Name: detection of post-replicative gaps accumulation and repair in human cells using the dna fiber assay
Uploaded: 2022-02-03T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Post-Replicative Gaps Accumulation and Repair in Human Cells Using the DNA Fiber Assay at JoVE.com

Arbejdet i C.F.M.M.-laboratoriet er støttet af Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, São Paulo, Brasilien, Grants #2019/19435-3, #2013/08028-1 og 2017/05680-0) under International Collaboration Research fra FAPESP og Den Nederlandske Organisation for Videnskabelig Forskning (NWO, Holland); Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, Brasília, DF, Brasilien, Grants # 308868/2018-8] og Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal do Ensino Superior (CAPES, Brasília, DF, Brasilien, finanskode 001).

Da undersøgelsen bruger humane celler, blev arbejdet godkendt af den etiske komité ved Institut for Biomedicinsk Videnskab ved University of São Paulo (ICB-USP, godkendelsesnummer #48347515.3.00005467) til forskning med humane prøver.
BEMÆRK: De protokoller, der er beskrevet her, blev brugt i tidligere publikationer med mindre ændringer 14,16,28. Her er fokus på brugen af ultraviolet lys C (UVC...

<ol>
	<li>Rupp, W. D., Howard-Flanders, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discontinuities+in+the+DNA+synthesized+in+an+excision-defective+strain+of+Escherichia+coli+following+ultraviolet+irradiation.">Discontinuities in the DNA synthesized in an excision-defective strain of Escherichia coli following ultraviolet irradiation.</a> Journal of Molecular Biology. 31 (2), 291-304 (1968).</li><li>Meneghini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gaps+in+DNA+synthesized+by+ultraviolet+light-irradiated+WI38+human+cells.">Gaps in DNA synthesized by ultraviolet light-irradiated WI38 human cells.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 425 (4), 419-427 (1976).</li><li>Meneghini, R., Cordeiro-Stone, M., Schumacher, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+and+frequency+of+gaps+in+newly+synthesized+DNA+of+xeroderma+pigmentosum+human+cells+irradiated+with+ultraviolet+light.">Size and frequency of gaps in newly synthesized DNA of xeroderma pigmentosum human cells irradiated with ultraviolet light.</a> Biophysical Journal. 33 (1), 81-92 (1981).</li><li>Lopes, M., Foiani, M., Sogo, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+mechanisms+control+chromosome+integrity+after+replication+fork+uncoupling+and+restart+at+irreparable+UV+lesions.">Multiple mechanisms control chromosome integrity after replication fork uncoupling and restart at irreparable UV lesions.</a> Molecular Cell. 21 (1), 15-27 (2006).</li><li>Heller, R. C., Marians, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+fork+reactivation+downstream+of+a+blocked+nascent+leading+strand.">Replication fork reactivation downstream of a blocked nascent leading strand.</a> Nature. 439 (7076), 557-562 (2006).</li><li>Bianchi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PrimPol+bypasses+UV+photoproducts+during+eukaryotic+chromosomal+DNA+replication.">PrimPol bypasses UV photoproducts during eukaryotic chromosomal DNA replication.</a> Molecular Cell. 52 (4), 566-573 (2013).</li><li>Garc&#237;a-G&#243;mez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PrimPol,+an+archaic+primase/polymerase+operating+in+human+cells.">PrimPol, an archaic primase/polymerase operating in human cells.</a> Molecular Cell. 52 (4), 541-553 (2013).</li><li>Mour&#243;n, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repriming+of+DNA+synthesis+at+stalled+replication+forks+by+human+PrimPol.">Repriming of DNA synthesis at stalled replication forks by human PrimPol.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 20 (12), 1383-1389 (2013).</li><li>Wan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hPrimpol1/CCDC111+is+a+human+DNA+primase-polymerase+required+for+the+maintenance+of+genome+integrity.">hPrimpol1/CCDC111 is a human DNA primase-polymerase required for the maintenance of genome integrity.</a> EMBO Reports. 14 (12), 1104-1112 (2013).</li><li>Keen, B. A., Jozwiakowski, S. K., Bailey, L. J., Bianchi, J., Doherty, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+dissection+of+the+domain+architecture+and+catalytic+activities+of+human+PrimPol.">Molecular dissection of the domain architecture and catalytic activities of human PrimPol.</a> Nucleic Acids Research. 42 (9), 5830-5845 (2014).</li><li>Tirman, S., Cybulla, E., Quinet, A., Meroni, A., Vindigni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRIMPOL+ready,+set,+reprime.">PRIMPOL ready, set, reprime.</a> Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 56 (1), 17-30 (2021).</li><li>Quinet, A., Lerner, L. K., Martins, D. J., Menck, C. F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filling+gaps+in+translesion+DNA+synthesis+in+human+cells.">Filling gaps in translesion DNA synthesis in human cells.</a> Mutation Research, Genetic Toxicology Environmental Mutagenesis. 836, 127-142 (2018).</li><li>Ziv, O., Diamant, N., Shachar, S., Hendel, A., Livneh, Z., Bjergb&#230;k, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+measurement+of+translesion+DNA+synthesis+in+mammalian+cells.">Quantitative measurement of translesion DNA synthesis in mammalian cells.</a> DNA Repair Protocols. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). 920, (2012).</li><li>Quinet, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translesion+synthesis+mechanisms+depend+on+the+nature+of+DNA+damage+in+UV-irradiated+human+cells.">Translesion synthesis mechanisms depend on the nature of DNA damage in UV-irradiated human cells.</a> Nucleic Acids Research. 44 (12), 5717-5731 (2016).</li><li>T&#233;cher, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+dynamics:+biases+and+robustness+of+DNA+fiber+analysis.">Replication dynamics: biases and robustness of DNA fiber analysis.</a> Journal of Molecular Biology. 425 (23), 4845-4855 (2013).</li><li>Quinet, A., Carvajal-Maldonado, D., Lemacon, D., Vindigni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+fiber+analysis:+Mind+the+gap.">DNA fiber analysis: Mind the gap.</a> Methods in Enzymology. 591, 55-82 (2017).</li><li>Elvers, I., Johansson, F., Groth, P., Erixon, K., Helleday, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UV+stalled+replication+forks+restart+by+re-priming+in+human+fibroblasts.">UV stalled replication forks restart by re-priming in human fibroblasts.</a> Nucleic Acids Research. 39 (16), 7049-7057 (2011).</li><li>Diamant, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+bypass+operates+in+the+S+and+G2+phases+of+the+cell+cycle+and+exhibits+differential+mutagenicity.">DNA damage bypass operates in the S and G2 phases of the cell cycle and exhibits differential mutagenicity.</a> Nucleic Acids Research. 40 (1), 170-180 (2012).</li><li>Temviriyanukul, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporally+distinct+translesion+synthesis+pathways+for+ultraviolet+light-induced+photoproducts+in+the+mammalian+genome.">Temporally distinct translesion synthesis pathways for ultraviolet light-induced photoproducts in the mammalian genome.</a> DNA Repair. 11 (6), 550-558 (2012).</li><li>Jansen, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redundancy+of+mammalian+Y+family+DNA+polymerases+in+cellular+responses+to+genomic+DNA+lesions+induced+by+ultraviolet+light.">Redundancy of mammalian Y family DNA polymerases in cellular responses to genomic DNA lesions induced by ultraviolet light.</a> Nucleic Acids Research. 42 (17), 11071 (2014).</li><li>Quinet, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap-filling+and+bypass+at+the+replication+fork+are+both+active+mechanisms+for+tolerance+of+low-dose+ultraviolet-induced+DNA+damage+in+the+human+genome.">Gap-filling and bypass at the replication fork are both active mechanisms for tolerance of low-dose ultraviolet-induced DNA damage in the human genome.</a> DNA Repair. 14 (1), 27-38 (2014).</li><li>Callegari, A. J., Clark, E., Pneuman, A., Kelly, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postreplication+gaps+at+UV+lesions+are+signals+for+checkpoint+activation.">Postreplication gaps at UV lesions are signals for checkpoint activation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (18), 8219-8224 (2010).</li><li>Vogt, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+further+properties+of+single-strand-specific+nuclease+from+Aspergillus+oryzae.">Purification and further properties of single-strand-specific nuclease from Aspergillus oryzae.</a> European Journal of Biochemistry. 33 (1), 192-200 (1973).</li><li>Cordeiro-Stone, M., Schumacher, R. I., Meneghini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+replication+fork+in+ultraviolet+light-irradiated+human+cells.">Structure of the replication fork in ultraviolet light-irradiated human cells.</a> Biophysical Journal. 27 (2), 287-300 (1979).</li><li>Lehmann, A. R., Fuchs, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gaps+and+forks+in+DNA+replication:+Rediscovering+old+models.">Gaps and forks in DNA replication: Rediscovering old models.</a> DNA Repair (Amst). 5 (12), 1495-1498 (2006).</li><li>Daigaku, Y., Davies, A. A., Ulrich, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin-dependent+DNA+damage+bypass+is+separable+from+genome+replication.">Ubiquitin-dependent DNA damage bypass is separable from genome replication.</a> Nature. 465 (7300), 951-955 (2010).</li><li>Karras, G. I., Jentsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RAD6+DNA+damage+tolerance+pathway+operates+uncoupled+from+the+replication+fork+and+is+functional+beyond+S+phase.">The RAD6 DNA damage tolerance pathway operates uncoupled from the replication fork and is functional beyond S phase.</a> Cell. 141 (2), 255-267 (2010).</li><li>Tirman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporally+distinct+post-replicative+repair+mechanisms+fill+PRIMPOL-dependent+ssDNA+gaps+in+human+cells.">Temporally distinct post-replicative repair mechanisms fill PRIMPOL-dependent ssDNA gaps in human cells.</a> Molecular Cell. 81 (19), 4026-4040 (2021).</li><li>Cong, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+gaps+are+a+key+determinant+of+PARP+inhibitor+synthetic+lethality+with+BRCA+deficiency.">Replication gaps are a key determinant of PARP inhibitor synthetic lethality with BRCA deficiency.</a> Molecular Cell. 81 (15), 3128-3144 (2021).</li><li>Quinet, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRIMPOL-mediated+adaptive+response+suppresses+replication+fork+reversal+in+BRCA-deficient+cells.">PRIMPOL-mediated adaptive response suppresses replication fork reversal in BRCA-deficient cells.</a> Molecular Cell. 77 (3), 461-474 (2020).</li><li>Jackson, D. A., Pombo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replicon+clusters+are+stable+units+of+chromosome+structure:+evidence+that+nuclear+organization+contributes+to+the+efficient+activation+and+propagation+of+S+phase+in+human+cells.">Replicon clusters are stable units of chromosome structure: evidence that nuclear organization contributes to the efficient activation and propagation of S phase in human cells.</a> The Journal of Cell Biology. 140 (6), 1285-1295 (1998).</li><li>Schwab, R. A., Niedzwiedz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+DNA+replication+in+the+vertebrate+model+system+DT40+using+the+DNA+fiber+technique.">Visualization of DNA replication in the vertebrate model system DT40 using the DNA fiber technique.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (56), e3255 (2011).</li><li>Simoneau, A., Xiong, R., Zou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+trans+cell+cycle+effects+of+PARP+inhibitors+underlie+their+selectivity+toward+BRCA1/2-deficient+cells.">The trans cell cycle effects of PARP inhibitors underlie their selectivity toward BRCA1/2-deficient cells.</a> Genes &amp; Development. 35 (17-18), 1271-1289 (2021).</li><li>Taglialatela, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=REV1-Pol&#950;+maintains+the+viability+of+homologous+recombination-deficient+cancer+cells+through+mutagenic+repair+of+PRIMPOL-dependent+ssDNA+gaps.">REV1-Pol&#950; maintains the viability of homologous recombination-deficient cancer cells through mutagenic repair of PRIMPOL-dependent ssDNA gaps.</a> Molecular Cell. 81 (19), 4008-4025 (2021).</li><li>Lim, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=USP1+Is+required+for+replication+fork+protection+in+BRCA1-deficient+tumors.">USP1 Is required for replication fork protection in BRCA1-deficient tumors.</a> Molecular Cell. 72 (6), 925-941 (2018).</li><li>Peng, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposing+roles+of+FANCJ+and+HLTF+protect+forks+and+restrain+replication+during+stress.">Opposing roles of FANCJ and HLTF protect forks and restrain replication during stress.</a> Cell Reports. 24 (12), 3251-3261 (2018).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA+translocase+FANCM/MHF+promotes+replication+traverse+of+DNA+interstrand+crosslinks.">The DNA translocase FANCM/MHF promotes replication traverse of DNA interstrand crosslinks.</a> Molecular Cell. 52 (3), 434-446 (2013).</li><li>Ding, W., Bishop, M. E., Lyn-Cook, L. E., Davis, K. J., Manjanatha, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+alkaline+comet+assay+and+enzyme-modified+alkaline+comet+assay+for+measuring+DNA+strand+breaks+and+oxidative+DNA+damage+in+rat+liver.">In vivo alkaline comet assay and enzyme-modified alkaline comet assay for measuring DNA strand breaks and oxidative DNA damage in rat liver.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (111), e53833 (2016).</li><li>Lu, Y., Liu, Y., Yang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+in+vitro+DNA+damage+using+comet+assay.">Evaluating in vitro DNA damage using comet assay.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (128), e56450 (2017).</li></ol>

Kritiske trin i standard DNA-fiberassayprotokollen blev diskuteret i en tidligere publikation32. Her beskriver vi modificerede versioner af standard DNA-fiberassayet for at undersøge tilstedeværelsen af postreplikative ssDNA-huller samt deres reparation ved hulfyldning, oprindeligt beskrevet i14. I forbindelse med postreplikativ ssDNA-gap-tilstedeværelse vil brugen af S1-nukleasen i S1-fiberprotokollen sandsynligvis være egnet efter eksponering af et genotoksisk middel ...

Skelsættende værker har givet bevis for akkumulering af postreplikationelle enkeltstrengede (ssDNA) huller ved behandling med DNA-skadelige stoffer i bakterier1 og humane celler 2,3. Under replikation af beskadigede DNA-skabeloner kan DNA-syntesemaskineriet omgå læsionerne ved at anvende specifikke translesionsyntese DNA-polymeraser eller gennem skabelonskiftmekanismer. Alternativt kan replikaen også blot springe læsionen over og efterlade et ssDNA-hul, der skal repareres senere. For nylig viste en undersøgelse tydeligt, at behandling med genotoksiske midler fører til ssDNA-huller i eukaryoter ved at anvende elektronmikroskopi til at visualisere den specifikke struktur af replikationsmellemprodukter4. Dannelsen af disse regioner af postreplikative huller blev oprindeligt foreslået at være et simpelt resultat af den semi-diskontinuerlige tilstand af DNA-replikation2. I dette tilfælde kan en læsion på den forsinkede streng blokere forlængelsen af et Okazaki-fragment, men gaffelprogression reddes naturligt af det følgende Okazaki-fragment og efterlader et ssDNA-hul. Yderligere undersøgelser viste imidlertid, at dannelsen af huller på den førende streng også er mulig, som først vist i bakterier5. I eukaryoter blev PRIMPOL, en unik DNA-polymerase med primaseaktivitet, vist at være i stand til at genstarte DNA-syntese nedstrøms en replikationsblokerende læsion gennem sin reprimingsaktivitet 6,7,8,9,10,11. Således kan PRIMPOL-primaseaktiviteten forklare dannelsen af postreplikative ssDNA-huller i den ledende streng ved behandling med et DNA-skadeligt middel i humane celler12. Ikke desto mindre krævede påvisning af disse huller såvel som gapreparation indtil for nylig indirekte eller tidskrævende tilgange såsom elektronmikroskopi4 eller plasmidbaserede assays13. Anvendelsen af den ssDNA-specifikke S1-nuklease til påvisning af huller i humane celler blev pioneret af tidlige undersøgelser for mere end fyrre år siden ved hjælp af saccharosegradientteknikker 2,3. For nylig anvendte vores gruppe brugen af denne nuklease til at detektere ssDNA i replikerende DNA (postreplikative huller) ved hjælp af andre metoder såsom DNA-fiber og kometassays14. Disse nye tilgange banede vejen for den nuværende bølge af undersøgelser af postreplikative huller. Her beskriver vi en strategi for at bruge S1-nuklease til at detektere postreplikative ssDNA-huller ved DNA-fiberassay og forklare, hvordan et differentielt mærkningsskema i DNA-fiberprotokollen kan muliggøre undersøgelsen af reparationen af disse huller.
DNA-fiberassayet er en kraftfuld teknik, der er blevet brugt af et stigende antal laboratorier og har givet værdifuld indsigt i replikationsgaffeldynamik og replikationsstressresponsmekanismer. Kort fortalt er denne teknik baseret på den sekventielle inkorporering af nukleotidanaloger (såsom CldU-5-chlor-2'-deoxyuridin- og IdU-5-iodo-2'-deoxyuridin) i det replikerende DNA. Efter høst lyses celler, og DNA-molekyler spredes på et positivt belagt glasglas. CldU og IdU detekteres derefter af specifikke antistoffer, som kan visualiseres i et fluorescerende mikroskop som tofarvede fibre. Endelig måles længden af IdU- og CldU-kanalerne for at identificere eventuelle ændringer i DNA-replikationsdynamikken som følge af INDUKTION AF DNA-SKADER. Denne teknik kan bruges til at undersøge forskellige fænomener, såsom gaffelstop, gaffelbremsning, spirende DNA-nedbrydning og variationer i hyppigheden af oprindelsesaffyring15,16.
En begrænsning af DNA-fiberassayet er dets opløsning af et par kilobaser. Fordi postreplikative ssDNA-huller kan være i området for hundredvis af baser, er det umuligt at visualisere disse huller direkte ved hjælp af standard DNA-fiberprotokollen. Tilstedeværelsen af ssDNA-huller på replikerende DNA i humane celler behandlet med genotoksiske midler har været indirekte impliceret før. For eksempel observation af ssDNA som vurderet ved rekruttering af det ssDNA-bindende protein, replikationsprotein A (RPA), i celler uden for S-fasen eller dannelsen af ssDNA som påvist ved alkalisk DNA-afvikling kombineret med fraværet af langvarig gaffelstopning ved DNA-fiberassay 12,17,18,19,20,21 blev tilskrevet akkumuleringen af ssDNA-huller. Derudover inducerer postreplikative ssDNA-huller et ATR-afhængigt G2 / M-fasekontrolpunkt og arresterer celler behandlet med replikationsgiftstoffer 18,19,20,21,22.
S1-nukleasen nedbryder enkeltstrengede nukleinsyrer, der frigiver 5'-phosphorylmono- eller oligonukleotider og har en 5 gange højere affinitet til ssDNA sammenlignet med RNA. Dobbeltstrengede nukleinsyrer (DNA: DNA, DNA: RNA eller RNA: RNA) er resistente over for S1-nukleasen, undtagen når de anvendes i ekstremt høje koncentrationer. S1-nukleasen spalter også dobbeltstrenget DNA i det enkeltstrengede område forårsaget af et nick, gap, mismatch eller loop. S1-nukleasen er således en ssDNA-specifik endonuklease, der er i stand til at spalte ssDNA-huller og i sidste ende generere dobbeltstrengede brud23,24. Tilføjelse af trin til S1-nukleasefordøjelse til DNA-fiberprotokollen muliggør således indirekte påvisning af postreplikative ssDNA-huller. I nærvær af huller vil behandling af eksponerede kerner med S1-nukleasen før DNA-spredning generere kortere kanaler som følge af S1-spaltning af ssDNA, der i sagens natur er til stede ved huller14. Følgelig er kanalforkortelse aflæsningen for ssDNA-huller ved hjælp af denne tilgang. Sammenlignet med standard DNA-fiberprotokollen kræver DNA-fiberen med S1-nukleasen kun to ekstra trin: kerneeksponering (cellepermeabilisering) og behandling med S1-nukleasen. Det er vigtigt at bemærke, at passende kontroller er obligatoriske, såsom prøver behandlet med det genotoksiske middel, men uden S1-nukleasen, og prøver behandlet med S1-nukleasen uden det genotoksiske middel. Selve protokollen, herunder inkorporering af analoger, S1-behandling og spredning, kan udføres på en dag og kræver ikke ekstraordinært materiale. Det kræver kun thymidinanalogerne, den rensede S1-nuklease, de passende primære og sekundære antistoffer og et fluorescerende mikroskop. Samlet set registrerer DNA-fiberen, der anvender S1-nukleasen, ssDNA-huller på igangværende replikationsgafler ved hjælp af en relativt enkel tilgang.
De postreplikative ssDNA-huller, der dannes som en konsekvens af replikationsspændingsmekanismer, kan repareres (eller udfyldes) af forskellige mekanismer, herunder translesion-DNA-syntese eller skabelonskift, i en proces kaldet gap-filling eller post-replication repair (PRR)25. Disse processer forekommer bag de fremadskridende gafler, der involverer replikationsuafhængig DNA-syntese 14,26,27. Baseret på disse fund kan et mærkningsskema, der adskiller sig fra standard DNA-fiberassayet, udføres for at visualisere hulfyldningshændelser i G2-fasen direkte 14,16,26,28. Specifikt kan en thymidinanalog bruges til at mærke replikationsgaflen på tidspunktet for genotoksisk behandling og postreplikativ ssDNA-huldannelse, mens en anden thymidinanalog kan bruges til at mærke mellemrumsfyldningshændelser. I denne protokol mærkes celler med en første thymidinanalog (IdU, for eksempel) umiddelbart efter eller samtidig med genotoksisk behandling i 1 time, således at det spirende DNA mærkes på tidspunktet for spaltedannelse. Nocodazol tilsættes ved behandling i alt mellem 12-24 timer for at arrestere celler i G2 / M, hvilket forhindrer den følgende S-fase. I de sidste 4 timer af nocodazolbehandling tilsættes en anden thymidinanalog (CldU, for eksempel) til mediet, der skal inkorporeres under hulfyldning. Det er vigtigt, at dette assay kun kan bruges til at detektere mellemrumsfyldningshændelser i G2, fordi hulfyldningssignalet fra CldU ikke kan skelnes fra et signal på grund af CldU-inkorporering i replikerende DNA i S-fasen. For at minimere baggrundssignalet bør timingen af CldU-inkorporering efter skadeinduktion derfor falde sammen med, når det meste af cellepopulationen går ind i G2-fase14. Derfor vil denne timing variere afhængigt af cellelinje og behandlingsforhold. Optimering af cellecyklusprogression inden anvendelse af dette assay anbefales. Co-farvning af disse thymidinanaloger muliggør visualisering af gap-filling (PRR) kanaler (CldU-patches) oven på spirende DNA (IdU-kanaler), der syntetiseres under den genotoksiske behandling, når ssDNA-huller blev genereret.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid, Glacial</td>
			<td>Synth</td>
			<td>64-19-7</td>
			<td>Alternatively, BSA - Biosera - REF PM-T1725/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium hydroxide</td>
			<td>Synth</td>
			<td>1336-21-6</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody anti-mouse IgG1 Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11005</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody anti-rat Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21470</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody Mouse anti-BrdU</td>
			<td>Becton Disckson</td>
			<td>347580</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody Rat anti-BrdU</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>&#160;Ab6326</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological security hood</td>
			<td>Pachane</td>
			<td>PA 410</td>
			<td>Use hood present in the laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (Bovine Serum Albumin)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3294</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>179693</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CldU</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>C6891</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cloridric acid</td>
			<td>Synth</td>
			<td>7647-01-0</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Zeiss LSM Series (7, 8 or 9)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass (or coverslips)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>152460</td>
			<td>Alternatively, Olen - Kasvi Cover Glass (24 x 60 mm) - K5-2460</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM - High Glucose</td>
			<td>LGC/Gibco</td>
			<td>BR30211-05/12100046</td>
			<td>Use culture media specific for the cell line used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E5314</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence Microscope Axiovert 200</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12657-029</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forma Series II Water Jacketed CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific 3110</td>
			<td>13-998-074</td>
			<td>Use cell incubator present in the laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide jar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5516</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Idu</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>I7125</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Synth</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>67-56-1</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Denville</td>
			<td>M1021</td>
			<td>Alternatively, Olen - Kasvi Microscope Slides - K5-7105 OR Precision Glass Line - 7105-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS (&#193;cido 3-morfolinopropano 1-sulf&#244;nico)</td>
			<td>Synth</td>
			<td>1132-61-2</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nocodazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31430-18-9</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate Buffer Saline)</td>
			<td>Life Thechnologies</td>
			<td>3002</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold AntiFade Mountant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36930</td>
			<td>Any antifade moutant solution for immunofluorescence could be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S1 nuclease purified from Aspergillus oryzae</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18001-016</td>
			<td>Pre-dilute the S1 nuclease (1/100 - 1/200) in S1 nuclease dilution buffer provided by the manufacturer, aliquote and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0302</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate Trihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>6131-90-4</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Synth</td>
			<td>&#160;7647-14-5</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>57-50-1</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>West Lab Research</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Synth</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200072</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UVC Lamp</td>
			<td>Non Specific</td>
			<td>-</td>
			<td>Essential: emission lenght of 254 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VLX-3W UV Radiometer</td>
			<td>Vilber Loumart</td>
			<td>-</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>557-34-6</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of post-replicative gaps accumulation and repair in human cells using the dna fiber assay

DNA-fiberassayet er en enkel og robust metode til analyse af replikationsgaffeldynamik baseret på immundetektion af nukleotidanaloger, der inkorporeres under DNA-syntese i humane celler. Denne teknik har dog en begrænset opløsning på et par tusinde kilobaser. Følgelig kan postreplikative enkeltstrengede DNA-huller (ssDNA) så små som et par hundrede baser ikke påvises ved standardassayet. Her beskriver vi en modificeret version af DNA-fiberassayet, der bruger S1-nukleasen, et enzym, der specifikt spalter ssDNA. I nærværelse af postreplikative ssDNA-huller vil S1-nukleasen målrette og spalte hullerne og generere kortere kanaler, der kan bruges som udlæsning for ssDNA-huller på igangværende gafler. Disse postreplikative ssDNA-huller dannes, når beskadiget DNA replikeres diskontinuerligt. De kan repareres via mekanismer, der er afkoblet fra genomreplikation, i en proces kendt som hulfyldning eller postreplikativ reparation. Fordi hulfyldningsmekanismer involverer DNA-syntese uafhængigt af S-fasen, kan ændringer i DNA-fibermærkningsskemaet også anvendes til at overvåge hulfyldningshændelser. Alt i alt er disse modifikationer af DNA-fiberassayet kraftfulde strategier til at forstå, hvordan postreplikative huller dannes og udfyldes i genomet af humane celler.

I S1 Fiber-analysen, hvis behandling med et genotoksisk middel fører til postreplikative ssDNA-huller, vil den samlede længde af DNA-fibre fra S1-behandlede kerner være kortere ved behandling med DNA-skade sammenlignet med ubehandlede prøver såvel som med prøver, der blev behandlet med det genotoksiske middel, men ikke blev underkastet S1-spaltning (figur 1).
Alternativt, hvis behandling med S1-nukleasen ikke signifikant påvirker længden af DNA-fibre samme...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Post-Replicative Gaps Accumulation and Repair in Human Cells Using the DNA Fiber Assay at JoVE.com

Detection of Post-Replicative Gaps Accumulation and Repair in Human Cells Using the DNA Fiber Assay

Her beskriver vi to modifikationer af DNA-fiberassayet for at undersøge enkeltstrengede DNA-huller i replikerende DNA efter induktion af læsioner. S1-fiberassayet muliggør detektion af postreplikative huller ved hjælp af den ssDNA-specifikke S1-endonuklease, mens gap-filling-analysen muliggør visualisering og kvantificering af gap-reparation.

Påvisning af postreplikation af huller akkumulering og reparation i humane celler ved hjælp af DNA-fiberassayet

The DNA fiber assay is a simple and robust method for the analysis of replication fork dynamics, based on the immunodetection of nucleotide analogs that ...

Vores protokol åbner nye muligheder for at undersøge, hvordan replikation sker på beskadiget DNA. Teknikkerne kan detektere dannelsen og reparationen af enkeltstrengede DNA-huller, modsat DNA-læsionen. S1-nukleasen spalter det enkeltstrengede DNA og muliggør påvisning af postreplikative huller.Denne tilgang blev først brugt af Dr.Meneghini og Dr.Cordiero-Stone i 1970'erne i Brasilien og for nylig tilpasset af os til DNA-fiberassayet. Brug af den teknik, der er beskrevet her, til at studere dannelsen og reparationen af postreplikative huller kan give indsigt i mekanismen for DNA-reparation og replikationsstressrespons, der opretholder genomintegritet. For begge protokoller, der er beskrevet her, S1-fiberen og gap-filling assays, Det er afgørende at inkludere alle kontrollerne for at sikre nøjagtig fortolkning af dataene.Proceduren vil blive demonstreret af Davi J.Martins, en ph.d.-studerende fra vores laboratorium, og Dr.Annabel Quinet, en samarbejdspartner, der tidligere udviklede disse teknikker, da han arbejdede i vores gruppe. Til at begynde med skal du aspirere kulturmedierne og straks tilføje kulturmedierne med 20 mikromolar IDU-medier til cellerne. Inkuber cellerne ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid i præcis 20 minutter.Vask derefter cellerne hurtigt med forvarmet PBS to gange og bestråle dem med 20 joule pr. Meter kvadrat UV-C. Brug ubehandlede celler som kontroller. Tilsæt straks medierne med 200-mikromolar CldU til cellerne og inkuber dem ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid i præcis 60 minutter.Derefter vaskes cellerne med forvarmet PBS to gange og permeabiliseres dem med CSK 100-bufferen i to til 10 minutter i henhold til cellelinjen ved stuetemperatur. Efter CSK-permeabilisering kan kernerne med næsten ingen cytoplasma ses sammenlignet med dem før permeabiliseringen. Hæld forsigtigt PBS ned ad siden af hver brønd for at vaske kernerne med PBS.Vask derefter kernerne med S1-buffer. Inkuber kernerne i S1-bufferen med 20 enheder pr. milliliter S1-nuklease og uden S1-nukleasen i 30 minutter ved 37 grader Celsius. Derefter aspireres S1-bufferen og tilføjes 0,1% BSA i PBS.Skrab kernerne og overfør dem til et ca. kommenteret 1,5 ml rør. Hold rørene på is hele tiden. Centrifuger kernerne omkring 4.600 gange G i fem minutter ved fire grader Celsius.Resuspender pellets i PBS i en koncentration på ca. 1.500 celler pr. Mikroliter. Placer rørene på is og fortsæt straks til DNA-fiberforberedelse ved at sprede protokollen. Anmærk mikroskopets dias med en kulstofblyant og læg dem fladt på en bakke.Tryk på bunden af røret for at sikre homogenisering og tilføj to mikroliter celler på toppen af det tilsvarende dias. Tilsæt seks mikroliter af lysisbufferen og lys cellerne ved at pipettere op og ned cirka fem gange. Brug pipettespidsen til at trække dråben lidt mod bunden af diaset og inkuberes i fem minutter ved stuetemperatur for at lyse kernerne.Vip glidet på omkring 20 til 40 grader, og lad dråben sprede sig til bunden af diaset ved konstant lav hastighed. Lad diaset tørre ved stuetemperatur i mørke i 10 til 15 minutter. Derefter nedsænkes dem i en krukke indeholdende den frisklavede fastgørelsesopløsning og inkuberes i fem minutter ved stuetemperatur for at fastgøre DNA på diasene.Diasene vaskes med PBS to gange i fem minutter, og DNA'et denatureres med frisklavet 2,5-molar clorinsyre i 40 til 60 minutter ved stuetemperatur. Vask diasene med PBS tre gange i fem minutter og bloker med 5% BSA, der tidligere er opvarmet i 30 til 60 minutter ved 37 grader Celsius. Tryk forsigtigt på papiret for at fjerne overskydende væske fra diasene.Tilsæt 30 mikroliter primære antistoffer til diasene dråbevis og læg en dækglidning ovenpå. Inkuberes i 1 til 1,5 timer ved stuetemperatur i et mørkt, fugtigt kammer. Læg gliderne i en krukke med PBS i et til to minutter, og fjern derefter forsigtigt dækslipsene.Vask med PBST i en krukke tre gange i fem minutter, og læg diasene i PBS. Fjern overskydende væske ved forsigtigt at banke på et papir og tilsæt 30 mikroliter af de sekundære antistoffer til diasene dråbevis. Læg en dækseddel ovenpå.Inkuberes i 45 til 60 minutter ved stuetemperatur i et mørkt og fugtigt kammer. Gentag trinene til vask af diasene og fjernelse af overskydende PBS igen, og tilsæt 20 mikroliter af monteringsreagenset dråbevis til diasene. Placer en dækslip ovenpå og undgå bobler.Placer en dråbe nedsænkningsolie nær toppen af diaset, hvor cellerne blev lyset. Brug den grønne kanal og søg i de grønne prikker i baggrunden for at finde fokus. Åbn Leica Application Suite-softwaren, klik på Anskaf, og vælg den grønne kanal.Juster indstillingerne for den grønne kanal før analyse. Skift derefter til den røde kanal og juster indstillingerne. Find hovedkoncentrationen af fibre og flyt til kanterne for at finde de godt spredte, ikke-overlappende, individuelle fibre.Brug kun én kanal til at vælge områderne til billederne og undgå potentiel bias. Klik på Få overlay ikon og juster softwaren for den korrekte mikroskopforstørrelse. Tag omkring 15 til 20 billeder pr. dias langs hele diaset ved den grønne kanal og derefter ved den røde kanal.De to kanaler flettes nu, og den oprettede overlejring flyttes til en unik mappe. Det er muligt at se fibrene med røde og grønne farver. Åbn ImageJ-softwaren, venstreklik på det femte ikon, vælg den anden mulighed, og vælg derefter værktøjet Segmenteret linje.Venstreklik for at tegne den nøjagtige sti for den røde eller grønne kanal og højreklik for at stoppe tegningen. Tryk på M-knappen på tastaturet for at måle længden. For S1-fiberen skal du holde styr på de røde og grønne kanalmålinger for hver fiber og måle røde og grønne kanallængder fra mindst 150 fibre fra forskellige billeder.En S1-fiber er vist på disse repræsentative billeder. Kontrol-spirende DNA-kanal uden hullerne og uigennemtrængelig for spaltning af S1-nukleasen er vist her. DNA-kanal positiv for huller spaltet af S1-nukleasen resulterede i en kortere CldU-kanallængde.Et differentielt mærkningsskema, der er udførligt beskrevet i tekstmanuskriptet, kan udføres for at mærke mellemrumsudfyldningshændelser. I dette assay, navngivet gap-filling assay, svarer længere IDU-spor med mindst en CldU-patch eller færre CldU-patches til lav gap-filling-tæthed. Kortere IDU-kanaler med mindst en CldU-patch og længere IDU-kanaler med flere CldU-patches svarer til høj gap-påfyldningstæthed.Permeabiliseringstrinnet i denne protokol er afgørende for, at S1-nukleasen virker på de huller, der dannes under replikationen af beskadiget DNA. S1-nukleasen kan også bruges i kometassayprotokollen til at detektere de huller, der dannes under replikationen af beskadiget DNA, der vedvarer efter behandlingen. S1-fiberassayet banede vejen for det nye paradigme, at postreplikative huller kan forårsage kræftsårbarhed, især i bryst- og æggestokkræft, der bærer mutationer i BRCA1- og 2-gener.

Research

JoVE Journal

Genetics

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Påvisning af Copy Number Ændringer Brug Single Cell Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Atomic Force Microscopy Investigations of DNA Lesion Recognition in Nucleotide Excision Repair

Atomic Force Microscopy Undersøgelser af DNA Lesion Recognition i Nucleotide Excision Repair

AFM imaging is a powerful technique for the study of protein-DNA interactions. This single molecule method allows the simultaneous resolution of different ...

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

Immunfarvning for DNA ændringer: beregningsmæssige analyse af Konfokal billeder

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Højeffektive gen afbrydelse af Murine og menneskelige hæmatopoietisk stamceller ved CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

A Simple, Rapid, and Quantitative Assay to Measure Repair of DNA-protein Crosslinks on Plasmids Transfected into Mammalian Cells

En enkel, hurtig og kvantitative analysen til foranstaltning reparation af DNA-protein krydsbindinger på plasmider transfekteret i pattedyrceller

The purpose of this method is to provide a flexible, rapid, and quantitative technique to examine the kinetics of DNA-protein crosslink (DPC) repair in ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Sjælden begivenhed registrering ved hjælp af fejl-korrigeret DNA og RNA sekventering

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Metoder til nøjagtig detektering af mitokondrie-DNA methylering

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

ATAC-seq Assay with Low Mitochondrial DNA Contamination from Primary Human CD4+ T Lymphocytes

ATAC-seq Assay med lav mitokondriel DNA forurening fra primære menneskelige CD4 + T-lymfocytter

ATAC-seq has become a widely used methodology in the study of epigenetics due to its rapid and simple approach to mapping genome-wide accessible ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay Using Micrococcal Nucleases in Mammalian Cells

Kromatin Immunoprecipitation assay ved hjælp af Mikrococcal-nukleaser i pattedyrsceller

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene ...

Use of Frozen Tissue in the Comet Assay for the Evaluation of DNA Damage

Anvendelse af frosset væv i Comet-analysen til vurdering af DNA-skader

The comet assay is gaining popularity as a means to assess DNA damage in cultured cells and tissues, particularly following exposure to chemicals or other ...