Name: detection of post-replicative gaps accumulation and repair in human cells using the dna fiber assay
Uploaded: 2022-02-03T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Post-Replicative Gaps Accumulation and Repair in Human Cells Using the DNA Fiber Assay at JoVE.com

يتم دعم العمل في مختبر C.F.M.M. من قبل Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP ، ساو باولو ، البرازيل ، المنح # 2019/19435-3 ، # 2013/08028-1 و 2017/05680-0) في إطار أبحاث التعاون الدولي من FAPESP والمنظمة الهولندية للبحث العلمي (NWO ، هولندا) ؛ Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, Brasília, DF, Brazil, Grants # 308868/2018-8] و Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal do Ensino Superior (CAPES, Brasília, DF, Brazil, Financial Code 001).

نظرا لأن الدراسة تستخدم خلايا بشرية ، فقد تمت الموافقة على العمل من قبل لجنة الأخلاقيات التابعة لمعهد العلوم الطبية الحيوية في جامعة ساو باولو (ICB-USP ، رقم الموافقة #48347515.3.00005467) للبحث مع عينات بشرية.
ملاحظة: تم استخدام البروتوكولات الموضحة هنا في المنشورات السابقة مع تعديلات ...

<ol>
	<li>Rupp, W. D., Howard-Flanders, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discontinuities+in+the+DNA+synthesized+in+an+excision-defective+strain+of+Escherichia+coli+following+ultraviolet+irradiation.">Discontinuities in the DNA synthesized in an excision-defective strain of Escherichia coli following ultraviolet irradiation.</a> Journal of Molecular Biology. 31 (2), 291-304 (1968).</li><li>Meneghini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gaps+in+DNA+synthesized+by+ultraviolet+light-irradiated+WI38+human+cells.">Gaps in DNA synthesized by ultraviolet light-irradiated WI38 human cells.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 425 (4), 419-427 (1976).</li><li>Meneghini, R., Cordeiro-Stone, M., Schumacher, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+and+frequency+of+gaps+in+newly+synthesized+DNA+of+xeroderma+pigmentosum+human+cells+irradiated+with+ultraviolet+light.">Size and frequency of gaps in newly synthesized DNA of xeroderma pigmentosum human cells irradiated with ultraviolet light.</a> Biophysical Journal. 33 (1), 81-92 (1981).</li><li>Lopes, M., Foiani, M., Sogo, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+mechanisms+control+chromosome+integrity+after+replication+fork+uncoupling+and+restart+at+irreparable+UV+lesions.">Multiple mechanisms control chromosome integrity after replication fork uncoupling and restart at irreparable UV lesions.</a> Molecular Cell. 21 (1), 15-27 (2006).</li><li>Heller, R. C., Marians, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+fork+reactivation+downstream+of+a+blocked+nascent+leading+strand.">Replication fork reactivation downstream of a blocked nascent leading strand.</a> Nature. 439 (7076), 557-562 (2006).</li><li>Bianchi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PrimPol+bypasses+UV+photoproducts+during+eukaryotic+chromosomal+DNA+replication.">PrimPol bypasses UV photoproducts during eukaryotic chromosomal DNA replication.</a> Molecular Cell. 52 (4), 566-573 (2013).</li><li>Garc&#237;a-G&#243;mez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PrimPol,+an+archaic+primase/polymerase+operating+in+human+cells.">PrimPol, an archaic primase/polymerase operating in human cells.</a> Molecular Cell. 52 (4), 541-553 (2013).</li><li>Mour&#243;n, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repriming+of+DNA+synthesis+at+stalled+replication+forks+by+human+PrimPol.">Repriming of DNA synthesis at stalled replication forks by human PrimPol.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 20 (12), 1383-1389 (2013).</li><li>Wan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hPrimpol1/CCDC111+is+a+human+DNA+primase-polymerase+required+for+the+maintenance+of+genome+integrity.">hPrimpol1/CCDC111 is a human DNA primase-polymerase required for the maintenance of genome integrity.</a> EMBO Reports. 14 (12), 1104-1112 (2013).</li><li>Keen, B. A., Jozwiakowski, S. K., Bailey, L. J., Bianchi, J., Doherty, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+dissection+of+the+domain+architecture+and+catalytic+activities+of+human+PrimPol.">Molecular dissection of the domain architecture and catalytic activities of human PrimPol.</a> Nucleic Acids Research. 42 (9), 5830-5845 (2014).</li><li>Tirman, S., Cybulla, E., Quinet, A., Meroni, A., Vindigni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRIMPOL+ready,+set,+reprime.">PRIMPOL ready, set, reprime.</a> Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 56 (1), 17-30 (2021).</li><li>Quinet, A., Lerner, L. K., Martins, D. J., Menck, C. F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filling+gaps+in+translesion+DNA+synthesis+in+human+cells.">Filling gaps in translesion DNA synthesis in human cells.</a> Mutation Research, Genetic Toxicology Environmental Mutagenesis. 836, 127-142 (2018).</li><li>Ziv, O., Diamant, N., Shachar, S., Hendel, A., Livneh, Z., Bjergb&#230;k, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+measurement+of+translesion+DNA+synthesis+in+mammalian+cells.">Quantitative measurement of translesion DNA synthesis in mammalian cells.</a> DNA Repair Protocols. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). 920, (2012).</li><li>Quinet, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translesion+synthesis+mechanisms+depend+on+the+nature+of+DNA+damage+in+UV-irradiated+human+cells.">Translesion synthesis mechanisms depend on the nature of DNA damage in UV-irradiated human cells.</a> Nucleic Acids Research. 44 (12), 5717-5731 (2016).</li><li>T&#233;cher, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+dynamics:+biases+and+robustness+of+DNA+fiber+analysis.">Replication dynamics: biases and robustness of DNA fiber analysis.</a> Journal of Molecular Biology. 425 (23), 4845-4855 (2013).</li><li>Quinet, A., Carvajal-Maldonado, D., Lemacon, D., Vindigni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+fiber+analysis:+Mind+the+gap.">DNA fiber analysis: Mind the gap.</a> Methods in Enzymology. 591, 55-82 (2017).</li><li>Elvers, I., Johansson, F., Groth, P., Erixon, K., Helleday, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UV+stalled+replication+forks+restart+by+re-priming+in+human+fibroblasts.">UV stalled replication forks restart by re-priming in human fibroblasts.</a> Nucleic Acids Research. 39 (16), 7049-7057 (2011).</li><li>Diamant, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+bypass+operates+in+the+S+and+G2+phases+of+the+cell+cycle+and+exhibits+differential+mutagenicity.">DNA damage bypass operates in the S and G2 phases of the cell cycle and exhibits differential mutagenicity.</a> Nucleic Acids Research. 40 (1), 170-180 (2012).</li><li>Temviriyanukul, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporally+distinct+translesion+synthesis+pathways+for+ultraviolet+light-induced+photoproducts+in+the+mammalian+genome.">Temporally distinct translesion synthesis pathways for ultraviolet light-induced photoproducts in the mammalian genome.</a> DNA Repair. 11 (6), 550-558 (2012).</li><li>Jansen, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redundancy+of+mammalian+Y+family+DNA+polymerases+in+cellular+responses+to+genomic+DNA+lesions+induced+by+ultraviolet+light.">Redundancy of mammalian Y family DNA polymerases in cellular responses to genomic DNA lesions induced by ultraviolet light.</a> Nucleic Acids Research. 42 (17), 11071 (2014).</li><li>Quinet, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap-filling+and+bypass+at+the+replication+fork+are+both+active+mechanisms+for+tolerance+of+low-dose+ultraviolet-induced+DNA+damage+in+the+human+genome.">Gap-filling and bypass at the replication fork are both active mechanisms for tolerance of low-dose ultraviolet-induced DNA damage in the human genome.</a> DNA Repair. 14 (1), 27-38 (2014).</li><li>Callegari, A. J., Clark, E., Pneuman, A., Kelly, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postreplication+gaps+at+UV+lesions+are+signals+for+checkpoint+activation.">Postreplication gaps at UV lesions are signals for checkpoint activation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (18), 8219-8224 (2010).</li><li>Vogt, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+further+properties+of+single-strand-specific+nuclease+from+Aspergillus+oryzae.">Purification and further properties of single-strand-specific nuclease from Aspergillus oryzae.</a> European Journal of Biochemistry. 33 (1), 192-200 (1973).</li><li>Cordeiro-Stone, M., Schumacher, R. I., Meneghini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+replication+fork+in+ultraviolet+light-irradiated+human+cells.">Structure of the replication fork in ultraviolet light-irradiated human cells.</a> Biophysical Journal. 27 (2), 287-300 (1979).</li><li>Lehmann, A. R., Fuchs, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gaps+and+forks+in+DNA+replication:+Rediscovering+old+models.">Gaps and forks in DNA replication: Rediscovering old models.</a> DNA Repair (Amst). 5 (12), 1495-1498 (2006).</li><li>Daigaku, Y., Davies, A. A., Ulrich, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin-dependent+DNA+damage+bypass+is+separable+from+genome+replication.">Ubiquitin-dependent DNA damage bypass is separable from genome replication.</a> Nature. 465 (7300), 951-955 (2010).</li><li>Karras, G. I., Jentsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RAD6+DNA+damage+tolerance+pathway+operates+uncoupled+from+the+replication+fork+and+is+functional+beyond+S+phase.">The RAD6 DNA damage tolerance pathway operates uncoupled from the replication fork and is functional beyond S phase.</a> Cell. 141 (2), 255-267 (2010).</li><li>Tirman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporally+distinct+post-replicative+repair+mechanisms+fill+PRIMPOL-dependent+ssDNA+gaps+in+human+cells.">Temporally distinct post-replicative repair mechanisms fill PRIMPOL-dependent ssDNA gaps in human cells.</a> Molecular Cell. 81 (19), 4026-4040 (2021).</li><li>Cong, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+gaps+are+a+key+determinant+of+PARP+inhibitor+synthetic+lethality+with+BRCA+deficiency.">Replication gaps are a key determinant of PARP inhibitor synthetic lethality with BRCA deficiency.</a> Molecular Cell. 81 (15), 3128-3144 (2021).</li><li>Quinet, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRIMPOL-mediated+adaptive+response+suppresses+replication+fork+reversal+in+BRCA-deficient+cells.">PRIMPOL-mediated adaptive response suppresses replication fork reversal in BRCA-deficient cells.</a> Molecular Cell. 77 (3), 461-474 (2020).</li><li>Jackson, D. A., Pombo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replicon+clusters+are+stable+units+of+chromosome+structure:+evidence+that+nuclear+organization+contributes+to+the+efficient+activation+and+propagation+of+S+phase+in+human+cells.">Replicon clusters are stable units of chromosome structure: evidence that nuclear organization contributes to the efficient activation and propagation of S phase in human cells.</a> The Journal of Cell Biology. 140 (6), 1285-1295 (1998).</li><li>Schwab, R. A., Niedzwiedz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+DNA+replication+in+the+vertebrate+model+system+DT40+using+the+DNA+fiber+technique.">Visualization of DNA replication in the vertebrate model system DT40 using the DNA fiber technique.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (56), e3255 (2011).</li><li>Simoneau, A., Xiong, R., Zou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+trans+cell+cycle+effects+of+PARP+inhibitors+underlie+their+selectivity+toward+BRCA1/2-deficient+cells.">The trans cell cycle effects of PARP inhibitors underlie their selectivity toward BRCA1/2-deficient cells.</a> Genes &amp; Development. 35 (17-18), 1271-1289 (2021).</li><li>Taglialatela, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=REV1-Pol&#950;+maintains+the+viability+of+homologous+recombination-deficient+cancer+cells+through+mutagenic+repair+of+PRIMPOL-dependent+ssDNA+gaps.">REV1-Pol&#950; maintains the viability of homologous recombination-deficient cancer cells through mutagenic repair of PRIMPOL-dependent ssDNA gaps.</a> Molecular Cell. 81 (19), 4008-4025 (2021).</li><li>Lim, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=USP1+Is+required+for+replication+fork+protection+in+BRCA1-deficient+tumors.">USP1 Is required for replication fork protection in BRCA1-deficient tumors.</a> Molecular Cell. 72 (6), 925-941 (2018).</li><li>Peng, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposing+roles+of+FANCJ+and+HLTF+protect+forks+and+restrain+replication+during+stress.">Opposing roles of FANCJ and HLTF protect forks and restrain replication during stress.</a> Cell Reports. 24 (12), 3251-3261 (2018).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA+translocase+FANCM/MHF+promotes+replication+traverse+of+DNA+interstrand+crosslinks.">The DNA translocase FANCM/MHF promotes replication traverse of DNA interstrand crosslinks.</a> Molecular Cell. 52 (3), 434-446 (2013).</li><li>Ding, W., Bishop, M. E., Lyn-Cook, L. E., Davis, K. J., Manjanatha, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+alkaline+comet+assay+and+enzyme-modified+alkaline+comet+assay+for+measuring+DNA+strand+breaks+and+oxidative+DNA+damage+in+rat+liver.">In vivo alkaline comet assay and enzyme-modified alkaline comet assay for measuring DNA strand breaks and oxidative DNA damage in rat liver.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (111), e53833 (2016).</li><li>Lu, Y., Liu, Y., Yang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+in+vitro+DNA+damage+using+comet+assay.">Evaluating in vitro DNA damage using comet assay.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (128), e56450 (2017).</li></ol>

نوقشت الخطوات الحاسمة لبروتوكول فحص ألياف الحمض النووي القياسي في منشور سابق32. هنا ، نصف الإصدارات المعدلة من فحص ألياف الحمض النووي القياسي للتحقيق في وجود فجوات ssDNA بعد النسخ المتماثل وكذلك إصلاحها عن طريق ملء الفجوات ، الموصوفة في البداية في14. في سياق وجود فجو...

قدمت الأعمال المنوية دليلا على تراكم الفجوات الأحادية التي تقطعت بها السبل (ssDNA) بعد النسخ المتماثل عند العلاج بعوامل ضارة بالحمض النووي في البكتيريا1 والخلايا البشرية 2,3. أثناء تكرار قوالب الحمض النووي التالفة ، قد تتجاوز آلية تخليق الحمض النووي الآفات عن طريق استخدام بوليميراز الحمض النووي التخليقي الانتقالي المحدد أو من خلال آليات تبديل القوالب. بدلا من ذلك ، قد يتخطى المضاد ببساطة الآفة تاركا فجوة ssDNA وراءه ، ليتم إصلاحها لاحقا. في الآونة الأخيرة ، أظهرت دراسة بوضوح أن العلاج بالعوامل السامة للوراثة يؤدي إلى فجوات ssDNA في حقيقيات النوى من خلال استخدام المجهر الإلكتروني لتصور البنية المحددة لوسيطات النسخ المتماثل4. اقترح في البداية أن يكون تشكيل هذه المناطق من الفجوات اللاحقة للتكرار نتيجة بسيطة للوضع شبه المتقطع لتكرار الحمض النووي2. في هذه الحالة ، يمكن للآفة الموجودة على الخيط المتخلف أن تمنع استطالة جزء Okazaki ، ولكن يتم إنقاذ تطور الشوكة بشكل طبيعي بواسطة جزء Okazaki التالي ، تاركا وراءه فجوة ssDNA. ومع ذلك ، أظهرت المزيد من الدراسات أن تكوين فجوات على الشريط الرئيسي ممكن أيضا ، كما هو موضح لأول مرة في البكتيريا5. في حقيقيات النوى ، تبين أن PRIMPOL ، وهو بوليميراز فريد من نوعه للحمض النووي مع نشاط بريماز ، قادر على إعادة تشغيل تخليق الحمض النووي في اتجاه مجرى النهر ، وهو آفة تمنع التكرار من خلال نشاط التوبيخ6،7،8،9،10،11. وبالتالي ، فإن نشاط بريماز PRIMPOL قد يفسر تكوين فجوات ssDNA بعد النسخ المتماثل في الشريط الرئيسي عند العلاج بعامل ضار بالحمض النووي في الخلايا البشرية12. ومع ذلك، فإن الكشف عن هذه الفجوات وكذلك إصلاح الفجوات، حتى وقت قريب، كان يتطلب نهجا غير مباشرة أو مستهلكة للوقت مثل المجهر الإلكتروني4 أو المقايسات القائمة على البلازميد13. كان استخدام نوكليز S1 الخاص ب ssDNA للكشف عن الفجوات في الخلايا البشرية رائدا من خلال الدراسات المبكرة منذ أكثر من أربعين عاما ، باستخدام تقنيات تدرج السكروز 2,3. في الآونة الأخيرة ، طبقت مجموعتنا استخدام هذا النوكليز للكشف عن ssDNA في تكرار الحمض النووي (فجوات ما بعد التكرار) باستخدام طرق أخرى مثل ألياف الحمض النووي ومقايسات المذنبات14. وقد مهدت هذه النهج الجديدة الطريق أمام الطفرة الحالية في الدراسات المتعلقة بالفجوات اللاحقة للتكرار. هنا ، نصف استراتيجية لاستخدام نوكليز S1 للكشف عن فجوات ssDNA بعد النسخ المتماثل بواسطة فحص ألياف الحمض النووي ونشرح كيف يمكن لنظام وضع العلامات التفاضلية في بروتوكول ألياف الحمض النووي أن يسمح بدراسة إصلاح هذه الفجوات.
يعد فحص ألياف الحمض النووي تقنية قوية تم استخدامها من قبل عدد متزايد من المختبرات وقدمت رؤى قيمة حول ديناميكيات شوكة النسخ المتماثل وآليات الاستجابة لإجهاد النسخ المتماثل. باختصار ، تعتمد هذه التقنية على الدمج المتسلسل لنظائر النيوكليوتيدات (مثل CldU -5-chloro-2'-deoxyuridine-، و IdU -5-iodo-2'-deoxyuridine) في الحمض النووي المكرر. بعد الحصاد ، يتم تحليل الخلايا ، وتنتشر جزيئات الحمض النووي على شريحة زجاجية مغلفة إيجابيا. ثم يتم الكشف عن CldU و IdU بواسطة أجسام مضادة محددة ، والتي يمكن تصورها في المجهر الفلوري كألياف ثنائية اللون. وأخيرا ، يتم قياس أطوال مسالك IdU و CldU لتحديد أي تغييرات في ديناميكيات تكرار الحمض النووي نتيجة لتحريض تلف الحمض النووي. يمكن استخدام هذه التقنية للتحقيق في ظواهر مختلفة ، مثل توقف الشوكة ، وتباطؤ الشوكة ، وتدهور الحمض النووي الوليد ، والاختلافات في تواتر إطلاق النار الأصلي15,16.
أحد القيود المفروضة على فحص ألياف الحمض النووي هو دقته لبضعة كيلوجرامات. نظرا لأن فجوات ssDNA بعد النسخ المتماثل يمكن أن تكون في نطاق مئات القواعد ، فمن المستحيل تصور هذه الفجوات مباشرة بواسطة بروتوكول ألياف الحمض النووي القياسي. وجود فجوات ssDNA على تكرار الحمض النووي في الخلايا البشرية المعالجة بالعوامل السامة للوراثة كان متورطا بشكل غير مباشر من قبل. على سبيل المثال ، ملاحظة ssDNA كما تم تقييمها من خلال توظيف البروتين المرتبط ب ssDNA ، أو بروتين النسخ المتماثل A (RPA) ، في الخلايا خارج المرحلة S ، أو تكوين ssDNA كما تم اكتشافه بواسطة فك الحمض النووي القلوي جنبا إلى جنب مع عدم وجود توقف شوكة مطول بواسطة فحص ألياف الحمض النووي 12,17,18,19,20,21 يعزى إلى تراكم فجوات الحمض النووي المتنقلة (ssDNA). بالإضافة إلى ذلك ، فإن فجوات ssDNA بعد النسخ المتماثل تحفز نقطة تفتيش مرحلة G2 / M تعتمد على ATR وتوقف الخلايا المعالجة بسموم النسخ المتماثل18،19،20،21،22.
تحلل نوكلياز S1 الأحماض النووية أحادية الخيط التي تطلق 5 '-phosphoryl mono- أو oligonucleotides ولها تقارب أعلى 5 مرات مع ssDNA مقارنة بالحمض النووي الريبي. الأحماض النووية المزدوجة (DNA:DNA، DNA:RNA، أو RNA:RNA) مقاومة للنوكليز S1 إلا عند استخدامها بتركيزات عالية للغاية. كما يشق نوكليز S1 الحمض النووي المزدوج في المنطقة الواحدة التي تقطعت بها السبل بسبب أو فجوة أو عدم تطابق أو حلقة. وبالتالي فإن نوكليز S1 هو إندونوكليز خاص ب ssDNA قادر على شق فجوات ssDNA ، مما يؤدي في النهاية إلى توليد فواصل مزدوجة تقطعت بها السبل23,24. وبالتالي ، فإن إضافة خطوات لهضم نوكلياز S1 إلى بروتوكول ألياف الحمض النووي بشكل غير مباشر يمكن من اكتشاف فجوات ssDNA بعد التكرار. في وجود ثغرات ، فإن معالجة النوى المكشوفة باستخدام نوكليز S1 قبل انتشار الحمض النووي ستولد مساحات أقصر نتيجة لانقسام S1 في ssDNA الموجود بطبيعته في الفجوات14. وفقا لذلك ، فإن تقصير المسالك هو القراءة لفجوات ssDNA باستخدام هذا النهج. بالمقارنة مع بروتوكول ألياف الحمض النووي القياسي ، فإن ألياف الحمض النووي مع نوكلياز S1 تتطلب فقط خطوتين إضافيتين: التعرض للنوى (نفاذية الخلية) والعلاج باستخدام نوكلياز S1. ومن المهم ملاحظة أن الضوابط المناسبة إلزامية، مثل العينات المعالجة بالعامل السام الوراثي ولكن بدون نوكليز S1 والعينات المعالجة بنوكليز S1 بدون العامل السام الوراثي. يمكن تنفيذ البروتوكول نفسه ، بما في ذلك دمج النظير ، ومعالجة S1 ، والانتشار ، في يوم واحد ولا يتطلب مواد استثنائية. لا يتطلب سوى نظائر الثيميدين ، ونوكليز S1 المنقى ، والأجسام المضادة الأولية والثانوية المناسبة ، والمجهر الفلوري. بشكل عام ، تكتشف ألياف الحمض النووي التي تستخدم نوكلياز S1 فجوات ssDNA على شوكات النسخ المتماثل المستمرة باستخدام نهج بسيط نسبيا.
يمكن إصلاح (أو ملء) فجوات الحمض النووي عبر الحمض النووي المتماثل التي تشكلت نتيجة لآليات الاستجابة لإجهاد النسخ المتماثل بواسطة آليات مختلفة، بما في ذلك تخليق الحمض النووي العابر للآفة أو تبديل القالب، في عملية تسمى سد الفجوة أو إصلاح ما بعد النسخ المتماثل (PRR)25. تحدث هذه العمليات خلف الشوكات المتقدمة ، والتي تنطوي على تخليق الحمض النووي المستقل عن النسخ المتماثل14،26،27. بناء على هذه النتائج ، يمكن إجراء مخطط وضع العلامات المختلف عن فحص ألياف الحمض النووي القياسي لتصور أحداث سد الفجوات في مرحلة G2 مباشرة14،16،26،28. على وجه التحديد ، يمكن استخدام تناظرية ثيميدين واحدة لتسمية شوكة النسخ المتماثل في وقت العلاج السام وراثيا وتشكيل فجوة ssDNA بعد النسخ المتماثل ، في حين يمكن استخدام تناظرية ثيميدين أخرى لتسمية أحداث ملء الفجوة. في هذا البروتوكول ، يتم تصنيف الخلايا بأول تناظرية ثيميدين (IdU ، على سبيل المثال) مباشرة بعد أو بالتزامن مع العلاج السام الوراثي لمدة 1 ساعة ، بحيث يتم تسمية الحمض النووي الوليد في وقت تكوين الفجوة. يضاف نوكودازول عند العلاج لمدة تتراوح بين 12-24 ساعة لاعتقال الخلايا في G2 / M ، مما يمنع المرحلة S التالية. بالنسبة لآخر 4 ساعات من علاج نوكودازول ، تتم إضافة تناظرية ثيميدين ثانية (CldU ، على سبيل المثال) إلى الوسائط التي سيتم دمجها أثناء ملء الفجوة. الأهم من ذلك ، لا يمكن استخدام هذا الفحص إلا للكشف عن أحداث ملء الفجوة في G2 لأنه لا يمكن تمييز إشارة ملء الفجوة من CldU عن إشارة بسبب دمج CldU في تكرار الحمض النووي في مرحلة S. لذلك ، لتقليل إشارة الخلفية ، يجب أن يتزامن توقيت دمج CldU بعد تحريض الضرر مع الوقت الذي يدخل فيه معظم سكان الخلايا المرحلةG2 14. لذلك ، سيختلف هذا التوقيت اعتمادا على خط الخلية وظروف العلاج. ينصح بتحسين تقدم دورة الخلية قبل استخدام هذا الفحص. يسمح التلطيخ المشترك لهذه النظائر الثيميدين بتصور مسالك ملء الفجوات (PRR) (بقع CldU) فوق الحمض النووي الوليد (IdU tracts) الذي تم تصنيعه أثناء العلاج السام للوراثة عندما تم إنشاء فجوات ssDNA.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid, Glacial</td>
			<td>Synth</td>
			<td>64-19-7</td>
			<td>Alternatively, BSA - Biosera - REF PM-T1725/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium hydroxide</td>
			<td>Synth</td>
			<td>1336-21-6</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody anti-mouse IgG1 Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11005</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody anti-rat Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21470</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody Mouse anti-BrdU</td>
			<td>Becton Disckson</td>
			<td>347580</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody Rat anti-BrdU</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>&#160;Ab6326</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological security hood</td>
			<td>Pachane</td>
			<td>PA 410</td>
			<td>Use hood present in the laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (Bovine Serum Albumin)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3294</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>179693</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CldU</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>C6891</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cloridric acid</td>
			<td>Synth</td>
			<td>7647-01-0</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Zeiss LSM Series (7, 8 or 9)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass (or coverslips)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>152460</td>
			<td>Alternatively, Olen - Kasvi Cover Glass (24 x 60 mm) - K5-2460</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM - High Glucose</td>
			<td>LGC/Gibco</td>
			<td>BR30211-05/12100046</td>
			<td>Use culture media specific for the cell line used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E5314</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence Microscope Axiovert 200</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12657-029</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forma Series II Water Jacketed CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific 3110</td>
			<td>13-998-074</td>
			<td>Use cell incubator present in the laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide jar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5516</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Idu</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>I7125</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Synth</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>67-56-1</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Denville</td>
			<td>M1021</td>
			<td>Alternatively, Olen - Kasvi Microscope Slides - K5-7105 OR Precision Glass Line - 7105-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS (&#193;cido 3-morfolinopropano 1-sulf&#244;nico)</td>
			<td>Synth</td>
			<td>1132-61-2</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nocodazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31430-18-9</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate Buffer Saline)</td>
			<td>Life Thechnologies</td>
			<td>3002</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold AntiFade Mountant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36930</td>
			<td>Any antifade moutant solution for immunofluorescence could be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S1 nuclease purified from Aspergillus oryzae</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18001-016</td>
			<td>Pre-dilute the S1 nuclease (1/100 - 1/200) in S1 nuclease dilution buffer provided by the manufacturer, aliquote and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0302</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate Trihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>6131-90-4</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Synth</td>
			<td>&#160;7647-14-5</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>57-50-1</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>West Lab Research</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Synth</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200072</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UVC Lamp</td>
			<td>Non Specific</td>
			<td>-</td>
			<td>Essential: emission lenght of 254 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VLX-3W UV Radiometer</td>
			<td>Vilber Loumart</td>
			<td>-</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>557-34-6</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of post-replicative gaps accumulation and repair in human cells using the dna fiber assay

فحص ألياف الحمض النووي هو طريقة بسيطة وقوية لتحليل ديناميكيات شوكة النسخ المتماثل ، استنادا إلى الكشف المناعي لنظائر النيوكليوتيدات التي يتم دمجها أثناء تخليق الحمض النووي في الخلايا البشرية. ومع ذلك ، فإن هذه التقنية لها دقة محدودة تبلغ بضعة آلاف من الكيلوجرامات. وبالتالي ، فإن فجوات الحمض النووي المفردة بعد النسخ المتماثل (ssDNA) التي لا يمكن اكتشافها بواسطة الفحص القياسي. هنا ، نصف نسخة معدلة من فحص ألياف الحمض النووي الذي يستخدم نوكلياز S1 ، وهو إنزيم يشق ssDNA على وجه التحديد. في وجود فجوات ssDNA بعد النسخ المتماثل ، سيستهدف نوكليز S1 الفجوات ويشقها ، مما يولد مساحات أقصر يمكن استخدامها كقراءة لفجوات ssDNA على الشوكات المستمرة. تتشكل فجوات ssDNA بعد النسخ المتماثل عندما يتم تكرار الحمض النووي التالف بشكل متقطع. يمكن إصلاحها عبر آليات غير مقترنة من تكرار الجينوم ، في عملية تعرف باسم سد الفجوة أو إصلاح ما بعد التكرار. نظرا لأن آليات سد الفجوات تنطوي على تخليق الحمض النووي بشكل مستقل عن المرحلة S ، يمكن أيضا استخدام التعديلات في مخطط وضع العلامات على ألياف الحمض النووي لمراقبة أحداث سد الفجوات. إجمالا، هذه التعديلات على فحص ألياف الحمض النووي هي استراتيجيات قوية لفهم كيفية تشكيل الفجوات اللاحقة للتكرار وملئها في جينوم الخلايا البشرية.

في فحص الألياف S1 ، إذا أدى العلاج بعامل سام وراثيا إلى فجوات ssDNA بعد التكرار ، فإن الأطوال الإجمالية لألياف الحمض النووي من النوى المعالجة ب S1 ستكون أقصر عند العلاج بتلف الحمض النووي مقارنة بالعينات غير المعالجة وكذلك العينات التي عولجت بالعامل السام الوراثي ولكن لم يتم تقديمها إلى الانقس...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Post-Replicative Gaps Accumulation and Repair in Human Cells Using the DNA Fiber Assay at JoVE.com

Detection of Post-Replicative Gaps Accumulation and Repair in Human Cells Using the DNA Fiber Assay

هنا نصف تعديلين لفحص ألياف الحمض النووي للتحقيق في فجوات الحمض النووي المفردة في تكرار الحمض النووي بعد تحريض الآفة. يتيح فحص الألياف S1 الكشف عن الفجوات اللاحقة للتكرار باستخدام endonuclease S1 الخاص ب ssDNA ، في حين يسمح فحص ملء الفجوات بالتصور وتحديد كمية إصلاح الفجوة.

الكشف عن تراكم الفجوات بعد التكرار وإصلاحها في الخلايا البشرية باستخدام فحص ألياف الحمض النووي

The DNA fiber assay is a simple and robust method for the analysis of replication fork dynamics, based on the immunodetection of nucleotide analogs that ...

يفتح بروتوكولنا إمكانيات جديدة للتحقيق في كيفية حدوث النسخ المتماثل على الحمض النووي التالف. يمكن للتقنيات الكشف عن تكوين وإصلاح فجوات الحمض النووي المفردة ، مقابل آفة الحمض النووي. يشق نوكلياز S1 الحمض النووي الأحادي الخيط ويسمح باكتشاف الفجوات اللاحقة للتكرار.تم استخدام هذا النهج لأول مرة من قبل Dr.Meneghini و Dr.Cordiero-Stone في 1970s في البرازيل ، وتم تكييفه مؤخرا من قبلنا لفحص ألياف الحمض النووي. إن استخدام التقنية الموصوفة هنا لدراسة تكوين وإصلاح الفجوات اللاحقة للتكرار يمكن أن يوفر رؤى ثاقبة حول آلية إصلاح الحمض النووي واستجابة الإجهاد المتماثل التي تحافظ على سلامة الجينوم. بالنسبة لكلا البروتوكولين الموصوفين هنا ، ألياف S1 وفحوصات سد الفجوات ، من الأهمية بمكان تضمين جميع عناصر التحكم لضمان التفسير الدقيق للبيانات.سيتم عرض الإجراء من قبل Davi J.Martins ، طالب الدكتوراه من مختبرنا ، والدكتورة Annabel Quinet ، وهي متعاونة طورت سابقا هذه التقنيات عند العمل في مجموعتنا. بادئ ذي بدء ، قم بشفط وسائط الثقافة وأضف على الفور وسائط الثقافة مع 20 ميكرومولار من وسائط IDU إلى الخلايا. احتضن الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 20 دقيقة بالضبط.ثم ، اغسل الخلايا بسرعة باستخدام PBS المسخن مسبقا مرتين وقم بتشعيعها ب 20 جول لكل متر مربع UV-C. استخدم الخلايا غير المعالجة كعناصر تحكم. أضف على الفور الوسائط التي تحتوي على 200 ميكرومولار CldU إلى الخلايا واحتضنها عند 37 درجة مئوية و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون لمدة 60 دقيقة على وجه التحديد.بعد ذلك ، اغسل الخلايا باستخدام PBS المسخن مسبقا مرتين وتغلغل فيها باستخدام المخزن المؤقت CSK 100 لمدة دقيقتين إلى 10 دقائق وفقا لخط الخلية في درجة حرارة الغرفة. بعد نفاذية CSK ، يمكن رؤية النوى التي لا تحتوي على أي سيتوبلازم تقريبا مقارنة بتلك التي كانت قبل النفاذية. صب PBS بعناية أسفل جانب كل بئر لغسل النوى مع PBS.ثم اغسل النوى باستخدام المخزن المؤقت S1. احتضان النوى في المخزن المؤقت S1 مع 20 وحدة لكل ملليلتر S1 nuclease ، وبدون نوكليز S1 ، لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، قم بشفط المخزن المؤقت S1 وأضف 0.1٪ BSA في PBS.كشط النوى ونقلها إلى أنبوب مشروح تقريبا 1.5 ملليلتر. حافظ على الأنابيب على الجليد طوال الوقت. الطرد المركزي للنوى في حوالي 4،600 مرة G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية.أعد تعليق الكريات في PBS بتركيز حوالي 1،500 خلية لكل ميكرولتر. ضع الأنابيب على الجليد وانتقل على الفور إلى إعداد ألياف الحمض النووي عن طريق نشر البروتوكول. قم بتعليق شرائح المجهر بقلم رصاص كربوني وضعها مسطحة على صينية.اضغط على الجزء السفلي من الأنبوب لضمان التجانس وإضافة ميكرولترين من الخلايا في الجزء العلوي من الشريحة المقابلة. أضف ستة ميكرولترات من مخزن التحلل العازل وقم بتحليل الخلايا عن طريق السحب لأعلى ولأسفل حوالي خمس مرات. استخدم طرف الماصة لسحب القطرة قليلا نحو أسفل الشريحة واحتضانها لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة لتحليل النوى.قم بإمالة الشريحة عند حوالي 20 إلى 40 درجة واسمح للانخفاض بالانتشار إلى أسفل الشريحة بسرعة منخفضة ثابتة. اترك الشريحة لتجف في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 10 إلى 15 دقيقة. ثم اغمرها في جرة تحتوي على محلول التثبيت الطازج واحتضانها لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة لتثبيت الحمض النووي على الشرائح.اغسل الشرائح باستخدام PBS مرتين لمدة خمس دقائق وقم بتشويه الحمض النووي باستخدام حمض كلوريدريك 2.5 من الأضراس الطازج لمدة 40 إلى 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. اغسل الشرائح باستخدام PBS ثلاث مرات لمدة خمس دقائق وقم بحظرها بنسبة 5٪ BSA التي تم تسخينها مسبقا لمدة 30 إلى 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية. اضغط برفق على الورق لإزالة السائل الزائد من الشرائح.أضف 30 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية إلى الشرائح بقطرة وضع شريحة غطاء في الأعلى. احتضان لمدة 1 إلى 1.5 ساعة في درجة حرارة الغرفة في غرفة مظلمة ورطبة. ضع الشرائح في وعاء مع PBS لمدة دقيقة إلى دقيقتين ثم قم بإزالة زلات الغطاء بعناية.اغسل PBST في جرة ثلاث مرات لمدة خمس دقائق وضع الشرائح في PBS. قم بإزالة السائل الزائد عن طريق النقر بلطف على ورقة وإضافة 30 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية إلى الشرائح بقطرة. ضع شريحة غطاء في الأعلى.احتضان لمدة 45 إلى 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في غرفة مظلمة ورطبة. كرر خطوات غسل الشرائح وإزالة PBS الزائدة مرة أخرى وإضافة 20 ميكرولتر من كاشف التركيب إلى الشرائح. ضع غطاء في الأعلى وتجنب الفقاعات.ضع قطرة من زيت الغمر بالقرب من الجزء العلوي من الشريحة حيث تم تحليل الخلايا. استخدم القناة الخضراء وابحث عن النقاط الخضراء في الخلفية للعثور على التركيز. افتح برنامج Leica Application Suite ، وانقر فوق اكتساب ، وحدد القناة الخضراء.اضبط إعدادات القناة الخضراء قبل التحليل. بعد ذلك ، قم بالتغيير إلى القناة الحمراء واضبط الإعدادات. ابحث عن التركيز الرئيسي للألياف وانتقل إلى الحواف للعثور على الألياف الفردية المنتشرة جيدا وغير المتداخلة.استخدم قناة واحدة فقط لتحديد المناطق للصور وتجنب التحيز المحتمل. انقر على أيقونة الحصول على تراكب واضبط البرنامج لتكبير المجهر الصحيح. التقط حوالي 15 إلى 20 صورة لكل شريحة إلى جانب الشريحة بأكملها في القناة الخضراء ثم في القناة الحمراء.يتم الآن دمج القناتين ويتم نقل التراكب الذي تم إنشاؤه إلى مجلد فريد. من الممكن رؤية الألياف ذات الألوان الحمراء والخضراء. افتح برنامج ImageJ ، وانقر بزر الماوس الأيسر على الرمز الخامس ، وحدد الخيار الثاني ، ثم حدد أداة الخط المجزأ.انقر بزر الماوس الأيسر لرسم المسار الدقيق للمسار الأحمر أو الأخضر وانقر بزر الماوس الأيمن لإيقاف الرسم. اضغط على الزر M على لوحة المفاتيح لقياس الطول. بالنسبة لألياف S1 ، تتبع قياسات المسالك الحمراء والخضراء لكل ألياف وقم بقياس أطوال المسالك الحمراء والخضراء من 150 ليفا على الأقل من صور مختلفة.تظهر ألياف S1 في هذه الصور التمثيلية. يظهر هنا مسار الحمض النووي الناشئ المتحكم فيه بدون الفجوات والمنيع للانقسام بواسطة نوكليز S1. أدى مسار الحمض النووي الإيجابي للفجوات المشقوقة بواسطة نوكليز S1 إلى طول مسار CldU أقصر.يمكن تنفيذ مخطط وضع العلامات التفاضلية الموصوف على نطاق واسع في مخطوطة النص لتسمية أحداث ملء الفجوات. في هذا الفحص ، المسمى فحص ملء الفجوات ، تتوافق مسارات IDU الأطول مع تصحيح CldU واحد على الأقل أو عدد أقل من بقع CldU مع كثافة منخفضة لملء الفجوة. وتتوافق مساحات IDU الأقصر ، مع رقعة CldU واحدة على الأقل ، ومساحات IDU الأطول مع المزيد من بقع CldU ، مع كثافة عالية لملء الفجوة.تعد خطوة النفاذية لهذا البروتوكول أمرا بالغ الأهمية بالنسبة لنوكليز S1 للعمل على الفجوات التي تشكلت أثناء تكرار الحمض النووي التالف. يمكن أيضا استخدام نوكليز S1 في بروتوكول فحص المذنب للكشف عن الفجوات التي تشكلت أثناء تكرار الحمض النووي التالف الذي يستمر بعد العلاج. مهد فحص الألياف S1 الطريق للنموذج الجديد الذي يمكن أن تسبب الفجوات اللاحقة للتكرار قابلية الإصابة بالسرطان ، خاصة في سرطانات الثدي والمبيض التي تحمل طفرات في جينات BRCA1 و 2.

Research

JoVE Journal

Genetics

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

الكشف عن نسخة عدد التعديلات عن طريق التسلسل خلية واحدة

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Atomic Force Microscopy Investigations of DNA Lesion Recognition in Nucleotide Excision Repair

القوة الذرية المجهري التحقيقات من الحمض النووي الآفة الاعتراف في إصلاح ختان النوكليوتيدات

AFM imaging is a powerful technique for the study of protein-DNA interactions. This single molecule method allows the simultaneous resolution of different ...

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

إيمونوستينينج لإدخال تعديلات على الحمض النووي: التحليل الحسابي للصور [كنفوكل]

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

تعطيل الجينات ذات كفاءة عالية من الخلايا السلف مورين والبشرية المكونة للدم قبل كريسبر/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

A Simple, Rapid, and Quantitative Assay to Measure Repair of DNA-protein Crosslinks on Plasmids Transfected into Mammalian Cells

مقايسة بسيطة وسريعة، والكمية لقياس إصلاح الحمض النووي-البروتين كروسلينكس على البلازميدات Transfected في خلايا الثدييات

The purpose of this method is to provide a flexible, rapid, and quantitative technique to examine the kinetics of DNA-protein crosslink (DPC) repair in ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

الكشف عن حالة نادرة باستخدام الحمض النووي لتصحيح الخطأ وتسلسل الحمض النووي الريبي

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

منهجية للكشف عن دقة مثلايشن الحمض النووي

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

ATAC-seq Assay with Low Mitochondrial DNA Contamination from Primary Human CD4+ T Lymphocytes

أتاك-seq المقايسة مع الحمض النووي منخفضة التلوث من الابتدائي البشرية CD4 + تي الخلايا اللمفية

ATAC-seq has become a widely used methodology in the study of epigenetics due to its rapid and simple approach to mapping genome-wide accessible ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay Using Micrococcal Nucleases in Mammalian Cells

الكروماتين المناعية الترسيب الفحص باستخدام النوكلور اتوcleases Micrococcal في خلايا الثدييات

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene ...

Use of Frozen Tissue in the Comet Assay for the Evaluation of DNA Damage

استخدام الأنسجة المجمدة في فحص المذنب لتقييم تلف الحمض النووي

The comet assay is gaining popularity as a means to assess DNA damage in cultured cells and tissues, particularly following exposure to chemicals or other ...