Name: f&#246;rster resonance energy transfer mapping: a new methodology to elucidate global structural features
Uploaded: 2022-03-16T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about FÃ¶rster Resonance Energy Transfer Mapping: A New Methodology to Elucidate Global Structural Features at JoVE.com

Detta arbete stöddes av National Institutes of Health-bidrag R15GM135904 (tilldelat IM) och National Institutes of Health Grant GM110552 (tilldelat DBO).

1. Val av märkningswebbplatser
<ol><li>Identifiera minst tre potentiella märkningsställen för att triangulera det förmodade bindningsstället på de befintliga proteinstrukturerna. I detta fall identifierades SecA, SecYEG och preprotein bundet till SecA genom genetisk fusion2.<ol>
<li>Välj märkningsställen inom 25-75 Å från det förmodade bindningsstället och i relativt statiska områden av proteinet bestämmer avståndet det specifika FRET-färgparet som ska använda...

Genom att använda FRET-kartläggningsmetoden identifierade vi signalsekvensbindningsstället på SecA-proteinet. Det är viktigt att närvaron av en 3D-kristallstruktur av komplexet underlättade vår studie. Styrkan i denna kartläggningsmetodik ligger i förmågan att använda en befintlig struktur för att identifiera platser för märkning. Denna metod kan inte användas för att bestämma en 3D-struktur; Bestämning av strukturella element56, förfining av en befintlig struktur<sup class="xr...

För proteiner leder belysning av dynamik tillsammans med 3-dimensionell (3-D) strukturell kunskap till en ökad förståelse för struktur-funktionssamband mellan biomolekylära system. Strukturella metoder, såsom röntgenkristallografi och kryogen elektronmikroskopi, fångar en statisk struktur och kräver ofta bestämning av flera strukturer för att belysa aspekter av biomolekylbindning och dynamik1. I den här artikeln beskrivs en lösningsbaserad metod för att mappa globala strukturella element, till exempel bindningsställen eller bindningsinteraktioner, som potentiellt är mer tillfälliga och mindre enkla att fångas upp med statiska metoder. Starka kandidatsystem för denna metodik är sådana där en 3D-struktur tidigare har bestämts genom röntgenkristallografi, NMR-spektroskopi eller andra strukturella metoder. I det här fallet utnyttjar vi röntgenkristallstrukturen i SecA-SecYEG-komplexet, en central aktör i proteinets allmänna sekretoriska väg, för att kartlägga placeringen av ett signalpeptidbindningsställe med hjälp av Förster-resonansenergiöverföring (FRET) före transporten av preproteinet över membranet2. Manipulation av det biologiska systemet genom genetiska modifieringar i kombination med vår kunskap om 3D-strukturen möjliggjorde bestämning av konformationen av signalsekvensen och den tidiga mogna regionen omedelbart före införande i kanal 3.
FRET innebär strålningsfri överföring av energi från en molekyl (givare) till en annan (acceptor) på ett avståndsberoende sätt som är genom rymden 4,5. Effektiviteten av denna överföring övervakas antingen genom en minskning av givaren eller en ökning av acceptorns fluorescensintensitet. Energiöverföringens effektivitet kan beskrivas som
E = R06/(R06 + R6)
där R0-värdet är det avstånd på vilket överföringen är 50% effektiv6. Tekniken har tidigare beskrivits som en molekylär linjal och är effektiv för att bestämma avstånd i intervallet 2,5-12 nm, beroende på identiteten hos donator-acceptorfärgerna 4,7,8,9. Givarens fluorescensintensiteter och livslängder med eller utan acceptor gör det möjligt att bestämma överföringseffektivitet och följaktligen avstånd 5,8. På grund av teknikens tillgänglighet, metodens känslighet och användarvänlighet har FRET också funnit bred tillämpning inom områden som enmolekylär fluorescensspektroskopi och konfokalmikroskopi6. Tillkomsten av fluorescerande proteiner såsom grönt fluorescerande protein har gjort observationen av intracellulär dynamik och levande cellavbildning relativt lätt10,11. Många FRET-applikationer som dessa diskuteras i detalj i det här virtuella problemet.
I denna studie fokuserar vi särskilt på användningen av FRET-mätningar för att ge avståndsvärden för att bestämma strukturella detaljer. Tidigare har FRET-mätningar effektivt använts för att bestämma konformationen av DNA-molekyler när de är bundna till protein 12,13,14, proteinernas inre dynamik och proteinbindningsinteraktioner 15,16,17. Fördelarna med denna metod ligger i förmågan att bestämma flexibla och dynamiska strukturella element i en lösning med relativt låga mängder material. Signifikant är denna metod särskilt effektiv när den används tillsammans med befintlig strukturell information och kan inte användas som ett medel för 3D-strukturbestämning. Metoden ger den bästa insikten och förfining av struktur om arbetet bygger på befintlig strukturell information ofta i kombination med beräkningssimulering18,19. Här beskrivs användningen av avstånd erhållna från steady-state och tidsupplösta FRET-mätningar för att kartlägga ett bindningsställe, vars placering inte var känd, på en befintlig kristallografisk struktur av SecA-SecYEG-komplexet, stora proteiner i den allmänna sekretoriska vägen3.
Den allmänna sekretoriska vägen, ett mycket bevarat system från prokaryoter till eukaryoter till arkéer, förmedlar transporten av proteiner antingen över eller in i membranet till deras funktionella plats i cellen. För gramnegativa bakterier, såsom E. coli, organismen som används i vår studie, sätts proteiner in i eller translokeras över det inre membranet till periplasman. Det bakteriella SecY-kanalkomplexet (kallat translocon) koordinerar med andra proteiner för att translokera det nyligen syntetiserade proteinet, vilket riktas till dess korrekta plats i cellen genom en signalsekvens som vanligtvis ligger vid N-terminalen20,21. För proteiner bundna till periplasman associerar ATPase SecA-proteinet med ribosomens utgångstunnel och med preproteinet efter att cirka 100 rester har översatts22. Tillsammans med SecB-chaperonproteinet upprätthåller det preproteinet i ett utfällt tillstånd. SecA binder till SecYEG-translokonet, och genom många cykler av ATP-hydrolys underlättar proteintransporten över membranet 23,24.
SecA är ett multidomänprotein som finns i cytosoliska och membranbundna former. Ett homodimeriskt protein i cytosolen, SecA består av en preproteinbindning eller tvärbindningsdomän25, två nukleotidbindande domäner, en spiralformad vingdomän, en spiralformad ställningsdomän och de två helixfingerna (THF) 26,27,28,29 (figur 1). I tidigare kristallografiska studier av SecA-SecYEG-komplexet föreslog placeringen av THF att den var aktivt involverad i proteintranslokation och efterföljande tvärbindningsexperiment med signalpeptid fastställde ytterligare betydelsen av denna region vid proteintranslokation 30,31. Tidigare studier, med hjälp av FRET-kartläggningsmetoden, visade att exogena signalpeptider binder till denna region av SecA 2,32. För att fullt ut förstå konformationen och placeringen av signalsekvensen och den tidiga mogna regionen av preproteinet före införande i SecYEG-kanalen skapades en proteinchimär där signalsekvensen och resterna av den tidiga mogna regionen fästes till SecA genom en Ser-Gly-länkare (Figur 1). Med hjälp av denna biologiskt livskraftiga konstruktion visades det vidare att signalsekvensen och den tidiga mogna regionen av preproteinet binder till THF på ett parallellt sätt2. Därefter användes FRET-kartläggningsmetoden för att belysa konformationen och placeringen av signalsekvensen och den tidiga mogna regionen i närvaro av SecYEG enligt beskrivningen nedan3.
Kunskap om 3D-strukturen i SecA-SecYEG-komplexet33,34,35 och den möjliga platsen för bindningsstället gjorde det möjligt för oss att på ett klokt sätt placera givaracceptoretiketter på platser där skärningspunkten mellan enskilda FRET-avstånd identifierar bindningsställets plats. Dessa FRET-kartläggningsmätningar avslöjade att signalsekvensen och den tidiga mogna regionen av preproteinet bildar en hårnål med spetsen belägen vid mynningen av SecYEG-kanalen, vilket visar att hårnålsstrukturen är mallad före kanalinsättning.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>490 nm LED laser</td>
			<td>Horiba</td>
			<td>1684-LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 C2 Maleimide//DIBO Alkyne</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A20347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Difco</td>
			<td>DF0812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 C5 Maleimide/DIBO Alkyne</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A10254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 DIBO Alkyne</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S10904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 DIBO Alkyne</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S10906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra&#173;4 Centrifugal filter (50kDa MWCO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>UFC805008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dodecylmaltoside (DDM)</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli alkaline phosphatase signal peptide SP22</td>
			<td>Biomolecules Midwest</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Synthesized custom item</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>extended signal peptide SP41</td>
			<td>Biomolecules Midwest</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Synthesized custom item</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluorEssence</td>
			<td>Horiba</td>
			<td>version 2.4</td>
			<td>spectral acquisition program for Fluoromax4 spectrofluorometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromax 4 spectrofluorometer</td>
			<td>Horiba</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlobalsWE</td>
			<td>Laboratory for Fluorescence Dynamics, University of California, Irvine</td>
			<td></td>
			<td>spectral analysis program for time-resolved decays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H&#173;4&#173;Azido&#173;Phe&#173;OH</td>
			<td>BACHEM</td>
			<td>4020250.0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB (Miller) Broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9723</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ludox HS-40 colloidal silica (40 wt.% suspension in H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>420816</td>
			<td>dilution is needed to make a proper scattering solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTI Felix GX</td>
			<td>Horiba</td>
			<td>version 4.1.0.4096</td>
			<td>spectral acquisition program for PTI Time Master Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTI Time Master Instrument</td>
			<td>Horiba</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pymol Molecular Graphics Program</td>
			<td>Schrodinger</td>
			<td>version 2.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>NESLAB RTE 10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

f&#246;rster resonance energy transfer mapping: a new methodology to elucidate global structural features

Försterresonansenergiöverföring (FRET) är en etablerad fluorescensbaserad metod som används för att framgångsrikt mäta avstånd i och mellan biomolekyler in vitro såväl som inom celler. I FRET relaterar effektiviteten av energiöverföring, mätt genom förändringar i fluorescensintensitet eller livslängd, till avståndet mellan två fluorescerande molekyler eller etiketter. Bestämning av dynamik och konformationsförändringar från avstånden är bara några exempel på tillämpningar av denna metod på biologiska system. Under vissa förhållanden kan denna metod lägga till och förbättra befintliga röntgenkristallstrukturer genom att ge information om dynamik, flexibilitet och anpassning till bindningsytor. Vi beskriver användningen av FRET och tillhörande avståndsbestämningar för att belysa strukturella egenskaper, genom identifiering av ett bindningsställe eller orienteringar av dimerunderenheter. Genom omdömesgilla val av märkningsplatser, och ofta användning av flera märkningsstrategier, har vi framgångsrikt tillämpat dessa kartläggningsmetoder för att bestämma globala strukturella egenskaper i ett protein-DNA-komplex och SecA-SecYEG-proteintranslokationssystemet. I SecA-SecYEG-systemet har vi använt FRET-kartläggningsmetoder för att identifiera preproteinbindningsstället och bestämma den lokala konformationen av den bundna signalsekvensregionen. Denna studie beskriver stegen för att utföra FRET-kartläggningsstudier, inklusive identifiering av lämpliga märkningsställen, diskussion om möjliga etiketter inklusive icke-inhemska aminosyrarester, märkningsprocedurer, hur man utför mätningar och tolkning av data.

Denna studie fokuserade på att bestämma placeringen av preproteinbindningsstället på SecA före införande av preproteinet i SecYEG-kanalen. För att kartlägga bindningsstället utfördes FRET-experiment mellan olika regioner av preproteinet och tre distinkta platser på SecA- och SecYEG-proteinerna (figur 1A-D). Från de erhållna avstånden och tredimensionella strukturerna av SecA, SecYEG och preproteinet förutspåddes placeringen av preproteinbindn...

Watch this Scientific Journal Video about FÃ¶rster Resonance Energy Transfer Mapping: A New Methodology to Elucidate Global Structural Features at JoVE.com

F&#246;rster Resonance Energy Transfer Mapping: A New Methodology to Elucidate Global Structural Features

Studien beskriver metodiken för FRET-kartläggning inklusive val av märkningsställen, val av färgämnen, förvärv och dataanalys. Denna metod är effektiv för att bestämma bindningsställen, konformationsförändringar och dynamiska rörelser i proteinsystem och är mest användbar om den utförs tillsammans med befintlig 3D-strukturell information.

Kartläggning av Resonansenergiöverföring: En ny metod för att belysa globala strukturella egenskaper

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) is an established fluorescence-based method used to successfully measure distances in and between ...

Vi har utvecklat en FRET-kartläggningsmetodik som möjliggör identifiering och karakterisering av ligandbindningsställen, subenhetsorientering, konformationsförändringar associerade med ligandbindning och dynamiska rörelser av proteiner. En fördel med denna teknik är att den kan utföras i lösning och molekylerna kan röra sig fritt. Avstånden som mäts med denna teknik är lämpliga för biologiska system.FRET är i stort sett tillämpligt på många system. Kartläggning förbättrar övervakningen av strukturella och dynamiska förändringar i alla biomolekylära system och är särskilt effektiv om tredimensionell strukturell information finns. Efter rening av proteinet är den svåraste delen märkning med hög effektivitet och avlägsnande av det fria färgämnet.För experimenten hjälper det att ha så lite fritt färgämne som möjligt. För att börja, välj märkningsställen inom 25 till 75 ångström från straffbindningsstället och i relativt statiska regioner av proteinet. Avståndet bestämmer det specifika FRET-färgparet som ska användas.Leta reda på märkningsställena i proteinregioner som skiljer sig relativt från varandra. Så platserna beskriver hörnen av en triangel, med den straffande bindningsplatsen i mitten. För att mäta R0-värdena, beroende på önskad kyvettstorlek och volym, förbered två proteinprover vid samma koncentration av totalt protein.En med proteinet märkt med endast donatorfärgämnet och en med proteinet märkt med endast acceptorfärgämnet. Slå på fluorometern och öppna spektralförvärvs- och analysprogrammet i FluorEssence-programvaran, om du använder en spektrofluorometer. Klicka på det röda M för att ansluta datorn till instrumentet och välj Emissionsspektra.Ange skanningsparametrar med menyalternativet samla in experiment, till exempel excitationsvåglängd, intervallet för emissionsskanning, temperatur och prov ändra din position. Klicka på RTC och optimerade instrumentinställningar som beskrivs i manuskriptet genom att övervaka fluorescensemissionen vid toppen med hjälp av en excitationsvåglängd inställd på färgämnets absorptionsmaximum. Placera det donatormärkta proteinprovet i provhållaren och klicka på kör för att generera en emissionsskanning av proteinet märkt med endast donatorfärgämnet, genom att spänna provet vid färgabsorptionsmaximum och skanna över utsläppstoppen.Upprätta en baslinje för skanningen genom att förlänga skanningen vid 25 till 50 nanometer förbi slutet av toppen. Mät kvantutbytet av endast donatorproteinet genom att utföra absorptioner och fluorescensmätningar på prover med olika koncentrationer, som beskrivs i textmanuskriptet. Förbered endast givarprotein, endast acceptorprotein och givaracceptorproteinprover, i samma koncentration.Få endast givaren att skanna för att generera fluorescensemissionsspektra. Excitera lösningen vid donatorfärgabsorptionsabsorptionsmaximum och skanna över givarens och acceptorns utsläppstoppar. Byt antingen ut provet till acceptorproteinet, eller ändra provet ändra din position till kyvetten som endast innehåller acceptorproteinet.Få en emissionsskanning av proteinet märkt med endast acceptorfärgämnet. Excitera provet vid donatorns excitationsvåglängd. Byt ut provet till givaracceptorproteinprovet eller ändra provet ändra din position till kyvetten som innehåller donatoracceptormärkt protein.Få en emissionsskanning av givaracceptorproteinprovet med samma inställningar. För alla spektra, korrigera bakgrundsfluorescens genom att subtrahera bakgrundsantalet som uppmätts i slutet av skanningen. Använd ett grafiskt 3D-visningsprogram som PyMOL för att mappa avstånden till strukturen genom att direkt ange kommandona från skriptet i kommandofönstret med lämplig avståndsinformation.Generera ett skal för varje uppmätt avstånd och tillhörande fel. Kartlägg positionen genom skärningspunkten mellan de olika skalen. Signalpeptidbindningsstället kartlades med hjälp av tre olika platser på SecA och SecYEG, och fyra olika platser på signalpeptid.FRET-experiment mellan olika regioner av preproteinet och tre distinkta platser på SecA- och SecYEG-proteinerna kartlägger pre-proteinbindningsstället och orienteringen. Signalpeptidens straffbindningsställe identifierades tidigare som tvåhelixfingeret, och SecA C-terminal svans föreslog en orientering parallellt med tvåhelixfingret. Steady state FRET-spektra mellan SecA37 och PhoA2 och PhoA22 erhölls.Minskning av givarintensiteten indikerade att större energi överfördes från PhoA22. I förhållande till PhoA2-webbplatsen, som ligger längre bort från SecA37. Tidsupplösta fluorescensförfallsspektra visade att givar-acceptorkomplexet har ett kortare homogent sönderfall som överensstämmer med energiöverföring associerad med ett avstånd.FRET-avståndsskal konstruerade mellan SecA PhoA2-återstoden och de triangulerade platserna visade att varje skal skär med tvåhelixfingret, det antagna bindningsstället, som visas i grönt. Det korsade området är mindre än varje FRET-skal och innehåller ett stort bidrag från den spiralformade ställningen. FRET-avståndsskal som bestäms mellan PhoA2-återstoden och de märkta platserna, beskriver ett mindre område som ligger närmare spetsen på tvåhelixfingeret och secYEG-kanalens mynning.Detta korsade område ligger i motsatt ände av tvåhelixfingret från PhoA2. Viktiga saker att tänka på inkluderar korrekt val av märkningsplatser för att triangulera intresseområdet, för att mäta kvantutbytet för varje plats och ta bort allt fritt färgämne. Denna metod överensstämmer med strukturell information erhållen med metoder som NMR eller röntgenkristallografi.När FRET-resultaten sätts in i ett strukturellt sammanhang kan det förbättra den befintliga informationen.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Proteinkomplex Affinity Capture från Cryomilled däggdjursceller

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Använda Scaffold Liposomer att återskapa Lipid-proximala protein-proteininteraktioner<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Atomär skala strukturella studier av makromolekylära sammansättningar av Solid-state kärnmagnetisk resonans-spektroskopi

Supramolecular protein assemblies play fundamental roles in biological processes ranging from host-pathogen interaction, viral infection to the ...

Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation

Kvantitativa immunofluorescens åtgärd globala lokaliserad Översättning

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and ...

Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1

Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1

Elektrokemisk detektion av Deuterium Kinetic isotopen effekt på extracellulära elektrontransport i Shewanella oneidensis MR-1

Direct electrochemical detection of c-type cytochrome complexes embedded in the bacterial outer membrane (outer membrane c-type cytochrome complexes; OM ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Använda i Vitro fluorescens resonans energiöverföring att studera dynamiken i proteinkomplex på en millisekund tidsskala

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Removal and Replacement of Endogenous Ligands from Lipid-Bound Proteins and Allergens

Avlägsnande och ersättning av endogena ligander från lipidbundna proteiner och allergener

Many major allergens bind to hydrophobic lipid-like molecules, including Mus m 1, Bet v 1, Der p 2, and Fel d 1. These ligands are strongly retained and ...

NMR-Based Fragment Screening in a Minimum Sample but Maximum Automation Mode

NMR-baserad fragmentscreening i ett minimalt prov men maximalt automatiseringsläge

Fragment-based screening (FBS) is a well-validated and accepted concept within the drug discovery process both in academia and industry. The greatest ...

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis

Enmolekyl fluorescens energiöverföringsstudie av ribosomproteinsyntes

The ribosome is a large ribonucleoprotein complex that assembles proteins processively along mRNA templates. The diameter of the ribosome is approximately ...

F&#246;rster Resonance Energy Transfer Measurements in Living Plant Cells

Förster Resonance Energy Transfer Mätningar i levande växtceller

Sensitized emission-based F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) experiments are easily done but depend on the microscopic setup. Confocal laser ...