Name: f&#246;rster resonance energy transfer mapping: a new methodology to elucidate global structural features
Uploaded: 2022-03-16T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about FÃ¶rster Resonance Energy Transfer Mapping: A New Methodology to Elucidate Global Structural Features at JoVE.com

Эта работа была поддержана грантом Национальных институтов здравоохранения R15GM135904 (присуждается IM) и грантом Национальных институтов здравоохранения GM110552 (присуждается DBO).

1. Подбор сайтов маркировки
<ol><li>Определите по меньшей мере три потенциальных участка маркировки для триангуляции предполагаемого сайта связывания на существующих белковых структурах. В этом случае были идентифицированы SecA, SecYEG и препротеин, присоединенный к SecA посредством ...

Используя методологию картирования FRET, мы идентифицировали сайт связывания сигнальной последовательности на белке SecA. Важно отметить, что наличие 3-D кристаллической структуры комплекса значительно облегчило наше исследование. Сила этой методологии картографирования заключается в с...

Для белков выяснение динамики наряду с 3-мерными (3-D) структурными знаниями приводит к лучшему пониманию структурно-функциональных отношений биомолекулярных систем. Структурные методы, такие как рентгеновская кристаллография и криогенная электронная микроскопия, захватывают статическую структуру и часто требуют определения нескольких структур для выяснения аспектов связывания биомолекул и динамики1. В этой статье обсуждается основанный на решении метод отображения глобальных структурных элементов, таких как сайты связывания или взаимодействия привязки, которые потенциально более преходящи и менее легко захватываются статическими методами. Сильными системами-кандидатами для этой методологии являются те, в которых 3D-структура была ранее определена рентгеновской кристаллографией, ЯМР-спектроскопией или другими структурными методами. В этом случае мы используем рентгеновскую кристаллическую структуру комплекса SecA-SecYEG, центрального игрока в общем секреторном пути белка, для отображения местоположения сайта связывания сигнального пептида с использованием резонансного переноса энергии Фёрстера (FRET) до переноса препротеина через мембрану2. Манипулирование биологической системой с помощью генетических модификаций в сочетании с нашими знаниями о 3D-структуре позволило определить конформацию сигнальной последовательности и ранней зрелой области непосредственно перед введением в канал 3.
FRET включает в себя безрадиационную передачу энергии от одной молекулы (донора) к другой (акцептору) в зависимости от расстояния, то есть через пространство 4,5. Эффективность этого переноса контролируется либо через уменьшение донора, либо через увеличение интенсивности акцепторной флуоресценции. Эффективность передачи энергии можно охарактеризовать как
E = R06/(R06 + R6)
в котором значение R0 — это расстояние, на котором передача эффективна на 50%6. Методика ранее была описана как молекулярная линейка и эффективна при определении расстояний в диапазоне 2,5-12 нм в зависимости от идентичности донор-акцепторных красителей 4,7,8,9. Интенсивность и срок службы донорской флуоресценции с акцептором или без него позволяют определить эффективность переноса и, следовательно, расстояния 5,8. Благодаря доступности технологии, чувствительности метода и простоте использования, FRET также нашел широкое применение в таких областях, как одномолекулярная флуоресцентная спектроскопия и конфокальная микроскопия6. Появление флуоресцентных белков, таких как зеленый флуоресцентный белок, сделало наблюдение за внутриклеточной динамикой и визуализацией живых клеток относительно легким10,11. Многие приложения FRET, подобные этим, подробно обсуждаются в этом виртуальном выпуске.
В этом исследовании мы уделяем особое внимание использованию измерений FRET для получения значений расстояния для определения структурных деталей. Ранее измерения FRET эффективно использовались для определения конформации молекул ДНК при связывании с белком 12,13,14, внутренней динамики белков и белковосвязывающих взаимодействий 15,16,17. Преимущества этого метода заключаются в возможности определения гибких и динамичных конструктивных элементов в растворе с относительно небольшим количеством материала. Примечательно, что этот метод особенно эффективен при использовании в сочетании с существующей структурной информацией и не может быть использован в качестве средства определения 3D-структуры. Метод обеспечивает наилучшее понимание и уточнение структуры, если работа основывается на существующей структурной информации, часто в сочетании с вычислительным моделированием18,19. Здесь описано использование расстояний, полученных из стационарных и разрешенных по времени измерений FRET, для картирования сайта связывания, местоположение которого не было известно, на существующей кристаллографической структуре комплекса SecA-SecYEG основных белков в общем секреторном пути3.
Общий секреторный путь, высококонсервативная система от прокариот до эукариот и архей, опосредует транспорт белков либо через мембрану, либо в мембрану к их функциональному расположению в клетке. Для грамотрицательных бактерий, таких как E. coli, организма, используемого в нашем исследовании, белки вставляются или перемещаются через внутреннюю мембрану в периплазму. Бактериальный комплекс каналов SecY (называемый транслоконом) координируется с другими белками для перемещения вновь синтезированного белка, который направляется к его правильному расположению в клетке через сигнальную последовательность, обычно расположенную на N-конце20,21. Для белков, связанных с периплазмой, белок АТФазы SecA связывается с выходным туннелем рибосомы и с препротеином после того, как приблизительно 100 остатков были переведены22. Наряду с белком шаперона SecB он поддерживает препротеин в развернутом состоянии. SecA связывается с транслоконом SecYEG и через многие циклы гидролиза АТФ облегчает транспорт белка через мембрану23,24.
SecA представляет собой многодоменный белок, который существует в цитозольной и мембраносвязанной формах. Гомодимерный белок в цитозоле, SecA состоит из препротеин-связывающего или сшивающего домена25, двух нуклеотид-связывающих доменов, спирального домена крыла, спирального каркасного домена и двух спиральных пальцев (THF)26,27,28,29 (Рисунок 1). В предыдущих кристаллографических исследованиях комплекса SecA-SecYEG расположение ТГФ предполагало, что он активно участвовал в транслокации белка, а последующие эксперименты по сшиванию с сигнальным пептидом дополнительно установили значение этой области в транслокации белка 30,31. Предыдущие исследования с использованием методологии картирования FRET показали, что экзогенные сигнальные пептиды связываются с этой областью SecA 2,32. Чтобы полностью понять конформацию и местоположение сигнальной последовательности и ранней зрелой области препротеина до вставки в канал SecYEG, была создана белковая химера, в которой сигнальная последовательность и остатки ранней зрелой области были прикреплены к SecA через линкер Ser-Gly (рисунок 1). Используя эту биологически жизнеспособную конструкцию, было дополнительно продемонстрировано, что сигнальная последовательность и ранняя зрелая область препротеина связываются с ТГФ параллельным образом2. Впоследствии методология картирования FRET была использована для выяснения конформации и местоположения последовательности сигналов и ранней зрелой области в присутствии SecYEG, как описано ниже3.
Знание 3-D структуры комплекса SecA-SecYEG 33,34,35 и возможного местоположения места связывания позволило нам разумно разместить донорско-акцепторные этикетки в местах, где пересечение отдельных расстояний FRET определяет местоположение места связывания. Эти измерения картирования FRET показали, что последовательность сигналов и ранняя зрелая область препротеина образуют шпильку с наконечником, расположенным в устье канала SecYEG, демонстрируя, что структура шпильки шаблонизируется до вставки канала.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>490 nm LED laser</td>
			<td>Horiba</td>
			<td>1684-LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 C2 Maleimide//DIBO Alkyne</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A20347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Difco</td>
			<td>DF0812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 C5 Maleimide/DIBO Alkyne</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A10254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 DIBO Alkyne</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S10904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 DIBO Alkyne</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S10906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra&#173;4 Centrifugal filter (50kDa MWCO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>UFC805008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dodecylmaltoside (DDM)</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli alkaline phosphatase signal peptide SP22</td>
			<td>Biomolecules Midwest</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Synthesized custom item</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>extended signal peptide SP41</td>
			<td>Biomolecules Midwest</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Synthesized custom item</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluorEssence</td>
			<td>Horiba</td>
			<td>version 2.4</td>
			<td>spectral acquisition program for Fluoromax4 spectrofluorometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromax 4 spectrofluorometer</td>
			<td>Horiba</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlobalsWE</td>
			<td>Laboratory for Fluorescence Dynamics, University of California, Irvine</td>
			<td></td>
			<td>spectral analysis program for time-resolved decays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H&#173;4&#173;Azido&#173;Phe&#173;OH</td>
			<td>BACHEM</td>
			<td>4020250.0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB (Miller) Broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9723</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ludox HS-40 colloidal silica (40 wt.% suspension in H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>420816</td>
			<td>dilution is needed to make a proper scattering solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTI Felix GX</td>
			<td>Horiba</td>
			<td>version 4.1.0.4096</td>
			<td>spectral acquisition program for PTI Time Master Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTI Time Master Instrument</td>
			<td>Horiba</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pymol Molecular Graphics Program</td>
			<td>Schrodinger</td>
			<td>version 2.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>NESLAB RTE 10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

f&#246;rster resonance energy transfer mapping: a new methodology to elucidate global structural features

Резонансный перенос энергии Фёрстера (FRET) является признанным методом на основе флуоресценции, используемым для успешного измерения расстояний внутри и между биомолекулами in vitro , а также внутри клеток. В FRET эффективность передачи энергии, измеряемая изменениями интенсивности флуоресценции или времени жизни, относится к расстоянию между двумя флуоресцентными молекулами или метками. Определение динамики и конформационных изменений с расстояний является лишь некоторыми примерами применения этого метода к биологическим системам. При определенных условиях эта методология может дополнять и улучшать существующие рентгеновские кристаллические структуры, предоставляя информацию о динамике, гибкости и адаптации к связывающим поверхностям. Мы описываем использование FRET и связанных с ним определений расстояний для выяснения структурных свойств путем идентификации сайта связывания или ориентации субъединиц димера. Благодаря разумному выбору сайтов маркировки и часто использованию нескольких стратегий маркировки, мы успешно применили эти методы картирования для определения глобальных структурных свойств в комплексе белок-ДНК и системе транслокации белка SecA-SecYEG. В системе SecA-SecYEG мы использовали методы картирования FRET для идентификации сайта препротеин-связывания и определения локальной конформации области связанной последовательности сигналов. В этом исследовании описываются этапы выполнения картографических исследований FRET, включая идентификацию соответствующих мест маркировки, обсуждение возможных этикеток, включая ненативные аминокислотные остатки, процедуры маркировки, как выполнять измерения и интерпретацию данных.

Это исследование было сосредоточено на определении местоположения сайта связывания препротеинов на SecA до введения препротеина в канал SecYEG. Чтобы отобразить место связывания, эксперименты FRET проводились между различными областями препротеина и тремя различными местами на белках SecA и...

Watch this Scientific Journal Video about FÃ¶rster Resonance Energy Transfer Mapping: A New Methodology to Elucidate Global Structural Features at JoVE.com

F&#246;rster Resonance Energy Transfer Mapping: A New Methodology to Elucidate Global Structural Features

В исследовании подробно описывается методология картирования FRET, включая выбор мест маркировки, выбор красителей, сбор и анализ данных. Эта методология эффективна при определении сайтов связывания, конформационных изменений и динамических движений в белковых системах и наиболее полезна, если выполняется в сочетании с существующей 3-D структурной информацией.

Картирование резонансного переноса энергии Фёрстера: новая методология для выяснения глобальных структурных особенностей

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) is an established fluorescence-based method used to successfully measure distances in and between ...

Мы разработали методологию картирования FRET, которая позволяет идентифицировать и характеризовать сайты связывания лигандов, ориентацию субъединиц, конформационные изменения, связанные с связыванием лигандов, и динамические движения белков. Преимущество этого метода заключается в том, что он может быть выполнен в растворе, и молекулы могут свободно перемещаться. Расстояния, измеренные с помощью этого метода, подходят для биологических систем.FRET широко применим ко многим системам. Картирование улучшает мониторинг структурных и динамических изменений в любой биомолекулярной системе и особенно эффективно, если существует трехмерная структурная информация. После очистки белка самой сложной частью является маркировка с высокой эффективностью и удаление свободного красителя.Для экспериментов помогает иметь как можно меньше свободного красителя. Для начала выбирайте места маркировки в пределах от 25 до 75 ангстрем от места карательного связывания и в относительно статических областях белка. Расстояние будет определять конкретную пару красителей FRET, которая будет использоваться.Найдите сайты маркировки в белковых областях, которые относительно отличаются друг от друга. Таким образом, сайты описывают вершины треугольника, с карательным местом связывания, расположенным в центре. Для измерения значений R0, в зависимости от желаемого размера и объема кюветы, подготовьте два образца белка в одинаковой концентрации общего белка.Один с белком, помеченным только донорским красителем, и один с белком, помеченным только акцепторным красителем. Включите флуорометр и откройте программу спектрального сбора и анализа в программном обеспечении FluorEssence, если используется спектрофлуорометр. Нажмите на красный M, чтобы подключить компьютер к прибору, и выберите Спектры излучения.Введите параметры сканирования с помощью пункта меню сбора эксперимента, такие как длина волны возбуждения, диапазон сканирования излучения, температура и изменение положения образца. Нажмите на RTC и оптимизированные настройки прибора, как описано в рукописи, путем мониторинга флуоресцентного излучения на пике с использованием длины волны возбуждения, установленной на максимуме поглощения красителя. Поместите помеченный донором образец белка в держатель образца и нажмите кнопку run, чтобы создать сканирование излучения белка, помеченного только донорским красителем, путем возбуждения образца на максимуме поглощения красителя и сканирования на пике излучения.Установите базовый уровень для сканирования, расширив сканирование на 25-50 нанометров после конца пика. Измерьте квантовый выход донорского только белка, выполнив измерения абсорбции и флуоресценции на образцах различных концентраций, как описано в тексте рукописи. Приготовьте образцы только донорского белка, только акцепторного белка и донор-акцепторные образцы белка в той же концентрации.Получите донор только сканирование для генерации спектров флуоресцентного излучения. Возбуждайте раствор на максимуме поглощения донорского красителя и сканируйте пики выбросов донора и акцептора. Либо замените образец на белок только акцептор, либо измените образец на кювету, содержащую только акцепторный белок.Получите эмиссионное сканирование белка, помеченного только акцепторным красителем. Возбуждайте образец на длине волны возбуждения донора. Замените образец на образец донорско-акцепторного белка или измените образец, измените свое положение на кювету, содержащую донор-акцептор, меченый белком.Получите эмиссионное сканирование образца донорно-акцепторного белка с использованием тех же настроек. Для всех спектров исправьте фоновую флуоресценцию, вычитая количество фона, измеренное в конце сканирования. Используйте 3D-графическую программу просмотра, такую как PyMOL, чтобы сопоставить расстояния со структурой, непосредственно вводя команды из скрипта в командное окно с соответствующей информацией о расстоянии.Создайте оболочку для каждого измеренного расстояния и связанной с ним ошибки. Нанесите положение на карту через пересечение различных оболочек. Сайт связывания сигнального пептида был нанесен на карту с использованием трех различных мест на SecA и SecYEG и четырех различных мест на сигнальном пептиде.Эксперименты FRET между различными областями пре-белка и тремя различными местами на белках SecA и SecYEG отображают участок и ориентацию предварительного связывания с белками. Место карательного связывания сигнального пептида ранее было идентифицировано как палец с двумя спирали, а хвост SecA C-терминал предполагал ориентацию, параллельную пальцу с двумя спиралями. Получены спектры устойчивого состояния FRET между SecA37 и PhoA2 и PhoA22.Снижение донорской интенсивности указывает на то, что больше энергии передается от PhoA22. Относительно сайта PhoA2, который расположен дальше от SecA37. Спектры флуоресцентного распада с временным разрешением показали, что донор-акцепторный комплекс имеет более короткий однородный распад, согласующийся с передачей энергии, связанной с одним расстоянием.Дистанционные оболочки FRET, построенные между остатком SecA PhoA2 и триангулированными участками, продемонстрировали, что каждая оболочка пересекается с пальцем с двумя спирали, предполагаемым местом связывания, которое показано зеленым цветом. Пересеченная площадь меньше, чем каждая оболочка FRET, и включает в себя большой вклад от спирального каркаса. Расстояние между оболочками FRET, определяемое между остатком PhoA2 и мечеными участками, описывает меньшую площадь, расположенную ближе к кончику двухспирального пальца и устью канала SecYEG.Эта пересекающаяся область расположена на противоположном конце пальца с двумя спирали от PhoA2. Важные вещи, которые следует учитывать, включают правильный выбор сайтов маркировки для триангуляции интересующей области, для измерения квантовых выходов для каждого участка и удаления всего свободного красителя. Этот метод согласуется со структурной информацией, полученной с помощью таких методов, как ЯМР или рентгеновская кристаллография.Когда результаты FRET помещаются в структурный контекст, это может улучшить существующую информацию.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Белковый комплекс Affinity Capture от Cryomilled клеток млекопитающих

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Используя строительные леса, липосом Развести липидами проксимальный белок-белковых взаимодействий<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Структурные исследования атомной шкале макромолекулярных сборок, твердотельного ЯМР спектроскопии

Supramolecular protein assemblies play fundamental roles in biological processes ranging from host-pathogen interaction, viral infection to the ...

Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation

Количественные иммунофлюоресценции для измерения глобального локализованный перевод

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and ...

Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1

Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1

Электрохимические обнаружения от дейтерия кинетическая изотопный эффект на внеклеточные переноса электронов в Shewanella oneidensis MR-1

Direct electrochemical detection of c-type cytochrome complexes embedded in the bacterial outer membrane (outer membrane c-type cytochrome complexes; OM ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Использование в Vitro флуоресценции резонанс передачи энергии для изучения динамики белковых комплексов в масштабе времени миллисекунду

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Removal and Replacement of Endogenous Ligands from Lipid-Bound Proteins and Allergens

Удаление и замена эндогенных лигандов из липид-связанных белков и аллергенов

Many major allergens bind to hydrophobic lipid-like molecules, including Mus m 1, Bet v 1, Der p 2, and Fel d 1. These ligands are strongly retained and ...

NMR-Based Fragment Screening in a Minimum Sample but Maximum Automation Mode

Скрининг фрагментов на основе ЯМР в режиме минимальной выборки, но максимальной автоматизации

Fragment-based screening (FBS) is a well-validated and accepted concept within the drug discovery process both in academia and industry. The greatest ...

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis

Исследование переноса энергии флуоресценции одной молекулы синтеза белка рибосомы

The ribosome is a large ribonucleoprotein complex that assembles proteins processively along mRNA templates. The diameter of the ribosome is approximately ...

F&#246;rster Resonance Energy Transfer Measurements in Living Plant Cells

Измерения резонансного переноса энергии Фёрстера в живых растительных клетках

Sensitized emission-based F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) experiments are easily done but depend on the microscopic setup. Confocal laser ...