Name: f&#246;rster resonance energy transfer mapping: a new methodology to elucidate global structural features
Uploaded: 2022-03-16T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about FÃ¶rster Resonance Energy Transfer Mapping: A New Methodology to Elucidate Global Structural Features at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health stipend R15GM135904 (tildelt IM) og National Institutes of Health Grant GM110552 (tildelt DBO).

1. Valg av merkesteder
<ol><li>Identifiser minst tre potensielle merkingssteder for å triangulere det antatte bindingsstedet på eksisterende proteinstrukturer. I dette tilfellet ble SecA, SecYEG og preprotein festet til SecA gjennom genetisk fusjon identifisert2.<ol>
<li>Velg merkesteder innen 25-75 Å fra det antatte bindingsstedet og i relativt statiske områder av proteinet, vil avstanden bestemme det spesifikke FRET-fargestoffparet som skal brukes36...

Gjennom bruk av FRET-kartleggingsmetodikken identifiserte vi signalsekvensbindingsstedet på SecA-proteinet. Det er viktig at tilstedeværelsen av en 3-D krystallstruktur av komplekset i stor grad lettet vår studie. Styrken til denne kartleggingsmetodikken ligger i evnen til å bruke en eksisterende struktur for å identifisere steder for merking. Denne metoden kan ikke brukes til å bestemme en 3D-struktur; Imidlertid er bestemmelse av strukturelle elementer56, forfining av en eksisterende struk...

For proteiner fører belysning av dynamikk sammen med 3-dimensjonal (3-D) strukturell kunnskap til en forbedret forståelse av struktur-funksjonsforhold i biomolekylære systemer. Strukturelle metoder, som røntgenkrystallografi og kryogen elektronmikroskopi, fanger opp en statisk struktur og krever ofte bestemmelse av flere strukturer for å belyse aspekter ved biomolekylbinding og dynamikk1. Denne artikkelen diskuterer en løsningsbasert metode for å kartlegge globale strukturelle elementer, for eksempel bindingssteder eller bindingsinteraksjoner, som potensielt er mer forbigående og mindre enkle å fange opp med statiske metoder. Sterke kandidatsystemer for denne metoden er de der en 3-D-struktur tidligere har blitt bestemt ved røntgenkrystallografi, NMR-spektroskopi eller andre strukturelle metoder. I dette tilfellet utnytter vi røntgenkrystallstrukturen til SecA-SecYEG-komplekset, en sentral aktør i proteinets generelle sekretoriske vei, for å kartlegge plasseringen av et signalpeptidbindingssted ved hjelp av Förster resonansenergioverføring (FRET) før transport av preproteinet over membranen2. Manipulering av det biologiske systemet gjennom genetiske modifikasjoner kombinert med vår kunnskap om 3-D-strukturen muliggjorde bestemmelse av konformasjonen av signalsekvensen og tidlig moden region umiddelbart før innsetting i kanal 3.
FRET innebærer strålingsfri overføring av energi fra ett molekyl (donor) til et annet (akseptor) på en avstandsavhengig måte som er gjennom rom 4,5. Effektiviteten av denne overføringen overvåkes enten gjennom en reduksjon i donor eller en økning i akseptorfluorescensintensitet. Effektiviteten av energioverføring kan beskrives som
E = R06/(R06 + R6)
der R0-verdien er avstanden der overføringen er 50% effektiv6. Teknikken har tidligere blitt beskrevet som en molekylær linjal og er effektiv til å bestemme avstander i området 2,5-12 nm, avhengig av identiteten til donor-akseptorfargene 4,7,8,9. Donorfluorescensintensiteter og levetider med eller uten akseptor tillater bestemmelse av overføringseffektivitet og følgelig avstander 5,8. På grunn av tilgjengeligheten av teknologien, metodens følsomhet og brukervennlighet har FRET også funnet bred anvendelse på områder som enkeltmolekylfluorescensspektroskopi og konfokalmikroskopi6. Ankomsten av fluorescerende proteiner som grønt fluorescerende protein har gjort observasjonen av intracellulær dynamikk og levende cellebilder relativtlettvint 10,11. Mange FRET-applikasjoner som disse diskuteres i detalj i dette virtuelle problemet.
I denne studien fokuserer vi spesielt på bruk av FRET-målinger for å gi avstandsverdier for å bestemme strukturelle detaljer. Tidligere har FRET-målinger blitt effektivt brukt til å bestemme konformasjonen av DNA-molekyler når de er bundet til protein 12,13,14, den indre dynamikken til proteiner og proteinbindende interaksjoner 15,16,17. Fordelene med denne metoden ligger i evnen til å bestemme fleksible og dynamiske strukturelle elementer i en løsning med relativt lave mengder materiale. Det er viktig å merke seg at denne metoden er spesielt effektiv når den brukes sammen med eksisterende strukturell informasjon og ikke kan brukes som et middel til 3-D strukturbestemmelse. Metoden gir best innsikt og raffinement av struktur hvis arbeidet bygger på eksisterende strukturell informasjon ofte kombinert med beregningssimulering18,19. Her beskrives bruk av avstander oppnådd fra steady-state og tidsoppløste FRET-målinger for å kartlegge et bindingssted, hvis plassering ikke var kjent, på en eksisterende krystallografisk struktur av SecA-SecYEG-komplekset, store proteiner i den generelle sekretoriske banen3.
Den generelle sekretoriske banen, et svært konservert system fra prokaryoter til eukaryoter til archaea, formidler transport av proteiner enten over eller inn i membranen til deres arbeidssted i cellen. For gramnegative bakterier, som E. coli, organismen som ble brukt i vår studie, blir proteiner satt inn i eller translokert over den indre membranen til periplasma. Det bakterielle SecY-kanalkomplekset (kalt transloconet) koordinerer med andre proteiner for å translokere det nylig syntetiserte proteinet, som er rettet mot sin korrekte plassering i cellen gjennom en signalsekvens som vanligvis ligger ved N-terminalen20,21. For proteiner bundet til periplasma assosierer ATPase SecA-proteinet med utgangstunnelen til ribosomet, og med preproteinet etter at ca. 100 rester er oversatt22. Sammen med SecB chaperone-proteinet opprettholder det preproteinet i en utfoldet tilstand. SecA binder seg til SecYEG-transloconet, og gjennom mange sykluser av ATP-hydrolyse letter proteintransport over membranen23,24.
SecA er et multi-domene protein som finnes i cytosoliske og membranbundne former. Et homodimert protein i cytosolen, SecA, består av et preproteinbindende eller tverrbindende domene25, to nukleotidbindende domener, et spiralformet vingedomene, et spiralformet stillasdomene og de to helixfingeren (THF)26,27,28,29 (figur 1). I tidligere krystallografiske studier av SecA-SecYEG-komplekset antydet plasseringen av THF at den var aktivt involvert i proteintranslokasjon og påfølgende tverrbindingseksperimenter med signalpeptidet etablerte videre betydningen av denne regionen i proteintranslokasjon30,31. Tidligere studier, ved hjelp av FRET-kartleggingsmetodikken, viste at eksogene signalpeptider binder seg til denne regionen av SecA 2,32. For fullt ut å forstå konformasjonen og plasseringen av signalsekvensen og den tidlig modne regionen av preproteinet før innsetting i SecYEG-kanalen, ble det opprettet en proteinkimera der signalsekvensen og restene av den tidlige modne regionen ble festet til SecA gjennom en Ser-Gly-linker (figur 1). Ved hjelp av denne biologisk levedyktige konstruksjonen ble det videre demonstrert at signalsekvensen og den tidlig modne regionen av preproteinet binder seg til THF på en parallell måte2. Deretter ble FRET-kartleggingsmetoden brukt til å belyse konformasjonen og plasseringen av signalsekvensen og tidlig moden region i nærvær av SecYEG som beskrevet nedenfor3.
Kunnskap om 3D-strukturen til SecA-SecYEG-komplekset 33,34,35 og den mulige plasseringen av bindingsstedet tillot oss å plassere donor-akseptoretiketter på steder der skjæringspunktet mellom individuelle FRET-avstander identifiserer bindingsstedets plassering. Disse FRET-kartleggingsmålingene viste at signalsekvensen og den tidlige modne regionen av preproteinet danner en hårnål med spissen plassert ved munningen av SecYEG-kanalen, noe som viser at hårnålstrukturen er mal før kanalinnsetting.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>490 nm LED laser</td>
			<td>Horiba</td>
			<td>1684-LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 C2 Maleimide//DIBO Alkyne</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A20347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Difco</td>
			<td>DF0812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 C5 Maleimide/DIBO Alkyne</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A10254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 DIBO Alkyne</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S10904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 DIBO Alkyne</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S10906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra&#173;4 Centrifugal filter (50kDa MWCO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>UFC805008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dodecylmaltoside (DDM)</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli alkaline phosphatase signal peptide SP22</td>
			<td>Biomolecules Midwest</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Synthesized custom item</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>extended signal peptide SP41</td>
			<td>Biomolecules Midwest</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Synthesized custom item</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluorEssence</td>
			<td>Horiba</td>
			<td>version 2.4</td>
			<td>spectral acquisition program for Fluoromax4 spectrofluorometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromax 4 spectrofluorometer</td>
			<td>Horiba</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlobalsWE</td>
			<td>Laboratory for Fluorescence Dynamics, University of California, Irvine</td>
			<td></td>
			<td>spectral analysis program for time-resolved decays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H&#173;4&#173;Azido&#173;Phe&#173;OH</td>
			<td>BACHEM</td>
			<td>4020250.0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB (Miller) Broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9723</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ludox HS-40 colloidal silica (40 wt.% suspension in H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>420816</td>
			<td>dilution is needed to make a proper scattering solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTI Felix GX</td>
			<td>Horiba</td>
			<td>version 4.1.0.4096</td>
			<td>spectral acquisition program for PTI Time Master Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTI Time Master Instrument</td>
			<td>Horiba</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pymol Molecular Graphics Program</td>
			<td>Schrodinger</td>
			<td>version 2.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>NESLAB RTE 10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

f&#246;rster resonance energy transfer mapping: a new methodology to elucidate global structural features

Förster resonance energy transfer (FRET) er en etablert fluorescensbasert metode som brukes til å måle avstander i og mellom biomolekyler in vitro så vel som i celler. I FRET er effektiviteten av energioverføring, målt ved endringer i fluorescensintensitet eller levetid, relatert til avstanden mellom to fluorescerende molekyler eller etiketter. Bestemmelse av dynamikk og konformasjonsendringer fra avstandene er bare noen eksempler på anvendelser av denne metoden til biologiske systemer. Under visse forhold kan denne metoden legge til og forbedre eksisterende røntgenkrystallstrukturer ved å gi informasjon om dynamikk, fleksibilitet og tilpasning til bindingsflater. Vi beskriver bruken av FRET og tilhørende avstandsbestemmelser for å belyse strukturelle egenskaper, gjennom identifisering av bindingssted eller orientering av dimerunderenheter. Gjennom fornuftig valg av merkingssteder, og ofte bruk av flere merkingsstrategier, har vi med hell brukt disse kartleggingsmetodene for å bestemme globale strukturelle egenskaper i et protein-DNA-kompleks og SecA-SecYEG-proteintranslokasjonssystemet. I SecA-SecYEG-systemet har vi brukt FRET-kartleggingsmetoder for å identifisere preproteinbindingsstedet og bestemme den lokale konformasjonen av det bundne signalsekvensområdet. Denne studien skisserer trinnene for å utføre FRET-kartleggingsstudier, inkludert identifisering av passende merkingssteder, diskusjon av mulige etiketter, inkludert ikke-innfødte aminosyrerester, merkingsprosedyrer, hvordan man utfører målinger og tolkning av dataene.

Denne studien fokuserte på å bestemme plasseringen av preproteinbindingsstedet på SecA før innsetting av preproteinet i SecYEG-kanalen. For å kartlegge bindingsstedet ble det utført FRET-eksperimenter mellom forskjellige regioner av preproteinet og tre forskjellige steder på SecA- og SecYEG-proteinene (figur 1A-D). Fra avstandene som er oppnådd og tredimensjonale strukturer av SecA, SecYEG og preproteinet, ble plasseringen av preproteinbindingsstedet...

Watch this Scientific Journal Video about FÃ¶rster Resonance Energy Transfer Mapping: A New Methodology to Elucidate Global Structural Features at JoVE.com

F&#246;rster Resonance Energy Transfer Mapping: A New Methodology to Elucidate Global Structural Features

Studien beskriver metodikken for FRET-kartlegging, inkludert valg av merkingssteder, valg av fargestoffer, innsamling og dataanalyse. Denne metoden er effektiv til å bestemme bindingssteder, konformasjonsendringer og dynamiske bevegelser i proteinsystemer og er mest nyttig hvis den utføres i forbindelse med eksisterende 3-D strukturell informasjon.

Förster Resonance Energy Transfer Mapping: En ny metode for å belyse globale strukturelle egenskaper

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) is an established fluorescence-based method used to successfully measure distances in and between ...

Vi har utviklet en FRET-kartleggingsmetodikk som tillater identifisering og karakterisering av ligandbindingssteder, subenhetsorientering, konformasjonsendringer assosiert med ligandbinding og dynamiske bevegelser av proteiner. En fordel med denne teknikken er at den kan utføres i løsning og molekylene kan bevege seg fritt. Avstandene målt med denne teknikken er passende for biologiske systemer.FRET er bredt anvendelig på mange systemer. Kartlegging forbedrer overvåkingen av strukturelle og dynamiske endringer i ethvert biomolekylært system, og er spesielt effektivt hvis tredimensjonal strukturell informasjon eksisterer. Etter å ha renset proteinet, er den vanskeligste delen merking med høy effektivitet, og fjerning av det frie fargestoffet.For forsøkene hjelper det å ha så lite fritt fargestoff som mulig. For å begynne, velg merkingssteder innen 25 til 75 angstrom av det straffende bindingsstedet, og i relativt statiske områder av proteinet. Avstanden vil bestemme det spesifikke FRET-fargestoffparet som skal brukes.Finn merkingsstedene i proteinregioner som er relativt forskjellige fra hverandre. Så nettstedene beskriver hjørnene i en trekant, med det straffende bindingsstedet plassert i midten. For å måle R0-verdiene, avhengig av ønsket kyvettstørrelse og volum, lag to proteinprøver med samme konsentrasjon av totalt protein.En med protein merket med donor fargestoff bare, og en med protein merket med akseptor fargestoff bare. Slå på fluorometeret og åpne spektralinnsamlings- og analyseprogrammet i FluorEssence-programvaren, hvis du bruker et spektrofluorometer. Klikk på den røde M-en for å koble datamaskinen til instrumentet og velg Emission spectra.Angi skanneparametere ved hjelp av menyelementet Innsamlingseksperiment, for eksempel eksitasjonsbølgelengde, området for utslippsskanning, temperatur og prøveendring av posisjon. Klikk på RTC og optimaliserte instrumentinnstillinger som beskrevet i manuskriptet, ved å overvåke fluorescensutslippet ved toppen ved hjelp av en eksitasjonsbølgelengde satt ved fargestoffets absorpsjonsmaksimum. Plasser donormerket proteinprøve i prøveholderen, og klikk kjør for å generere en utslippsskanning av proteinet merket med donorfargestoffet, ved å spenne prøven ved fargestoffabsorpsjonsmaksimumet og skanne over utslippstoppen.Etabler en grunnlinje for skanningen ved å utvide skanningen med 25 til 50 nanometer forbi slutten av toppen. Mål kvanteutbyttet til donorproteinet ved å utføre absorpsjoner og fluorescensmålinger på prøver med forskjellige konsentrasjoner, som beskrevet i tekstmanuskriptet. Forbered donor bare protein, akseptor bare protein, og donor-akseptor protein prøver, i samme konsentrasjon.Få donor bare skanning for å generere fluorescensutslippsspektra. Begeistre løsningen ved donorfargestoffabsorpsjonen maksimalt, og skann over donor- og akseptorutslippstoppene. Bytt enten prøven til akseptorproteinet, eller endre prøven endre posisjonen din til kyvetten som inneholder akseptorproteinet.Oppnå en utslippsskanning av proteinet merket med akseptorfargen. Begeistre prøven ved donorens eksitasjonsbølgelengde. Bytt prøven til donor-akseptorproteinprøven eller endre prøven endre posisjonen din til kyvetten som inneholder donor-akseptormerket protein.Få en utslippsskanning av donor-akseptorproteinprøven ved å bruke de samme innstillingene. For alle spektra korrigerer du bakgrunnsfluorescens ved å trekke fra bakgrunnstallene som er målt på slutten av skanningen. Bruk et 3D grafisk visningsprogram som PyMOL for å kartlegge avstandene på strukturen, ved å skrive inn kommandoene fra skriptet direkte i kommandovinduet med riktig avstandsinformasjon.Generer et skall for hver målte avstand og den tilknyttede feilen. Kartlegg posisjonen gjennom skjæringspunktet mellom de forskjellige skjellene. Signalpeptidbindingsstedet ble kartlagt ved hjelp av tre forskjellige steder på SecA og SecYEG, og fire forskjellige steder på signalpeptidet.FRET-eksperimenter mellom forskjellige regioner av preproteinet og tre forskjellige steder på SecA- og SecYEG-proteinene kartlegger preproteinbindingsstedet og orienteringen. Det straffende bindingsstedet til signalpeptidet ble tidligere identifisert som to-helixfingeren, og den SecA C-terminale halen foreslo en orientering parallelt med to-helixfingeren. Steady state FRET-spektra mellom SecA37, og PhoA2, og PhoA22, ble oppnådd.Reduksjon i donorintensiteten indikerte at større energi overført fra PhoA22. I forhold til PhoA2-området, som ligger lenger unna SecA37. Tidsoppløst fluorescensnedbrytningsspektra viste at donor-akseptorkomplekset har et kortere homogent forfall forenlig med energioverføring assosiert med en avstand.FRET avstandsskjell konstruert mellom SecA PhoA2-restene og de triangulerte stedene, viste at hvert skall krysser med to-helixfingeren, det antatte bindingsstedet, som er vist i grønt. Det kryssede området er mindre enn hvert FRET-skall og inkluderer et stort bidrag fra det spiralformede stillaset. FRET avstandsskjell bestemt mellom PhoA2-resten og de merkede stedene, beskriver et mindre område som ligger nærmere spissen av to-helixfingeren og munnen av SecYEG-kanalen.Dette kryssede området ligger i motsatt ende av to-helixfingeren fra PhoA2. Viktige ting å vurdere inkluderer riktig valg av merking nettsteder for å triangulere området av interesse, for å måle quantum utbyttet for hvert område, og fjerne alle frie fargestoff. Denne metoden stemmer overens med strukturell informasjon oppnådd med metoder som NMR eller røntgenkrystallografi.Når FRET-resultatene settes inn i en strukturell sammenheng, kan det forbedre eksisterende informasjon.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Protein Complex Affinity Capture fra Cryomilled pattedyrceller

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Bruke Stillas liposomer for å rekonstituere Lipid-proksimale Protein-protein interaksjoner<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Atomic skala strukturelle studier av Macromolecular samlinger av Solid-state kjernefysiske magnetisk resonans spektroskopi

Supramolecular protein assemblies play fundamental roles in biological processes ranging from host-pathogen interaction, viral infection to the ...

Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation

Kvantitativ Immunofluorescence å måle globale lokalisert oversettelse

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and ...

Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1

Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1

Elektrokjemiske gjenkjenning av Deuterium Kinetic isotop effekt på ekstracellulære elektronet Transport Shewanella oneidensis MR-1

Direct electrochemical detection of c-type cytochrome complexes embedded in the bacterial outer membrane (outer membrane c-type cytochrome complexes; OM ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Bruke i Vitro fluorescens resonans energioverføring å studere dynamikken i Protein komplekser på et millisekund tidsskala

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Removal and Replacement of Endogenous Ligands from Lipid-Bound Proteins and Allergens

Fjerning og utskifting av endogene ligander fra Lipidbundne proteiner og allergener

Many major allergens bind to hydrophobic lipid-like molecules, including Mus m 1, Bet v 1, Der p 2, and Fel d 1. These ligands are strongly retained and ...

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis

Enkeltmolekyl fluorescens energioverføringsstudie av ribosomet proteinsyntese

The ribosome is a large ribonucleoprotein complex that assembles proteins processively along mRNA templates. The diameter of the ribosome is approximately ...

F&#246;rster Resonance Energy Transfer Measurements in Living Plant Cells

Förster resonans energioverføringsmålinger i levende planteceller

Sensitized emission-based F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) experiments are easily done but depend on the microscopic setup. Confocal laser ...

Time-resolved F&#246;rster Resonance Energy Transfer Assays for Measurement of Endogenous Phosphorylated STAT Proteins in Human Cells

Tidsavklarte Förster Resonance Energy Transfer Assays for måling av endogene fosforylaterte STAT-proteiner i humane celler

The Janus kinase (JAK)/signal transducer and activator of transcription (STAT) signaling pathway plays a crucial role in mediating cellular responses to ...