다른 쉘의 교차점을 통해 위치를 매핑합니다. 신호 펩티드 결합 부위는 SecA 및 SecYEG 상의 세 개의 상이한 위치, 및 신호 펩티드 상의 네 개의 상이한 위치를 사용하여 맵핑되었다.FRET 실험은 예비단백질의 상이한 영역과 SecA 및 SecYEG 단백질 상의 세 개의 별개의 위치 사이의 예비-단백질 결합 부위 및 배향을 지도화한다. 신호 펩티드의 징벌적 결합 부위는 이전에 두 나선 손가락으로 확인되었고, SecA C 말단 꼬리는 두 나선 손가락에 평행한 배향을 제안했다. SecA37, 및 PhoA2, 및 PhoA22 사이의 정상 상태 FRET 스펙트럼이 얻어졌다.공여체 강도의 감소는 PhoA22로부터 더 큰 에너지가 전달된다는 것을 나타내었다. SecA37에서 더 멀리 떨어진 곳에 위치한 PhoA2 사이트에 상대적입니다. 시간 분해된 형광 붕괴 스펙트럼은 공여체-수용체 복합체가 한 거리와 관련된 에너지 전달과 일치하는 더 짧은 균질 붕괴를 갖는다는 것을 입증하였다.SecA PhoA2 잔기와 삼각측정 부위 사이에 구축된 FRET 거리 쉘은 각 쉘이 녹색으로 표시된 가정된 결합 부위인 2나선 손가락과 교차한다는 것을 입증하였다. 교차된 영역은 각각의 FRET 쉘보다 작고, 나선형 스캐폴드로부터의 큰 기여를 포함한다. PhoA2 잔기와 표지된 부위 사이에서 결정된 FRET 거리 쉘은, SecYEG 채널의 2나선 손가락 및 입의 팁에 더 가깝게 위치하는 더 작은 영역을 기술한다.이 교차 영역은 PhoA2의 2 나선 손가락의 반대쪽 끝에 있습니다. 고려해야 할 중요한 사항에는 관심 영역을 삼각 측량하고, 각 부위에 대한 양자 수율을 측정하고, 모든 자유 염료를 제거하기 위해 표지 부위를 적절하게 선택하는 것이 포함됩니다. 이 방법은 NMR 또는 X선 결정학과 같은 방법으로 얻은 구조 정보와 일치합니다.FRET 결과가 구조적 맥락에 투입되면 기존 정보를 향상시킬 수 있다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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Cryomilled 포유 동물 세포에서 단백질 단지 선호도 캡처

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

연구

생화학

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

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비계 리포좀을 사용하여 근위 지질 단백질 - 단백질 상호 작용을 재구성<em&gt; 체외</em

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The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and ...

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전기 화학 탐지의 중수소 활동적인 동위 원소 효과 Shewanella oneidensis 미스터-1에서 세포 외 전자 전송에

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