Name: isolation and screening from soil biodiversity for fungi involved in the degradation of recalcitrant materials
Uploaded: 2022-05-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Screening from Soil Biodiversity for Fungi Involved in the Degradation of Recalcitrant Materials at JoVE.com

우리는 파비아 대학의 Scuola di Alta Formazione Dottorale (SAFD)과 Solveig Tosi 교수가이 작업을위한 기회를 제공 한 것을 인정합니다.

1. 토양에서 석회화 물질을 분해 할 수있는 곰팡이 균주 선택
<ol><li>항생제 용액의 제조.<ol>
<li>페니실린 (50 mg / L), 스트렙토 마이신 (40 mg / L), 클로르 테트라 사이클린 (40 mg / L), 네오 마이신 (100 mg / L) 및 클로람페니콜 (100 mg / L)을 탈이온수 250 mL에 넣으십시오.</li>
		<li>항생제 용액에 클로람페니콜을 첨가하기 전에 ≥99% 에탄올 3 mL에 녹인다.</li>
		<li>항생제 용액을 10분 동안 용액 내?...

토양의 풍부한 생물 다양성은 수많은 대사 능력을 가진 곰팡이의 풍부한 원천이며, 그 중 일부는 생물 개선을위한 잠재적 인 후보자가 될 수 있습니다. 선택적 배지 테스트 (프로토콜의 섹션 1)는 천연 복합 폴리머에서 성장할 수있는 곰팡이를 유일한 탄소 공급원으로 분리하기 쉽고 효과적인 방법입니다. 진균류는 리그노분해 효소인 락카제 및 퍼옥시다제(31)와 같은 세포외, 비?...

토양은 지구상의 삶의 기본 구성 요소이며 많은 생태계의 기초입니다. 토양의 미네랄, 유기물 및 미생물은 하나의 시스템으로 간주 될 수 있으며 밀접한 연관성과 상호 작용이 발생합니다. 이러한 화합물의 상호 작용은 육상 과정, 환경 품질 및 생태계 건강에 중요한 영향을 미칩니다1. 토양 오염은 전 세계적으로 심각한 환경 문제를 제기합니다. 살충제, 석유 제품, 플라스틱 및 기타 화학 물질과 같은 석회화 물질 및 독성 물질의 무차별적이고 장기적이며 과도한 적용은 토양 생태학에 심각한 영향을 미치며 결과적으로 토양 미생물을 변화시킬 수 있습니다. 토양의 미생물 공동체는 다른 생리 학적 상태의 광범위한 유기체로 구성되어 있으며 대부분은 박테리아와 곰팡이입니다. 토양의 많은 오염 물질은 중장기 안정성을 가지고 있으며, 그 지속성은 미생물이 재생 물질을 영양소로 활용할 수있게 해주는 적응 메커니즘의 개발로 이어질 수 있습니다 2,3. 따라서 이러한 미생물은 생물 치료 기술로 간주 될 수 있습니다.
생물 정화는 폐기물을 덜 독성 또는 무독성 화합물로 분해 또는 변형시키기 위해 미생물과 그 효소를 사용하여 오염의 영향을 완화하려고 시도합니다. 고세균, 박테리아, 조류 및 곰팡이의 다양한 종은이 생물 치료 능력을 가지고 있습니다4. 그들의 특별한 생분해 작용의 결과로, 곰팡이는 특히 생물 개선을위한 유망한 유기체입니다. 그들은 히팔 네트워크를 사용하여 다른 기질을 공격 할 수있어 다른 미생물보다 토양 매트릭스에 더 효율적으로 침투 할 수 있습니다. 또한, 오염 물질을 제거하기 어려운 접근 할 수없는 간극에 도달 할 수 있습니다5, 그리고 그들은 또한 낮은 수분 수준6에서 살아남을 수 있습니다. 또한, 곰팡이는 비특이적 효소의 다른 카세트를 합성하여 일반적으로 셀룰로오스, 리그닌 및 휴믹산과 같은 천연 석회화 물질을 분해합니다. 표적 기질이 결여된 것들은 탄화수소, 플라스틱 및 살충제 7,8,9,10과 같은 광범위한 재석회성 오염 물질의 분해에 관여할 수 있다. 따라서 많은 곰팡이 종들이 이미 생물 정화제로보고되었지만 석회화 오염 물질의 생물 정화 후보를 선택하기 위해 아직 연구되지 않은 종을 탐구하는 데 관심이 높아지고 있습니다. 생물 치료 특성을 갖는 것으로 이미 알려진 종은 phyla Ascomycota 11,12,13, Basidiomycota 14,15 및 Mucoromycota에 속합니다. 예를 들어, 페니실륨 속 및 아스퍼질러스는 지방족 탄화수소 13, 상이한 플라스틱 중합체16,17,18, 중금속 19, 및 염료20의 분해에 관여하는 것으로 잘 알려져 있다. 마찬가지로, Phanerochaete chrysosporium 및 Trametes versicolor와 같은 basidiomycetes 진균에 대해 수행 된 연구는 방향족 탄화수소13 및 플라스틱21과 같은 석회화 물질의 산화에 관여하는 것으로 나타났습니다. 생분해 과정에 관여하는 진균의 또 다른 예는 zygomycetes Rhizopus spp., Mucor spp., 및 Cunninghamella spp.22,23이다. 특히, 커닝하멜라는 방향족 탄화수소를 산화시킬 수 있으며, 광범위한 이종 바이오틱스13에서 제품의 해독을 연구하기위한 모델 유기체로 간주됩니다.
에스테라제, 락카제, 퍼옥시다제 및 프로테아제와 같은 재석회화 물질(24,25)의 주요 분해 과정에 관여하는 몇몇 진균 효소가 있다. 락카제는 세포에서 생성되고 이어서 분비되는 구리 함유 산화제로서, 다양한 페놀성 및 방향족 화합물의 산화를 허용한다. 이들은 오르토 및 파라디페놀, 아미노기 함유 페놀, 리그닌, 및 아릴기 함유 디아민26을 분해할 수 있다. Peroxidases는 과산화수소를 매개체로 사용하여 리그닌 및 기타 방향족 화합물을 분해합니다. 많은 다른 퍼옥시다제가 있지만, 독성 물질을 분해할 가능성이 가장 큰 것은 리그닌 퍼옥시다제와 망간 퍼옥시다제27이다.
에스테라제 및 프로테아제는 세포 외 또는 외부 세포 효소의 그룹에 속하며, 이는 기원의 세포 외부에서 작용하지만 여전히 그들에 묶여 있습니다. 이 효소는 큰 반석회 분자를 더 작은 분자로 가수분해하는 촉매 작용을 할 수 있습니다. 기질 특이성이 낮기 때문에 이러한 효소는 섬유 염료, 펄프 및 제지 산업에서 방출되는 유출물 및 가죽 태닝, 석유 제품, 플라스틱 및 살충제28,29,30과 같은 다양한 오염 물질의 생물 정화에 중요한 역할을 할 수 있습니다.
생물매개성 진균 균주를 선택하기 위한 다수의 스크리닝 방법이 이미 발표되었다. 예를 들어, 짚계 한천 배지는 다환식 방향족 탄화수소(PAH) 분해에서 높은 전위를 갖는 백색부후균을 스크리닝하기 위해 사용되어 왔다(31); 썩어가는 나무의 작은 조각이 맥아 추출물 한천 (MEA) 위에 놓여져 나무 썩은 곰팡이(32)를 분리했습니다. 그러나 이미 제안 된 대부분의 방법은 관심있는 활성에 대해 매우 구체적인 곰팡이를 선택합니다. 이 연구는 더 넓은 범위의 행동으로 토양 균류를 선택하기위한 더 넓은 접근법을 제안합니다. 이 방법은 항생제와 혼합 된 휴믹산 또는 리그노 셀룰로오스로 수정 된 배지에 토양 샘플의 연속 희석을 초기 도금하여 이러한 천연 석회화 물질을 분해하는 능력을 가진 곰팡이를 선택합니다. 휴믹산과 리그노셀룰로오스는 사실 매우 복잡한 분자 구조를 가지고 있기 때문에 생분해에 매우 저항력이 강한 물질이며, 이를 통해 시험된 진균33,34의 분해 능력에 대한 우수한 지표가 될 수 있습니다. 그 후, 첫 번째 테스트에서 선택된 곰팡이는 바셀린, 중고 엔진 오일 및 플라스틱과 같은 특정 오염 물질을 분해 할 가능성이있는 사람들을 식별하기 위해 선별됩니다. 마지막으로, 재생 물질의 생분해 과정에 관여하는 효소를 생산할 수있는 곰팡이 균주를 검출하기 위해 정성적 효소 테스트가 수행됩니다. 이를 위해 프로테아제 및 에스테라제 테스트가 수행되고 갈산과 구아아콜은 락카제 및 기타 리그놀로지분해 효소 생산35,36의 지표로 사용됩니다. 이들 기질은 진균이 갈색의 형태로 산화시키는 능력과 리그노분해 능력37,38,39의 보유 사이에 강한 상관관계가 발견되었기 때문에 사용된다.
이러한 프로토콜을 통해 높은 분해 잠재력과 광범위한 작용 스펙트럼을 가진 곰팡이 균주를 토양 샘플에서 직접 분리 할 수 있습니다. 이러한 곰팡이 균주의 분리는 생물 치료 목적을위한 새로운 후보자를 찾는 데 도움이 될 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 microwell plate</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>650185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>84609.05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bushnell-Haas Broth</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>B5051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroamphenicol</td>
			<td>Eurobio</td>
			<td>GABCRL006Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlortetracycline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y0001451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoCl2&#183;6H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuCl2&#183;2H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>20821.296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeCl3&#183;6H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>236489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter 0.2 &#181;m</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>10462200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gallic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cover slips</td>
			<td>Biosigma</td>
			<td>VBS634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vials 15 mL</td>
			<td>SciLabware</td>
			<td>P35467</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>guaiacol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-density polyethylene (HDPE)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>434272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humic acids</td>
			<td>Aldrich Chemistry</td>
			<td>53680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lignocellulose</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>Sterilized bioethanol production waste</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-shaped cell spreader</td>
			<td>Laboindustria S.p.a</td>
			<td>21133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnetic stirrer</td>
			<td>A.C.E.F</td>
			<td>8235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malt Extract Broth</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>70146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4&#183;7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette 1000 &#956;L</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10006M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette 200&#160; &#956;L</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10005M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2&#183;4H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2MoO4&#183;2H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0401000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1504489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peptone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>83059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene terephthalate (PET)</td>
			<td>Goodfellow</td>
			<td>ES306031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Laboindustria S.p.a</td>
			<td>21050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petrolatum (Paraffin liquid)</td>
			<td>A.C.E.F</td>
			<td>009661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato Dextrose Broth</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6685</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene (PS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>331651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyurethane (PUR)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>GF20677923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinyl chloride (PVC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>81388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile falcon tube</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>227 261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile glass vials 20 mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SU860051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile point 1000&#160; &#956;L</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F172511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile point 200&#160; &#956;L</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F172311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile polyethylene bags</td>
			<td>WHIRL-PAK</td>
			<td>B01018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile syringe</td>
			<td>Rays</td>
			<td>5523CM25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S-6501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 80</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Used engine oil</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>complex mixture of hydrocarbons, engine additives, and metals, provided by an Italian private company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vials 50 mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>33108-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z0152</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and screening from soil biodiversity for fungi involved in the degradation of recalcitrant materials

환경 오염은 증가하는 문제이며, 생물 정화 과정에 관여하는 곰팡이를 확인하는 것은 필수적인 작업입니다. 토양은 미생물 생물의 놀라운 다양성을 보유하고 있으며 이러한 생물 정화 균류의 좋은 원천이 될 수 있습니다. 이 연구는 다른 선별 검사를 사용하여 생물 개선 잠재력을 가진 토양 균류를 찾는 것을 목표로합니다. 유일한 탄소원으로서 석회화 물질을 보충한 미네랄 배양 배지를 성장 시험으로 사용하였다. 첫째, 토양 희석액을 휴믹산 또는 리그노셀룰로스로 개질된 미네랄 배지로 페트리 접시에 도금하였다. 성장하는 곰팡이 콜로니를 분리하고 탄화수소 (페트롤라툼 및 사용 된 모터 오일)의 복잡한 혼합물과 다른 플라스틱 폴리머 (PET, PP, PS, PUR, PVC)의 분말과 같은 다른 기질에서 테스트했습니다. 정성적 효소 시험은 에스테라제, 락카제, 퍼옥시다제 및 프로테아제의 생산을 조사하기 위한 성장 시험과 관련되었다. 이 효소는 석회화 물질의 주요 분해 과정에 관여하며, 검사 된 곰팡이 균주에 의한 구성 분비는 생물 교정을 위해 악용 될 잠재력을 가질 수 있습니다. 100 개 이상의 균주를 분리하고 테스트했으며, 좋은 생물 개선 잠재력을 가진 몇 가지 분리 물이 발견되었습니다. 결론적으로, 설명 된 선별 시험은 토양에서 생물 정화 잠재력을 가진 곰팡이 균주를 확인하는 쉽고 저렴한 방법입니다. 또한, 최소한의 배양 배지에 다른 재생 물질을 추가함으로써 요구 사항에 따라 다른 오염 물질에 대한 선별 테스트를 조정할 수 있습니다.

선택적 배지 방법 (프로토콜의 섹션 1)은 토양의 풍부한 생물 다양성을 선별하고 높은 생물 정화 잠재력을 가진 곰팡이를 선택할 수있게했습니다. 휴믹산과 리그노셀룰로오스 배지로 100개 이상의 진균 균주를 분리하였다. 이 곰팡이는 많은 오염 물질과 유사한 화학 구조를 가진 천연 석회화 물질의 생분해에 관여하는 효소를 생산했습니다. 그러나, 선택적 배지로 분리된 진균 균주는 추가 스크리?...

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Isolation and Screening from Soil Biodiversity for Fungi Involved in the Degradation of Recalcitrant Materials

여기에서, 우리는 재석회화 물질의 분해에 관여하는 곰팡이 균주를 찾기 위해 토양 생물 다양성을 스크리닝하기위한 프로토콜을 제시합니다. 첫째, 휴믹산 또는 리그노셀룰로오스 상에서 성장할 수 있는 곰팡이 균주가 분리된다. 그들의 활성은 효소 분석과 탄화수소 및 플라스틱과 같은 오염 물질에 대해 테스트됩니다.

석회화 물질의 분해에 관여하는 곰팡이에 대한 토양 생물 다양성으로부터의 분리 및 스크리닝

Environmental pollution is an increasing problem, and identifying fungi involved in the bioremediation process is an essential task. Soil hosts an ...

이 프로토콜은 높은 분해 잠재력을 가진 곰팡이 균주를 생물 정화 목적의 후보로 간주되는 토양 샘플에서 직접 분리하기 때문에 중요합니다. 이 프로토콜은 생물 치료 잠재력을 가진 곰팡이를 찾기위한 저비용 스크리닝입니다. 또한 해석하기 쉬운 결과를 제공합니다.이 기술은 미생물을 취급하는 것을 포함하기 때문에 오염을 피하기 위해 층류 캐비닛 또는 Bunsen 버너를 사용하여 멸균 상태로 작업하는 것이 매우 중요합니다. 시작하려면 관심있는 토양을 샘플링하고 두 밀리미터 메쉬를 사용하여 토양을 체질하여 뿌리와 식물 파편을 제거하십시오. 층류 캐비닛 아래에서 체질 된 토양 1 그램을 멸균 된 15 밀리리터 튜브에 넣으십시오.그런 다음 멸균 탈이온수 10 밀리리터를 첨가하여 마이너스 1 희석액에 10을 만듭니다. 튜브를 수평으로 30 분 동안 흔든다. 현탁액이 침전되기 전에, 멸균 피펫으로 마이너스 1 희석액에 10 밀리리터를 취하여 9 밀리리터의 탈이온수 블랭크로 옮겨 마이너스 두 희석액으로 10을 만듭니다.서스펜션을 철저히 소용돌이치십시오. 유사하게, 마이너스 세 희석액을 10에서 마이너스 두 희석 튜브로 10으로 만든다. 선택적 매체에 토양 희석액을 도금하려면 멸균 점이있는 마이크로 피펫을 사용하여 마이너스 세 희석액에 10 마이크로 리터의 100 마이크로 리터를 모으고 휴믹 한천 페트리 접시에 옮깁니다.멸균, 일회용, L자형 세포 살포기를 사용하여 희석액을 접시 표면에 고르게 분배하십시오. 그런 요리를 네 개에서 다섯 개까지 준비하십시오. 마찬가지로, 리그노셀룰로오스 접시를 10에서 마이너스 세 희석 튜브로 준비하십시오.접시를 10 ~ 15 분 동안 공기 건조시킨 다음 어둠 속에서 섭씨 25도에서 15 일 동안 배양하십시오. 유사성에 대해 존재하는 모든 곰팡이 식민지를 확인하십시오. 필요한 경우 광학 현미경으로 관찰 할 슬라이드를 준비하십시오.층류 캐비닛 아래 또는 Bunsen 버너에서, 멸균 접종 바늘로 콜로니에서 균사체의 작은 부분을 부드럽게 제거하여 선택된 각 곰팡이 균주를 분리하십시오. 분리된 콜로니를 새로운 맥아 추출물 한천 또는 MEA, 디쉬로 옮긴다. 20 밀리리터의 Bushnell Haas 또는 BH 매체를 50 밀리리터 유리 바이알로 옮깁니다.7 밀리리터의 탈 이온수를 15 밀리리터 바이알로 옮기고 깨진 유리 커버 슬립 조각을 각 바이알에 넣으십시오. 바이알을 섭씨 121도에서 20분 동안 오토클레이빙하여 살균하십시오. 바셀린의 성장을 테스트하려면 층류 캐비닛 아래의 멸균 피펫을 사용하여 각 50 밀리리터 BH 바이알에 한 밀리리터의 페트롤라툼을 추가하십시오.음성 대조군으로 BH 만 함유 한 바이알을 보관하십시오. 멸균 바늘을 사용하여 선택된 곰팡이 균주로 MEA 플레이트에서 배지 표면의 균사체를 제거하고 깨진 커버 슬립이있는 15 밀리리터 유리 바이알로 옮깁니다. 바이알을 소용돌이 믹서에서 두 분 동안 교반하여 깨진 덮개가 곰팡이 식민지의 큐브를 자르고 현탁액을 만들 수있게하십시오.각 페트롤라툼 바이알에 200 마이크로리터의 현탁액을 접종하십시오. 각 곰팡이 균주에 대해 두 번의 반복실험을하십시오. 음성 대조군의 경우, 200 마이크로리터의 진균 현탁액을 BH 배지만을 함유하는 바이알에 첨가한다.또한, 배지의 오염을 확인하기 위해 곰팡이 접종없이 페트롤라툼으로 바이알을 보관하십시오. 암흑에서 섭씨 25도에서 바이알을 배양하고 접종 후 15 및 30 일 후에 관찰하십시오. 중고 엔진 오일의 성장을 테스트하려면 사용 된 엔진 오일 500 마이크로 리터를 BHA 페트리 접시에 옮기고 오일을 고르게 분배하십시오.이어서, MEA 플레이트로부터 균사체를 수집하여 진균 균주로 플레이트를 접종한다. 플라스틱의 성장을 테스트하려면 200 마이크로 리터의 곰팡이 현탁액을 96 마이크로 웰 플레이트로 옮깁니다. 곰팡이 균주 - 플라스틱 조합의 세 가지 복제물을 만드십시오.곰팡이 현탁액으로 각 웰에 10 밀리그램의 다른 플라스틱 분말을 넣으십시오. 음성 대조군의 경우, 200 마이크로리터의 BH 배지를 곰팡이 현탁액으로 웰에 첨가한다. 또한 각 플라스틱 분말에 대해 200 마이크로 리터의 BH 용액과 10 밀리그램의 각 플라스틱 먼지로 우물을 채워 오염을 검사하십시오.플레이트를 어둠 속에서 섭씨 25도에서 배양하고 15 일과 30 일 후에 관찰하십시오. 정성적 laccases 열량 측정을 위해, 감자 덱스트로스 한천 또는 PDA 한 리터를 준비하고 20 분 동안 오토클레이브하십시오. 오토클레이빙 후, 배지가 냉각되었지만 여전히 액체가 될 때, 층류 후드 아래에 400 마이크로 리터의 guaiacol을 넣고 페트리 접시에 접시에 넣습니다.PDA guaiacol 플레이트를 진균 균주로 접종하여 MEA 플레이트로부터 균사체를 수집하였다. 음성 대조군의 경우, 각 곰팡이 균주와 PDA 및 guaiacol로 하나의 플레이트로 PDA 플레이트를 준비하십시오. 어둠 속에서 섭씨 25도에서 플레이트를 배양하고 칠일 후에 관찰하십시오.정성적 에스테라제 테스트를 위해, Tween 80 배지 한 리터를 준비하십시오. 이어서, 배지를 가열하지 않고 자기 교반기 상에 놓고 배지 내부에 교반 막대를 가한다. 10 분 후, 모든 것이 녹을 때, 다섯 밀리리터의 배지를 20 밀리리터의 멸균 바이알과 오토클레이브에 옮깁니다.200 마이크로 리터의 곰팡이 현탁액을 Tween 80 중간 멸균 바이알에 넣으십시오. 음성 대조군의 경우, 오토클레이브 BH 배지 다섯 밀리리터를 20밀리리터 바이알에 넣으십시오. 그런 다음 200 마이크로 리터의 곰팡이 현탁액을 바이알에 첨가하십시오.바이알을 어둠 속에서 섭씨 25도에서 21 일 동안 배양하고 칠일마다 관찰하십시오. 바셀린에서 자랄 수있는 곰팡이 균주의 비율, 엔진 오일 및 플라스틱 분말을 다른 정도의 성공을 가진 유일한 탄소 공급원으로 사용했습니다. 페트롤라툼을 이용하는 진균의 능력은 조절된 BH와 바셀린을 함유하는 것 사이의 콜로니 성장의 차이로서 평가되었다.시험된 균주의 거의 75%가 석유를 유일한 탄소원으로 사용할 수 있었고 21%는 최대 성장을 보였다. BHA만을 함유하고 엔진 오일이 있는 상태에서 플레이트의 성장도 모니터링되었습니다. 균주의 거의 90 %가 중고 엔진 오일에서 자랐으며 39 %는 최대 성장을 보였습니다.곰팡이 식민지 주위에 적갈색 후광이 형성되면 laccases 및 기타 ligninolytic 효소의 생산량이 높아졌습니다. 곰팡이의 약 60 %가 laccase를 생산할 수있었습니다. 또한, 균주의 17 %는 guaiacol 배지의 식민지 주위에 강렬한 어두운 후광을 생성했습니다.에스테라제 활성은 Tween 80 배지에서 백색 침전물의 형성에 의해 평가되었다. 거의 60%의 균주가 에스테라제 활성을 보였고 13%는 더 높은 침전물 형성을 보였다. 이 프로토콜은 최소한의 배양 배지에 관심있는 석회화 물질을 추가하여 모든 오염 물질을 분해 할 수있는 곰팡이를 선별하도록 조정할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Protoplasts from Tissues of 14-day-old Seedlings of Arabidopsis thaliana

Isolation of Protoplasts from Tissues of 14-day-old Seedlings of Arabidopsis thaliana

14 일 된 모종의 조직에서 Protoplasts의 분리 Arabidopsis thaliana</em

Protoplasts are plant cells that have had their cell walls enzymatically removed. Isolation of protoplasts  from different plant tissues was first ...

연구

생물학

Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

형광 - 현미경 검사와 차세대 장면 : Organelle 무결성에 관련된 유전자의 식별을위한 유용한 도구

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the ...

Isolation of Native Soil Microorganisms with Potential for Breaking Down Biodegradable Plastic Mulch Films Used in Agriculture

생분해 성 플라스틱 뿌리 덮개 필름을 부셔 가능성이있는 기본 토양 미생물의 분리가 농업에 사용

Fungi native to agricultural soils that colonized commercially available biodegradable mulch (BDM) films were isolated and assessed for potential to ...

Reporter-based Growth Assay for Systematic Analysis of Protein Degradation

단백질 분해의 체계적인 분석을위한 기자 기반의 성장 분석

Protein degradation by the ubiquitin-proteasome system (UPS) is a major regulatory mechanism for protein homeostasis in all eukaryotes. The standard ...

Assays for the Degradation of Misfolded Proteins in Cells

세포의 잘못 폴딩 된 단백질의 분해에 대한 분석

Protein misfolding and aggregation are associated with various neurodegenerative diseases. Cellular mechanisms that recognize and degrade misfolded ...

Hybrid-Cut: An Improved Sectioning Method for Recalcitrant Plant Tissue Samples

하이브리드 컷 : 난 분해성 식물 조직 샘플에 대한 개선 단면 방법

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some ...

Loop-Mediated Isothermal Amplification for Screening Salmonella in Animal Food and Confirming Salmonella from Culture Isolation

Loop-Mediated Isothermal Amplification for Screening Salmonella in Animal Food and Confirming Salmonella from Culture Isolation

동물성 식품에서 살모넬라를 선별하고 문화 격리에서 살모넬라를 확인하기 위한 루프 중재 이더말 증폭

Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) has emerged as a powerful nucleic acid amplification test for the rapid detection of numerous bacterial, ...

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

진핵 세포에서 번역 단지의 신속한 생체 내 고정 및 격리

Rapid responses involving fast redistribution of messenger(m)RNA and alterations of mRNA translation are pertinent to ongoing homeostatic adjustments of ...

Isolation and Culture of Primary Oral Keratinocytes from the Adult Mouse Palate

For years, most studies involving keratinocytes have been conducted using human and mouse skin epidermal keratinocytes. Recently, oral keratinocytes have ...

Isolation and Selection of Entomopathogenic Fungi from Soil Samples and Evaluation of Fungal Virulence against Insect Pests

토양 샘플에서 내토모 병원성 곰팡이의 격리 및 선택 및 곤충 해충에 대한 곰팡이 독성의 평가

Entomopathogenic fungi (EPF) are one of the microbial control agents for integrated pest management. To control local or invasive pests, it is important ...