Name: full-circle cauterization of limbal vascular plexus for surgically induced glaucoma in rodents
Uploaded: 2022-02-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Full-Circle Cauterization of Limbal Vascular Plexus for Surgically Induced Glaucoma in Rodents at JoVE.com

Wir danken unseren Labortechnikern José; Nilson dos Santos, Daianne Mandarino Torres, José Francisco Tibúrcio, Gildo Brito de Souza und Luciano Cavalcante Ferreira. Diese Forschung wurde von FAPERJ, CNPq und CAPES finanziert.

Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit der Erklärung für die Verwendung von Tieren in der Augen- und Sehforschung der Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) durchgeführt und von der Ethikkommission für die Verwendung von Tieren in wissenschaftlichen Experimenten des Zentrums für Gesundheitswissenschaften der Bundesuniversität Rio de Janeiro genehmigt (Protokoll 083/17). In der vorliegenden Arbeit wurden Lister Hooded Ratten beiderlei Geschlechts im Alter von 2-3 Monaten und mit einem Gew...

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	<li>Weinreb, R. N., Aung, T., Medeiros, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Pathophysiology+and+Treatment+of+Glaucoma+A+Review.">The Pathophysiology and Treatment of Glaucoma A Review.</a> JAMA. 311 (8), 1901-1911 (2014).</li><li>Tham, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+prevalence+of+glaucoma+and+projections+of+glaucoma+burden+through+2040:+A+systematic+review+and+meta-analysis.">Global prevalence of glaucoma and projections of glaucoma burden through 2040: A systematic review and meta-analysis.</a> Ophthalmology. 121 (11), 2081-2090 (2014).</li><li>Quaranta, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quality+of+Life+in+Glaucoma:+A+Review+of+the+Literature.">Quality of Life in Glaucoma: A Review of the Literature.</a> Advances in Therapy. 33 (6), 959-981 (2016).</li><li>Heijl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+intraocular+pressure+and+glaucoma+progression:+results+from+the+Early+Manifest+Glaucoma+Trial.">Reduction of intraocular pressure and glaucoma progression: results from the Early Manifest Glaucoma Trial.</a> Archives of Ophthalmology. 120 (10), 1268-1279 (2002).</li><li>Susanna, R., De Moraes, C. G., Cioffi, G. A., Ritch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+Do+People+(Still)+Go+Blind+from+Glaucoma.">Why Do People (Still) Go Blind from Glaucoma.</a> Translational Vision Science &amp; Technology. 4 (2), 1 (2015).</li><li>Fujikawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VAV2+and+VAV3+as+candidate+disease+genes+for+spontaneous+glaucoma+in+mice+and+humans.">VAV2 and VAV3 as candidate disease genes for spontaneous glaucoma in mice and humans.</a> PLoS One. 5 (2), 9050 (2010).</li><li>Mao, M., Hedberg-Buenz, A., Koehn, D., John, S. W., Anderson, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anterior+segment+dysgenesis+and+early-onset+glaucoma+in+nee+mice+with+mutation+of+Sh3pxd2b.">Anterior segment dysgenesis and early-onset glaucoma in nee mice with mutation of Sh3pxd2b.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 52 (5), 2679-2688 (2011).</li><li>John, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+iris+atrophy,+pigment+dispersion,+and+glaucoma+in+DBA/2J+mice.">Essential iris atrophy, pigment dispersion, and glaucoma in DBA/2J mice.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 39 (6), 951-962 (1998).</li><li>Aihara, M., Lindsey, J. D., Weinreb, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+hypertension+in+mice+with+a+targeted+type+I+collagen+mutation.">Ocular hypertension in mice with a targeted type I collagen mutation.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 44 (4), 1581-1585 (2003).</li><li>Chou, T. H., Tomarev, S., Porciatti, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mice+expressing+mutated+Tyr437His+human+myocilin+develop+progressive+loss+of+retinal+ganglion+cell+electrical+responsiveness+and+axonopathy+with+normal+iop.">Transgenic mice expressing mutated Tyr437His human myocilin develop progressive loss of retinal ganglion cell electrical responsiveness and axonopathy with normal iop.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 55 (9), 5602-5609 (2014).</li><li>vander Zypen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+morphological+study+on+structure+and+function+of+the+filtration+angel+of+the+rat+eye.">Experimental morphological study on structure and function of the filtration angel of the rat eye.</a> Ophthalmologica. 174 (5), 285-298 (1977).</li><li>Aihara, M., Lindsey, J. D., Weinreb, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aqueous+humor+dynamics+in+mice.">Aqueous humor dynamics in mice.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 44 (12), 5168-5173 (2003).</li><li>Morrison, J. C., Fraunfelder, F. W., Milne, S. T., Moore, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limbal+microvasculature+of+the+rat+eye.">Limbal microvasculature of the rat eye.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 36 (3), 751-756 (1995).</li><li>Morrison, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rat+model+of+chronic+pressure-induced+optic+nerve+damage.">A rat model of chronic pressure-induced optic nerve damage.</a> Experimental Eye Research. 64 (1), 85-96 (1997).</li><li>Sappington, R. M., Carlson, B. J., Crish, S. D., Calkins, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microbead+occlusion+model:+A+paradigm+for+induced+ocular+hypertension+in+rats+and+mice.">The microbead occlusion model: A paradigm for induced ocular hypertension in rats and mice.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 51 (1), 207-216 (2010).</li><li>Zhu, M. D., Cai, F. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+experimental+chronic+intraocular+hypertension+in+the+rabbit.">Development of experimental chronic intraocular hypertension in the rabbit.</a> Australian and New Zealand Journal of Ophthalmology. 20 (3), 225-234 (1992).</li><li>Shareef, S. R., Garcia-Valenzuela, E., Salierno, A., Walsh, J., Sharma, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+ocular+hypertension+following+episcleral+venous+occlusion+in+rats.">Chronic ocular hypertension following episcleral venous occlusion in rats.</a> Experimental Eye Research. 61 (3), 379-382 (1995).</li><li>Levkovitch-Verbin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translimbal+laser+photocoagulation+to+the+trabecular+meshwork+as+a+model+of+glaucoma+in+rats.">Translimbal laser photocoagulation to the trabecular meshwork as a model of glaucoma in rats.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 43 (2), 402-410 (2002).</li><li>Zhao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+Circumlimbal+Suture+Model+of+Chronic+IOP+Elevation+in+Mice+and+Assessment+of+Changes+in+Gene+Expression+of+Stretch+Sensitive+Channels.">Characterization of the Circumlimbal Suture Model of Chronic IOP Elevation in Mice and Assessment of Changes in Gene Expression of Stretch Sensitive Channels.</a> Frontiers in Neuroscience. 11, (2017).</li><li>Biswas, S., Wan, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+rodent+hypertensive+glaucoma+models.">Review of rodent hypertensive glaucoma models.</a> Acta Ophthalmologica. 97 (3), 331-340 (2019).</li><li>Pitha, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+Dorzolamide+Release+Prevents+Axonal+and+Retinal+Ganglion+Cell+Loss+in+a+Rat+Model+of+IOP-Glaucoma.">Sustained Dorzolamide Release Prevents Axonal and Retinal Ganglion Cell Loss in a Rat Model of IOP-Glaucoma.</a> Translational Vision Science &amp; Technology. 7 (2), 13 (2018).</li><li>Grozdanic, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporary+elevation+of+the+intraocular+pressure+by+cauterization+of+vortex+and+episcleral+veins+in+rats+causes+functional+deficits+in+the+retina+and+optic+nerve.">Temporary elevation of the intraocular pressure by cauterization of vortex and episcleral veins in rats causes functional deficits in the retina and optic nerve.</a> Experimental Eye Research. 77 (1), 27-33 (2003).</li><li>Lani, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+subacute+model+of+glaucoma+based+on+limbal+plexus+cautery+in+pigmented+rats.">A subacute model of glaucoma based on limbal plexus cautery in pigmented rats.</a> Scientific Reports. 9 (1), 16286 (2019).</li><li>vander Merwe, E. L., Kidson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+three-dimensional+organisation+of+the+post-trabecular+aqueous+outflow+pathway+and+limbal+vasculature+in+the+mouse.">The three-dimensional organisation of the post-trabecular aqueous outflow pathway and limbal vasculature in the mouse.</a> Experimental Eye Research. 125, 226-235 (2014).</li><li>Prusky, G. T., Alam, N. M., Beekman, S., Douglas, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+quantification+of+adult+and+developing+mouse+spatial+vision+using+a+virtual+optomotor+system.">Rapid quantification of adult and developing mouse spatial vision using a virtual optomotor system.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 45 (12), 4611-4616 (2004).</li><li>Sasovetz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ketamine+hydrochloride:+an+effective+general+anesthetic+for+use+in+electroretinography.">Ketamine hydrochloride: an effective general anesthetic for use in electroretinography.</a> Annals of Ophthalmology. 10 (11), 1510-1514 (1978).</li><li>Stabio, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+map+of+the+mouse+eye+for+orienting+retinal+topography+in+anatomical+space.">A novel map of the mouse eye for orienting retinal topography in anatomical space.</a> The Journal of Comparative Neurology. 526 (11), 1749-1759 (2018).</li><li>Blanco, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Chronic+Ocular-Hypertensive+Rat+Model+induced+by+Injection+of+the+Sclerosant+Agent+Polidocanol+in+the+Aqueous+Humor+Outflow+Pathway.">A Chronic Ocular-Hypertensive Rat Model induced by Injection of the Sclerosant Agent Polidocanol in the Aqueous Humor Outflow Pathway.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (13), 3209 (2019).</li><li>Paranhos, A., Prata, J. A., de Mello, P. A., da Silva, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-Trabecular+Glaucomas+with+Elevated+Episcleral+Venous+Pressure.">Post-Trabecular Glaucomas with Elevated Episcleral Venous Pressure.</a> Mechanisms of the Glaucomas. , 139-157 (2008).</li><li>Ou, Y., Jo, R. E., Ullian, E. M., Wong, R. O. L., Della Santina, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+Vulnerability+of+Specific+Retinal+Ganglion+Cell+Types+and+Synapses+after+Transient+Ocular+Hypertension.">Selective Vulnerability of Specific Retinal Ganglion Cell Types and Synapses after Transient Ocular Hypertension.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of The Society for Neuroscience. 36 (35), 9240-9252 (2016).</li></ol>

Die Limbus-Plexus-Kauterisation (LPC) ist ein neuartiges posttrabekuläres Modell mit dem Vorteil, dass es auf leicht zugängliche Gefäßstrukturen abzielt, die keine Konjunktival- oder Zapfendissektion erfordern17,28. Anders als beim Vortex-Venen-Kauterisierungsmodell, einem renommierten OHT-Modell, das auf der chirurgischen Beeinträchtigung der Aderhautvenendrainage basiert, ist nicht zu erwarten, dass eine venöse Stauung den IOD-Anstieg im LPC-Modell beeinf...

In der medizinischen Literatur wird das Glaukom als eine heterogene Gruppe von Optikusneuropathien verstanden, die durch eine fortschreitende Degeneration von retinalen Ganglienzellen (RGCs), Dendriten, Soma und Axonen gekennzeichnet sind, was zu einem strukturellen Schröpfen (Exkavation) der Papille und einer funktionellen Verschlechterung des Sehnervs führt, was in unkontrollierten Fällen zu einer Amaurose führt, indem die Übertragung visueller Informationen vom Auge zum Gehirn unterbrochen wird1. Das Glaukom ist derzeit weltweit die häufigste Ursache für irreversible Erblindung und wird im Jahr 2040 voraussichtlich etwa 111,8 Millionen Menschen erreichen2, was die Lebensqualität der Patienten stark beeinträchtigt und zu erheblichen sozioökonomischen Problemen führt3.
Ein erhöhter Augeninnendruck (IOD) ist einer der wichtigsten und einzigen modifizierbaren Risikofaktoren für die Entstehung und das Fortschreiten des Glaukoms. Unter den verschiedenen Arten von Glaukom sind alle, mit Ausnahme des Normaldruckglaukoms (NTG), mit einem erhöhten Augeninnendruck zu einem bestimmten Zeitpunkt in der klinischen Geschichte der Krankheit verbunden. Trotz bemerkenswerter klinischer und chirurgischer Fortschritte, um den Augeninnendruck zu bekämpfen und das Fortschreiten der Krankheit zu verlangsamen oder zu stoppen, verlieren Patienten aufgrund eines Glaukoms immer noch ihr Augenlicht 4,5. Daher ist ein gründliches Verständnis der komplexen und multifaktoriellen Pathophysiologie dieser Krankheit unerlässlich für die Entwicklung wirksamerer Behandlungen, insbesondere zur Neuroprotektion von RGCs.
Unter einer Vielzahl von experimentellen Ansätzen zum Verständnis von Krankheitsmechanismen ähneln Tiermodelle, die auf okulärer Hypertonie (OHT) basieren, am ehesten dem menschlichen Glaukom. Nagetiermodelle sind besonders nützlich, da sie kostengünstig sind, einfach zu handhaben sind, genetisch manipuliert werden können, eine kurze Lebensdauer haben und anatomische und physiologische Merkmale aufweisen, die mit denen des Menschen vergleichbar sind, wie z. B. Kammerwasserproduktion und -drainage 6,7,8,9,10,11,12,13 . Zu den derzeit verwendeten Modellen gehören die Sklerose des Trabekelwerks nach Injektion von hypertoner Kochsalzlösung in episklerale Venen14, die intrakamerale Injektion von Mikrokügelchen 15 oder viskoelastischen Substanzen 16, die Kauterisierung von Wirbelvenen17, die Photokoagulation des Trabekelwerks mit dem Argonlaser 18, die zirkumlimbale Naht 19 und die Verwendung eines transgenen Modells der altersabhängigen OHT (DBA/2J-Mäuse)8. Invasivität, postoperative Trübung der Hornhaut, Störung des vorderen Augenabschnitts, umfangreiche Lernkurven, teure Geräte und stark schwankende postoperative IOPs gehören jedoch zu den berichteten Fallstricken, die mit den aktuellen Modellen verbunden sind, so dass die Entwicklung eines alternativen OHT-Modells erforderlich ist, um diese Probleme zu überwinden20,21,22.
Das vorliegende Protokoll formalisiert ein neuartiges chirurgisches Verfahren zur Induktion von OHT als Stellvertreter für das Glaukom, basierend auf der Kauterisierung des Limbusplexus (LPC) bei Nagetieren23. Dies ist ein einfaches, reproduzierbares, zugängliches und nicht-invasives Modell, das eine hohe Effizienz und geringe Variabilität der IOD-Erhöhung bietet, verbunden mit einer einzigartig hohen Rate der vollständigen klinischen Genesung, und somit eine In-vivo-Funktionsbewertung bei einer reduzierten Anzahl von Tieren ermöglicht, die in jedem Experiment verwendet werden. Die Operationstechnik induziert eine subakute OHT mit einer allmählichen Rückkehr zum Ausgangswert innerhalb weniger Tage, was den hypertensiven Anfall beim akuten Winkelverschlussglaukom modelliert. Darüber hinaus folgt auf die IOD-Erholung im Modell eine kontinuierliche glaukomatöse Neurodegeneration, die für zukünftige mechanistische Studien der sekundären Degeneration von RGCs nützlich ist, die in mehreren Fällen von humanem Glaukom trotz adäquater Kontrolle des IOD auftritt.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Isofar</td>
			<td>201</td>
			<td>Used for electron microscopy tissue preparation (step 5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Active electrode for electroretinography</td>
			<td>Hansol Medical Co</td>
			<td>-</td>
			<td>Stainless steel needle 0.25 mm &#215; 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anestalcon</td>
			<td>Novartis Bioci&#234;ncias S/A</td>
			<td>MS-1.0068.1087</td>
			<td>Proxymetacaine hydrochloride 0.5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Vetec</td>
			<td>560</td>
			<td>Used for electron microscopy tissue preparation (step 5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cautery Low Temp Fine Tip 10/bx</td>
			<td>Bovie Medical Corporation</td>
			<td>AA00</td>
			<td>Low-temperature ophthalmic cautery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cetamin</td>
			<td>Syntec do Brasil Ltda</td>
			<td>000200-3-000003</td>
			<td>Ketamine hydrochloride 10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAKO</td>
			<td>Dako North America</td>
			<td>S3023</td>
			<td>Antifade mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>28718-90-3</td>
			<td>diamidino-2-phenylindole; blue fluorescent nuclear counterstain; emission at 452&#177;3 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ecofilm</td>
			<td>Crist&#225;lia Produtos Qu&#237;micos Farmac&#234;uticos Ltda</td>
			<td>MS-1.0298.0487</td>
			<td>Carmellose sodium 0.5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPON Resin</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>Epoxy resin used for electron microscopy, composed of a mixture of four reagents: Poly/Bed 812 Resin (CAT#08791); DDSA - Dodecenylsuccinic Anhydride (CAT#00563); NMA - Nadic Methyl Anhydride (CAT#00886); DMP-30 - 2,4,6-tris(dimethylaminomethyl)phenol (CAT#00553)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>16110</td>
			<td>Used for electron microscopy tissue preparation (step 5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyabak</td>
			<td>Uni&#227;o Qu&#237;mica Farmac&#234;utica Nacional S/A</td>
			<td>MS-8042140002</td>
			<td>Sodium hyaluronate 0.15%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Icare Tonolab</td>
			<td>Icare Finland Oy</td>
			<td>TV02 (model number)</td>
			<td>Rebound handheld tonometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG donkey anti-mouse antibody + Alexa Fluor 555</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A31570</td>
			<td>Secondary antibody solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LCD monitor 23 inches</td>
			<td>Samsung Electronics Co. Ltd.</td>
			<td>S23B550</td>
			<td>Model LS23B550, for electroretinogram recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 510 Meta</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td>Confocal epifluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxiflox</td>
			<td>Crist&#225;lia Produtos Qu&#237;micos Farmac&#234;uticos Ltda</td>
			<td>MS-1.0298.0489</td>
			<td>Ciprofloxacin 3.5 mg/g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEB-9400K</td>
			<td>Nihon Kohden Corporation</td>
			<td>-</td>
			<td>System for electroretinogram recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monoclonal IgG1 mouse anti-Brn3a</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>MAB-1585</td>
			<td>Brn3a primary antibody solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neuropack Manager v08.33</td>
			<td>Nihon Kohden Corporation</td>
			<td>-</td>
			<td>Software for electroretinogram signal processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optomotry</td>
			<td>CerebralMechanics</td>
			<td>-</td>
			<td>System for optomotor response analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>19100</td>
			<td>Used for electron microscopy tissue preparation (step 5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium ferrocyanide</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>20150</td>
			<td>Used for electron microscopy tissue preparation (step 5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reference and ground electrodes for electroretinography</td>
			<td>Chalgren Enterprises</td>
			<td>110-63</td>
			<td>Stainless steel needles 0.4 mm &#215; 37 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cacodylate buffer</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>12300</td>
			<td>Used for electron microscopy tissue preparation (step 5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ster MD</td>
			<td>Uni&#227;o Qu&#237;mica Farmac&#234;utica Nacional S/A</td>
			<td>MS-1.0497.1287</td>
			<td>Prednisolone acetate 0.12%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terolac</td>
			<td>Crist&#225;lia Produtos Qu&#237;micos Farmac&#234;uticos Ltda</td>
			<td>MS-1.0497.1286</td>
			<td>Ketorolac trometamol 0.5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terramicina</td>
			<td>Laborat&#243;rios Pfizer Ltda</td>
			<td>MS-1.0216.0024</td>
			<td>Oxytetracycline hydrochloride 30 mg/g + polymyxin B 10,000 U/g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tono-Pen XL</td>
			<td>Reichert Technologies</td>
			<td>230635</td>
			<td>Digital applanation handheld tonometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TO-PRO-3</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T3605</td>
			<td>Far red-fluorescent nuclear counterstain; emission at 661 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9036-19-5</td>
			<td>Non-ionic surfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22400</td>
			<td>Used for electron microscopy tissue preparation (step 5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xilazin</td>
			<td>Syntec do Brasil Ltda</td>
			<td>7899</td>
			<td>Xylazine hydrochloride 2%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td>Stereo microscope for surgery and retinal dissection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

full-circle cauterization of limbal vascular plexus for surgically induced glaucoma in rodents

Das Glaukom, die zweithäufigste Erblindungsursache weltweit, ist eine heterogene Gruppe von Augenerkrankungen, die durch eine strukturelle Schädigung des Sehnervs und eine Degeneration der retinalen Ganglienzellen (RGC) gekennzeichnet sind, die zu einer Sehstörung führt, indem die Übertragung visueller Informationen vom Auge zum Gehirn unterbrochen wird. Ein erhöhter Augeninnendruck ist der wichtigste Risikofaktor; Daher wurden mehrere Modelle der okulären Hypertonie bei Nagetieren entweder durch genetische oder experimentelle Ansätze entwickelt, um die Ursachen und Auswirkungen der Krankheit zu untersuchen. Unter diesen wurden einige Einschränkungen berichtet, wie z. B. chirurgische Invasivität, unzureichende funktionelle Beurteilung, die Notwendigkeit einer umfangreichen Ausbildung und eine sehr variable Ausdehnung der Netzhautschäden. Die vorliegende Arbeit charakterisiert eine einfache, kostengünstige und effiziente Methode zur Induktion von okulärer Hypertonie bei Nagetieren, die auf der Kauterisierung des limbalen Gefäßplexus bei niedriger Temperatur, einer Hauptkomponente der Kammerwasserdrainage, basiert. Das neue Modell bietet eine technisch einfache, nicht-invasive und reproduzierbare subakute okuläre Hypertonie, die mit einer progressiven RGC und einer Degeneration des Sehnervs einhergeht, sowie eine einzigartige postoperative klinische Genesungsrate, die in vivo funktionelle Studien sowohl mit elektrophysiologischen als auch mit verhaltenstherapeutischen Methoden ermöglicht.

Die quantitativen Variablen werden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) ausgedrückt. Mit Ausnahme des Vergleichs der IOD-Dynamik zwischen OHT- und Kontrollgruppen (Abbildung 1F) wurde die statistische Analyse mittels Zwei-Wege-ANOVA durchgeführt, gefolgt von Sidaks Mehrfachvergleichstest. Ein p-Wert < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.
Abbildung 1 zeigt die chirurgischen Schritte des Modells der Full...

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Full-Circle Cauterization of Limbal Vascular Plexus for Surgically Induced Glaucoma in Rodents

Das Ziel dieses Protokolls ist es, ein neuartiges Modell der glaukomatösen Neurodegeneration zu charakterisieren, das auf einer thermischen 360°-Kauterisierung des limbalen Gefäßplexus basiert und eine subakute okuläre Hypertonie induziert.

Vollkreiskauterisierung des limbalen Gefäßplexus bei chirurgisch induziertem Glaukom bei Nagetieren

Glaucoma, the second leading cause of blindness worldwide, is a heterogeneous group of ocular disorders characterized by structural damage to the optic ...

Wir haben eine einfache Methode entwickelt, um eine robuste und progressive Glaukomdegeneration zu induzieren, die auf einer temporären Erhöhung des Augeninnendrucks basiert. Dies stellt eine einzigartige Gelegenheit dar, Schlüsselpunkte der Pathophysiologie des Glaukoms zu untersuchen. Dabei handelt es sich um ein leicht zu erlernendes, nicht-invasives, kostengünstiges und hochgradig reproduzierbares Modell, das eine In-vivo-Funktionsanalyse und kurzfristige Versuchspläne mit einer reduzierten Anzahl von Tieren für jedes Experiment ermöglicht.Die Netzhaut und der Sehnerv sind bewertbare Teile des zentralen Nervensystems, so dass die Modellierung der fortschreitenden Beeinträchtigung dieser Strukturen wertvolle Einblicke in andere neurodegenerative Erkrankungen liefern kann. Um den Augeninnendruck (IOD) sowohl der experimentellen als auch der kontralateralen Kontrollaugen zu messen, wird die anästhesierte Ratte in ventraler Dekubitusposition auf die Tischplatte gelegt, so dass die Hornhautoberfläche für die Spitze des Tonometers leicht zugänglich ist. Positionieren Sie die Tonometerspitze so, dass sie die zentrale Hornhautzone senkrecht leicht berührt.Erfassen Sie dann die Messung, indem Sie die Messtaste drücken. Als nächstes wird die Ratte in eine leichte seitliche Dekubitusposition unter ein Stereomikroskop gelegt und das Versuchsauger bei 40-facher Vergrößerung untersucht. Halten Sie während des Eingriffs das kontralaterale Kontrollauge befeuchtet, indem Sie einen Tropfen Carmellose-Natrium oder Natriumhyaluronat einträufeln.Schieben Sie dann mit einer gebogenen Pinzette den experimentellen Augapfel vorsichtig nach vorne, um das Gefäßsystem um den 360-Grad-Limbus herum freizulegen. Dann mit der anderen Hand mit einem Augenkauter mit niedriger Temperatur die Gefäße rund um die Hornhaut vorsichtig veröden. Achten Sie darauf, die Hornhautperipherie nicht zu verätzen.Bestätigen Sie den Erfolg des chirurgischen Eingriffs, indem Sie das Auftreten kleiner kreisförmiger Kauterisierungsspuren am Sklerallimbus, die Verödung des limbalen Gefäßsystems und die Pupillenerweiterung im operierten Auge beobachten. Überprüfen Sie nach der Operation den unmittelbaren postoperativen Augeninnendruck in beiden Augen, wie bereits gezeigt. Tragen Sie dann einen Tropfen ophthalmisches Prednisolonacetat auf die vordere Oberfläche des experimentellen Auges auf.Ersetzen Sie es nach 40 Sekunden durch eine ophthalmische antibiotische Salbe. Wenden Sie eine tägliche klinische Nachsorge des experimentellen Auges mit topischen Medikamenten an, die aus einem nichtsteroidalen entzündungshemmenden Medikament und einer antibiotischen Salbe bestehen. Für die Analyse der optomotorischen Reaktion wird die Ratte zur Gewöhnung auf eine Plattform gesetzt, die mit vier Computermonitoren in einem Viereck aufgebaut ist.Halten Sie den roten Fadenkreuz-Cursor auf dem Videobild zwischen den Augen der sich frei bewegenden Ratte, da er die Mitte des virtuellen Zylinders anzeigt. Beobachten Sie die optomotorische Reaktion, die aus einer reflexiven Verfolgung des Kopfes und Halses der Ratte besteht, die durch die rotierenden Abstufungen hervorgerufen wird. Führen Sie zunächst einen Stimulus mit niedriger Ortsfrequenz ein und erhöhen Sie dann die Frequenz schrittweise, bis die Verfolgungsbewegung nicht mehr bemerkt wird.Um das Musterelektroretinogramm aufzuzeichnen, wird nach der Anästhesie der Ratte die aktive Elektrode vorsichtig an der temporalen Peripherie der Hornhaut eingeführt. Zusätzlich wird die Referenzelektrode in das subkutane Gewebe des ipsilateralen Schläfenkanthus und die Bodenelektrode in eine der Hintergliedmaßen eingeführt. Positionieren Sie dann die Ratte 20 Zentimeter vom Stimulusbildschirm entfernt, überwachen Sie die Signalbasislinie und starten Sie die Erfassung, indem Sie die Analysetaste am Erfassungssystem drücken.Nachdem Sie die Netzhaut isoliert haben, übertragen Sie sie in eine 24-Well-Kulturplatte mit einem Milliliter PBS, wobei die innere Netzhaut nach oben zeigt. Permeabilisieren Sie das Gewebe durch Waschen mit einem 0,5%igen nichtionischen Tensid, das in PBS verdünnt ist. Inkubieren Sie dann das Gewebe und die Blockierungslösung eine Stunde lang bei Raumtemperatur mit leichtem Schütteln.Während der Inkubation Brn-3a-Primärantikörperlösung herstellen und bei vier Grad Celsius lagern. Nach der Gewebeblockierung wird die Netzhaut in 200 Mikrolitern primärer Antikörperlösung bei vier Grad Celsius für 72 Stunden mit leichtem Schütteln inkubiert. Als nächstes waschen Sie das Taschentuch mit PBS.Inkubieren Sie das Gewebe in 200 Mikrolitern der sekundären Antikörperlösung für zwei Stunden bei Raumtemperatur und dann 10 Minuten lang mit nuklearer Gegenfärbungslösung für die Fluoreszenznuklei-Färbung. Nach drei PBS-Wäschen übertragen Sie die Netzhaut mit zwei kleinen Bürsten auf einen Objektträger aus Glas, wobei die Glaskörperseite nach oben gerichtet bleibt. Positionieren Sie den dorsalen Netzhautquadranten nach oben auf dem Objektträger.Zum Schluss tragen Sie 200 Mikroliter Antifade-Eindeckmittel auf ein Deckglas auf und legen es zur mikroskopischen Analyse auf die flach aufliegende Netzhaut. Untersuchen Sie unter einem konfokalen Epifluoreszenzmikroskop mit einem 40-fachen Vergrößerungsobjektiv die flachen Halterungen, um die retinalen Ganglienzellen zu schätzen. Entfernen Sie nach der Enukleation des Augapfels das proximale Segment des intraorbitalen Teils des Sehnervs, einschließlich eines Teils des intraokularen Anteils.Geben Sie die Proben dann sofort in Fläschchen oder Röhrchen, die 200 bis 300 Mikroliter kaltes Fixiermittel enthalten. Waschen Sie das Gewebe nach zwei Stunden mit kaltem 100 Mikromol Natriumcacodylat-Puffer. Dann fixieren Sie das Gewebe eine Stunde lang in 1%igem Osmiumtetroxid und fünf nanomolaren Kalziumchloriden bei vier Grad Celsius unter leichtem Schütteln.Waschen Sie die Sehnervenfragmente nach drei Wäschen mit kaltem Natriumcacodylatpuffer vor der Inkubation über Nacht mit kaltem destilliertem Wasser und 1%igem Urinalacetat bei vier Grad Celsius. Am nächsten Tag, nach drei Wäschen mit Wasser, dehydrieren Sie das Gewebe schrittweise in steigenden Acetonkonzentrationen. Führen Sie dann drei Runden mit Einbettungs- und Epoxidharzacetonlösungen durch, bevor Sie das Gewebe 24 Stunden lang in reines Epoxidharz einbetten.Am nächsten Tag werden die Proben aus dem Probenträger entnommen und für 48 Stunden bei 60 Grad Celsius in Einbettformen überführt. Nach der Polymerisation werden mit einem Ultramikrotom transversale halbdünne Schnitte der Sehnervenfragmente geschnitten. Sammeln Sie dann die Schnitte und übertragen Sie sie auf einen Objektträger.Färben Sie die Schnitte mit Toluidinblau und fotografieren Sie sie mit einem optischen Mikroskop bei 100-facher Vergrößerung. Für die Ultrastrukturanalyse werden ultradünne Querschnitte durchgeführt und auf einem Kupfergitter gesammelt. Anschließend färben Sie die Abschnitte mit Urinalacetat und Bleicitrat für die transmissionselektronenmikroskopische Untersuchung.Die Vollkreiskauterisation induzierte unmittelbar nach der Operation eine Erhöhung des Augeninnendrucks im Vergleich zu Kontrollaugen. Der Peak für den postoperativen IOD wurde am ersten Tag beobachtet und sank am sechsten Tag allmählich auf die Ausgangswerte. Darüber hinaus wurde die Netzhautfunktion sowohl verhaltensbezogen als auch elektrophysiologisch mittels optomotorischem Reflex bzw. Musterelektroretinogramm bewertet.Nach der Operation zeigten beide Parameter zwei unterschiedliche Phasen der Beeinträchtigung: die akute Phase der okulären Hypertonie am dritten Tag und eine sekundäre Degenerationsphase am 30. Tag. Im Vergleich zu Kontrollsehnerven nahmen die axonalen Zahlen und die halbdünnen transversalen Sehnervenabschnitte nach der Operation progressiv ab. Transmissionselektronenmikroskopische Aufnahmen von Sehnerven aus dem Kontrollauge zeigten dicht gepackte myelinisierte Fasern, die durch dünne Gliazellfortsätze getrennt sind, und deutliche axonale Mikrotubuli und Neurofilamente.Im Gegensatz dazu wurden nach drei Tagen okulärer Hypertonie einige degenerierte Fasern, zytoplasmatische Vakuolisierung in Gliazellprozessen und kondensiertes Chromatin in Gliazellkernen beobachtet. Nach sieben Tagen kam es zu einer Zunahme degenerierter axonaler Fasern und hypertoner Gliazellfortsätze. Und nach 14 Tagen wurde eine weitere Störung der Sehnervenfasern beobachtet, die mit der Invasion von Gliazellfortsätzen zwischen den Axonen verbunden war.Darüber hinaus nahm die Dichte der retinalen Ganglienzellen mit der Zeit vor allem in den dorsalen und temporalen retinalen Quadranten ab. Versuchen Sie bei der Durchführung dieses Eingriffs, die limbalen Gefäße vorsichtig mit einer Kauterspitze zu berühren, um die Nabelschnurperipherie zu schonen und sicherzustellen, dass kontinuierliche Kauterisierungsspuren rund um den Skleralimbus beobachtet werden. Im Anschluss an dieses Verfahren kann eine Vielzahl von Methoden angewendet werden, wie z. B. die funktionelle biochemische und immunhistochemische Bewertung von Augenstrukturen und andere Methoden, die die Glaukom-Physiopathologie anerkennen können.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparing Undercut Model of Posttraumatic Epileptogenesis in Rodents

Partially isolated cortex ("undercut") is an animal model of posttraumatic epileptogenesis. The surgical procedure involves cutting through the sensorimotor cortex and the underneath white matter (undercut) so that a specific region of the cerebral cortex is largely isolated from the neighboring cortex and subcortical regions1-3. After a latency of two or more weeks following the surgery, epileptiform discharges can be recorded in brain slices from rodents1; and electrical or behavior seizures can be observed in vivo from other species such as cat and monkey4-6. This well established animal model is efficient to generate and mimics several important characteristics of traumatic brain injury. However, it is technically challenging attempting to make precise cortical lesions in the small rodent brain with a free hand. Based on the procedure initially established in Dr. David Prince's lab at the Stanford University1, here we present an improved technique to perform a surgery for the preparation of this model in mice and rats. We demonstrate how to make a simple surgical device and use it to gain a better control of cutting depth and angle to generate more precise and consistent results. The device is easy to make, and the procedure is quick to learn. The generation of this animal model provides an efficient system for study on the mechanisms of posttraumatic epileptogenesis.

Partially isolated cortex (&#x201C;undercut&#x201D;) is an efficient animal model of posttraumatic epileptogenesis. Here we demonstrate how to make a novel surgical device and use it to make more precise and consistent lesions to generate this model.

Vorbereitung Undercut Modell Posttraumatische Epileptogenese in Nagetiere

Partially isolated cortex ("undercut") is an animal model of posttraumatic epileptogenesis. The surgical procedure involves cutting through the ...

Forschung

Neurowissenschaften

Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents

The goal of fixation is to rapidly and uniformly preserve tissue in a life-like state. While placing tissue directly in fixative works well for small pieces of tissue, larger specimens like the intact brain pose a problem for immersion fixation because the fixative does not reach all regions of the tissue at the same rate 5,7. Often, changes in response to hypoxia begin before the tissue can be preserved 12. The advantage of directly perfusing fixative through the circulatory system is that the chemical can quickly reach every corner of the organism using the natural vascular network. In order to utilize the circulatory system most effectively, care must be taken to match physiological pressures 3. It is important to note that physiological pressures are dependent on the species used. Techniques for perfusion fixation vary depending on the tissue to be fixed and how the tissue will be processed following fixation. In this video, we describe a low-cost, rapid, controlled and uniform fixation procedure using 4% paraformaldehyde perfused via the vascular system: through the heart of the rat to obtain the best possible preservation of the brain for immunohistochemistry. The main advantage of this technique (vs. gravity-fed systems) is that the circulatory system is utilized most effectively.

Here we describe a low-cost, rapid, controlled and uniform fixation procedure using 4% paraformaldehyde perfused via the vascular system: through the heart of the rat to obtain the best possible preservation of the brain.

Ganze Tier Perfusionsfixierung für Nager

The goal of fixation is to rapidly and uniformly preserve tissue in a life-like state. While placing tissue directly in fixative works well for small ...

Large-scale Recording of Neurons by Movable Silicon Probes in Behaving Rodents

A major challenge in neuroscience is linking behavior to the collective activity of neural assemblies. Understanding of input-output relationships of neurons and circuits requires methods with the spatial selectivity and temporal resolution appropriate for mechanistic analysis of neural ensembles in the behaving animal, i.e. recording of representatively large samples of isolated single neurons. Ensemble monitoring of neuronal activity has progressed remarkably in the past decade in both small and large-brained animals, including human subjects1-11. Multiple-site recording with silicon-based devices are particularly effective because of their scalability, small volume and geometric design.
Here, we describe methods for recording multiple single neurons and local field potential in behaving rodents, using commercially available micro-machined silicon probes with custom-made accessory components. There are two basic options for interfacing silicon probes to preamplifiers: printed circuit boards and flexible cables. Probe supplying companies (<a href="http://www.neuronexustech.com/" >http://www.neuronexustech.com/</a>; <a href="http://www.sbmicrosystems.com/">http://www.sbmicrosystems.com/</a>; <a href="http://www.acreo.se/">http://www.acreo.se/</a>) usually provide the bonding service and deliver probes bonded to printed circuit boards or flexible cables. Here, we describe the implantation of a 4-shank, 32-site probe attached to flexible polyimide cable, and mounted on a movable microdrive. Each step of the probe preparation, microdrive construction and surgery is illustrated so that the end user can easily replicate the process.

We describe methods for large-scale recording of multiple single units and local field potential in behaving rodents with silicon probes. Drive fabrication, probe attachment to the drive and probe implantation processes are illustrated in sufficient details for easy replication.

Großflächige Aufnahme von Neuronen durch Movable Silicon Probes in Behaving Nagetiere

A major challenge in neuroscience is linking behavior to the collective activity of neural assemblies. Understanding of input-output relationships of ...

A Low Cost Setup for Behavioral Audiometry in Rodents

In auditory animal research it is crucial to have precise information about basic hearing parameters of the animal subjects that are involved in the experiments. Such parameters may be physiological response characteristics of the auditory pathway, e.g. via brainstem audiometry (BERA). But these methods allow only indirect and uncertain extrapolations about the auditory percept that corresponds to these physiological parameters. To assess the perceptual level of hearing, behavioral methods have to be used. A potential problem with the use of behavioral methods for the description of perception in animal models is the fact that most of these methods involve some kind of learning paradigm before the subjects can be behaviorally tested, e.g. animals may have to learn to press a lever in response to a sound. As these learning paradigms change perception itself 1,2 they consequently will influence any result about perception obtained with these methods and therefore have to be interpreted with caution. Exceptions are paradigms that make use of reflex responses, because here no learning paradigms have to be carried out prior to perceptual testing. One such reflex response is the acoustic startle response (ASR) that can highly reproducibly be elicited with unexpected loud sounds in na&iuml;ve animals. This ASR in turn can be influenced by preceding sounds depending on the perceptibility of this preceding stimulus: Sounds well above hearing threshold will completely inhibit the amplitude of the ASR; sounds close to threshold will only slightly inhibit the ASR. This phenomenon is called pre-pulse inhibition (PPI) 3,4, and the amount of PPI on the ASR gradually depends on the perceptibility of the pre-pulse. PPI of the ASR is therefore well suited to determine behavioral audiograms in na&iuml;ve, non-trained animals, to determine hearing impairments or even to detect possible subjective tinnitus percepts in these animals. In this paper we demonstrate the use of this method in a rodent model (cf. also ref. 5), the Mongolian gerbil (Meriones unguiculatus), which is a well know model species for startle response research within the normal human hearing range (e.g. 6).

A fast and inexpensive method for the behavioral determination of hearing parameters like hearing thresholds, hearing impairments or phantom perceptions (subjective tinnitus) is described. It uses pre-pulse inhibition of the acoustic startle response and can be easily implemented in a personal computer using a programmable AD/DA-converter and a piezo sensor.

Ein Low-Cost-Setup für Verhaltensaudiometrie in Nagetiere

In auditory animal research it is crucial to have precise information about basic hearing parameters of the animal subjects that are involved in the ...

Recording and Analysis of Circadian Rhythms in Running-wheel Activity in Rodents

When rodents have free access to a running wheel in their home cage, voluntary use of this wheel will depend on the time of day1-5. Nocturnal rodents, including rats, hamsters, and mice, are active during the night and relatively inactive during the day. Many other behavioral and physiological measures also exhibit daily rhythms, but in rodents, running-wheel activity serves as a particularly reliable and convenient measure of the output of the master circadian clock, the suprachiasmatic nucleus (SCN) of the hypothalamus. In general, through a process called entrainment, the daily pattern of running-wheel activity will naturally align with the environmental light-dark cycle (LD cycle; e.g. 12 hr-light:12 hr-dark). However circadian rhythms are endogenously generated patterns in behavior that exhibit a ~24 hr period, and persist in constant darkness. Thus, in the absence of an LD cycle, the recording and analysis of running-wheel activity can be used to determine the subjective time-of-day. Because these rhythms are directed by the circadian clock the subjective time-of-day is referred to as the circadian time (CT). In contrast, when an LD cycle is present, the time-of-day that is determined by the environmental LD cycle is called the zeitgeber time (ZT).
Although circadian rhythms in running-wheel activity are typically linked to the SCN clock6-8, circadian oscillators in many other regions of the brain and body9-14 could also be involved in the regulation of daily activity rhythms. For instance, daily rhythms in food-anticipatory activity do not require the SCN15,16 and instead, are correlated with changes in the activity of extra-SCN oscillators17-20. Thus, running-wheel activity recordings can provide important behavioral information not only about the output of the master SCN clock, but also on the activity of extra-SCN oscillators. Below we describe the equipment and methods used to record, analyze and display circadian locomotor activity rhythms in laboratory rodents.

Circadian rhythms in voluntary wheel-running activity in mammals are tightly coupled to the molecular oscillations of a master clock in the brain. As such, these daily rhythms in behavior can be used to study the influence of genetic, pharmacological, and environmental factors on the functioning of this circadian clock.

Aufnahme und Analyse der zirkadianen Rhythmen in Laufen-Rad-Aktivität in Nagetiere

When rodents have free access to a running wheel in their home cage, voluntary use of this wheel will depend on the time of day1-5. Nocturnal rodents, ...

Deep Brain Stimulation with Simultaneous fMRI in Rodents

In order to visualize the global and downstream neuronal responses to deep brain stimulation (DBS) at various targets, we have developed a protocol for using blood oxygen level dependent (BOLD) functional magnetic resonance imaging (fMRI) to image rodents with simultaneous DBS. DBS fMRI presents a number of technical challenges, including accuracy of electrode implantation, MR artifacts created by the electrode, choice of anesthesia and paralytic to minimize any neuronal effects while simultaneously eliminating animal motion, and maintenance of physiological parameters, deviation from which can confound the BOLD signal.&#160;Our laboratory has developed a set of procedures that are capable of overcoming most of these possible issues. For electrical stimulation, a homemade tungsten bipolar microelectrode is used, inserted stereotactically at the stimulation site in the anesthetized subject. In preparation for imaging, rodents are fixed on a plastic headpiece and transferred to the magnet bore. For sedation and paralysis during scanning, a cocktail of dexmedetomidine and pancuronium is continuously infused, along with a minimal dose of isoflurane; this preparation minimizes the BOLD ceiling effect of volatile anesthetics. In this example experiment, stimulation of the subthalamic nucleus (STN) produces BOLD responses which are observed primarily in ipsilateral cortical regions, centered in motor cortex. Simultaneous DBS and fMRI allows the unambiguous modulation of neural circuits dependent on stimulation location and stimulation parameters, and permits observation of neuronal modulations free of regional bias. This technique may be used to explore the downstream effects of modulating neural circuitry at nearly any brain region, with implications for both experimental and clinical DBS.

This protocol describes a standard method for simultaneous functional magnetic resonance imaging and deep brain stimulation in the rodent. The combined use of these experimental tools allows for the exploration of global downstream activity in response to electrical stimulation at virtually any brain target.

Deep Brain Stimulation mit gleichzeitiger fMRT in Nagetiere

In order to visualize the global and downstream neuronal responses to deep brain stimulation (DBS) at various targets, we have developed a protocol for ...

Quantification of Cerebral Vascular Architecture using Two-photon Microscopy in a Mouse Model of HIV-induced Neuroinflammation

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic neuroinflammatory state within the central nervous system (CNS), thought to be driven principally by virally-mediated activation of microglia and brain resident macrophages. HIV-1 infection is also accompanied by changes in cerebrovascular blood flow (CBF), raising the possibility that HIV-associated chronic neuroinflammation may lead to changes in CBF and/or in cerebral vascular architecture. To address this question, we have used a mouse model for HIV-induced neuroinflammation, and we have tested whether long-term exposure to this inflammatory environment may damage brain vasculature and result in rarefaction of capillary networks. In this paper we describe a method to quantify changes in cortical capillary density in a mouse model of neuroinflammatory disease (HIV-1 Tat transgenic mice). This generalizable approach employs in vivo two-photon imaging of cortical capillaries through a thin-skull cortical window, as well as ex vivo two-photon imaging of cortical capillaries in mouse brain sections. These procedures produce images and z-stack files of capillary networks, respectively, which can be then subjected to quantitative analysis in order to assess changes in cerebral vascular architecture.

This paper describes a method by which the vascular architecture in the brain can be quantified using in vivo and ex vivo two-photon microscopy.

Die Quantifizierung der zerebrale vaskuläre Architektur unter Verwendung von Zwei-Photonen-Mikroskopie in einem Mausmodell der HIV-induzierten Neuroinflammation

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic ...

Cannula Implantation into the Cisterna Magna of Rodents

Cisterna magna cannulation (CMc) is a straightforward procedure that enables direct access to the cerebrospinal fluid (CSF) without operative damage to the skull or the brain parenchyma. In anesthetized rodents, the exposure of the dura mater by blunt dissection of the neck muscles allows the insertion of a cannula into the cisterna magna (CM). The cannula, composed either by a fine beveled needle or borosilicate capillary, is attached via a polyethylene (PE) tube to a syringe. Using a syringe pump, molecules can then be injected at controlled rates directly into the CM, which is continuous with the subarachnoid space. From the subarachnoid space, we can trace CSF fluxes by convective flow into the perivascular space around penetrating arterioles, where solute exchange with the interstitial fluid (ISF) occurs. CMc can be performed for acute injections immediately following the surgery, or for chronic implantation, with later injection in anesthetized or awake, freely moving rodents. Quantitation of tracer distribution in the brain parenchyma can be performed by epifluorescence, 2-photon microscopy, and magnetic resonance imaging (MRI), depending on the physico-chemical properties of the injected molecules. Thus, CMc in conjunction with various imaging techniques offers a powerful tool for assessment of the glymphatic system and CSF dynamics and function. Furthermore, CMc can be utilized as a conduit for fast, brain-wide delivery of signaling molecules and metabolic substrates that could not otherwise cross the blood brain barrier (BBB).

Here we describe a protocol to perform cisterna magna cannulation (CMc), a minimally invasive way to deliver tracers, substrates and signaling molecules into the cerebrospinal fluid (CSF). Combined with different imaging modalities, CMc enables glymphatic system and CSF dynamics assessment, as well as brain-wide delivery of various compounds.

Kanüle Implantation in die Cisterna Magna von Nagetieren

Cisterna magna cannulation (CMc) is a straightforward procedure that enables direct access to the cerebrospinal fluid (CSF) without operative damage to ...

Intracranial Pharmacotherapy and Pain Assays in Rodents

Pain is a salient sensory experience with affective and cognitive dimensions. However, central mechanisms for pain remain poorly understood, hindering the development of effective therapeutics. Intracranial pharmacology presents an important tool for understanding the molecular and cellular mechanisms of pain in the brain, as well as for novel treatments. Here we present a protocol that integrates intracranial pharmacology with pain behavior testing. Specifically, we show how to infuse analgesic drugs into a select brain region, which may be responsible for pain modulation. Furthermore, to determine the effect of the candidate drug in the central nerve system, pain assays are performed after intracranial treatment. Our results demonstrate that intracranial administration of analgesic drugs in a targeted region can provide relief of pain in rodents. Thus, our protocol successfully demonstrates that intracranial pharmacology, combined with pain behavior testing, can be a powerful tool for the study of pain mechanisms in the brain.

Here we present a protocol to perform intracranial pharmacological experiments followed by pain behavior assays in rodents. This protocol allows researchers to deliver molecular and cellular targets in the brain, for pharmacologic agents in the treatment of pain.

Intrakranielle Pharmakotherapie und Schmerz-Assays bei Nagern

Pain is a salient sensory experience with affective and cognitive dimensions. However, central mechanisms for pain remain poorly understood, hindering the ...

The Power of Interstimulus Interval for the Assessment of Temporal Processing in Rodents

Temporal processing deficits have been implicated as a potential elemental dimension of higher-level cognitive processes, commonly observed in neurocognitive disorders. Despite the popularization of prepulse inhibition (PPI) in recent years, many current protocols promote using a percent of control measure, thereby precluding the assessment of temporal processing. The present study used cross-modal PPI and gap prepulse inhibition (gap-PPI) to demonstrate the benefits of employing a range of interstimulus intervals (ISIs) to delineate effects of sensory modality, psychostimulant exposure, and age. Assessment of sensory modality, psychostimulant exposure, and age reveals the utility of an approach varying the interstimulus interval (ISI) to establish the shape of the ISI function, including increases (sharper curve inflections) or decreases (flattening of the response amplitude curve) in startle amplitude. Additionally, shifts in peak response inhibition, suggestive of a differential sensitivity to the manipulation of ISI, are often revealed. Thus, the systematic manipulation of ISI affords a critical opportunity to evaluate temporal processing, which may reveal the underlying neural mechanisms involved in neurocognitive disorders.

Temporal processing, a preattentive process, may underlie deficits in higher-level cognitive processes, including attention, commonly observed in neurocognitive disorders. Using prepulse inhibition as an exemplar paradigm, we present a protocol for manipulating interstimulus interval (ISI) to establish the shape of the ISI function to provide an assessment of temporal processing.