Name: detection of post-replicative gaps accumulation and repair in human cells using the dna fiber assay
Uploaded: 2022-02-03T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Post-Replicative Gaps Accumulation and Repair in Human Cells Using the DNA Fiber Assay at JoVE.com

Het werk in het C.F.M.M.-laboratorium wordt ondersteund door Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, São Paulo, Brazilië, Grants #2019/19435-3, #2013/08028-1 en 2017/05680-0) in het kader van het International Collaboration Research van FAPESP en de Nederlandse Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (NWO, Nederland); Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, Brasília, DF, Brazilië, Grants # 308868/2018-8] en Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal do Ensino Superior (CAPES, Brasília, DF, Brazilië, Finance Code 001).

Omdat de studie menselijke cellen gebruikt, werd het werk goedgekeurd door de ethische commissie van het Instituut voor Biomedische Wetenschappen aan de Universiteit van São Paulo (ICB-USP, goedkeuringsnummer # 48347515.3.00005467) voor het onderzoek met menselijke monsters.
OPMERKING: De hier beschreven protocollen werden gebruikt in eerdere publicaties met kleine wijzigingen 14,16,28. Hier ligt de ...

<ol>
	<li>Rupp, W. D., Howard-Flanders, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discontinuities+in+the+DNA+synthesized+in+an+excision-defective+strain+of+Escherichia+coli+following+ultraviolet+irradiation.">Discontinuities in the DNA synthesized in an excision-defective strain of Escherichia coli following ultraviolet irradiation.</a> Journal of Molecular Biology. 31 (2), 291-304 (1968).</li><li>Meneghini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gaps+in+DNA+synthesized+by+ultraviolet+light-irradiated+WI38+human+cells.">Gaps in DNA synthesized by ultraviolet light-irradiated WI38 human cells.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 425 (4), 419-427 (1976).</li><li>Meneghini, R., Cordeiro-Stone, M., Schumacher, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+and+frequency+of+gaps+in+newly+synthesized+DNA+of+xeroderma+pigmentosum+human+cells+irradiated+with+ultraviolet+light.">Size and frequency of gaps in newly synthesized DNA of xeroderma pigmentosum human cells irradiated with ultraviolet light.</a> Biophysical Journal. 33 (1), 81-92 (1981).</li><li>Lopes, M., Foiani, M., Sogo, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+mechanisms+control+chromosome+integrity+after+replication+fork+uncoupling+and+restart+at+irreparable+UV+lesions.">Multiple mechanisms control chromosome integrity after replication fork uncoupling and restart at irreparable UV lesions.</a> Molecular Cell. 21 (1), 15-27 (2006).</li><li>Heller, R. C., Marians, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+fork+reactivation+downstream+of+a+blocked+nascent+leading+strand.">Replication fork reactivation downstream of a blocked nascent leading strand.</a> Nature. 439 (7076), 557-562 (2006).</li><li>Bianchi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PrimPol+bypasses+UV+photoproducts+during+eukaryotic+chromosomal+DNA+replication.">PrimPol bypasses UV photoproducts during eukaryotic chromosomal DNA replication.</a> Molecular Cell. 52 (4), 566-573 (2013).</li><li>Garc&#237;a-G&#243;mez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PrimPol,+an+archaic+primase/polymerase+operating+in+human+cells.">PrimPol, an archaic primase/polymerase operating in human cells.</a> Molecular Cell. 52 (4), 541-553 (2013).</li><li>Mour&#243;n, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repriming+of+DNA+synthesis+at+stalled+replication+forks+by+human+PrimPol.">Repriming of DNA synthesis at stalled replication forks by human PrimPol.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 20 (12), 1383-1389 (2013).</li><li>Wan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hPrimpol1/CCDC111+is+a+human+DNA+primase-polymerase+required+for+the+maintenance+of+genome+integrity.">hPrimpol1/CCDC111 is a human DNA primase-polymerase required for the maintenance of genome integrity.</a> EMBO Reports. 14 (12), 1104-1112 (2013).</li><li>Keen, B. A., Jozwiakowski, S. K., Bailey, L. J., Bianchi, J., Doherty, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+dissection+of+the+domain+architecture+and+catalytic+activities+of+human+PrimPol.">Molecular dissection of the domain architecture and catalytic activities of human PrimPol.</a> Nucleic Acids Research. 42 (9), 5830-5845 (2014).</li><li>Tirman, S., Cybulla, E., Quinet, A., Meroni, A., Vindigni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRIMPOL+ready,+set,+reprime.">PRIMPOL ready, set, reprime.</a> Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 56 (1), 17-30 (2021).</li><li>Quinet, A., Lerner, L. K., Martins, D. J., Menck, C. F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filling+gaps+in+translesion+DNA+synthesis+in+human+cells.">Filling gaps in translesion DNA synthesis in human cells.</a> Mutation Research, Genetic Toxicology Environmental Mutagenesis. 836, 127-142 (2018).</li><li>Ziv, O., Diamant, N., Shachar, S., Hendel, A., Livneh, Z., Bjergb&#230;k, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+measurement+of+translesion+DNA+synthesis+in+mammalian+cells.">Quantitative measurement of translesion DNA synthesis in mammalian cells.</a> DNA Repair Protocols. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). 920, (2012).</li><li>Quinet, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translesion+synthesis+mechanisms+depend+on+the+nature+of+DNA+damage+in+UV-irradiated+human+cells.">Translesion synthesis mechanisms depend on the nature of DNA damage in UV-irradiated human cells.</a> Nucleic Acids Research. 44 (12), 5717-5731 (2016).</li><li>T&#233;cher, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+dynamics:+biases+and+robustness+of+DNA+fiber+analysis.">Replication dynamics: biases and robustness of DNA fiber analysis.</a> Journal of Molecular Biology. 425 (23), 4845-4855 (2013).</li><li>Quinet, A., Carvajal-Maldonado, D., Lemacon, D., Vindigni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+fiber+analysis:+Mind+the+gap.">DNA fiber analysis: Mind the gap.</a> Methods in Enzymology. 591, 55-82 (2017).</li><li>Elvers, I., Johansson, F., Groth, P., Erixon, K., Helleday, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UV+stalled+replication+forks+restart+by+re-priming+in+human+fibroblasts.">UV stalled replication forks restart by re-priming in human fibroblasts.</a> Nucleic Acids Research. 39 (16), 7049-7057 (2011).</li><li>Diamant, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+bypass+operates+in+the+S+and+G2+phases+of+the+cell+cycle+and+exhibits+differential+mutagenicity.">DNA damage bypass operates in the S and G2 phases of the cell cycle and exhibits differential mutagenicity.</a> Nucleic Acids Research. 40 (1), 170-180 (2012).</li><li>Temviriyanukul, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporally+distinct+translesion+synthesis+pathways+for+ultraviolet+light-induced+photoproducts+in+the+mammalian+genome.">Temporally distinct translesion synthesis pathways for ultraviolet light-induced photoproducts in the mammalian genome.</a> DNA Repair. 11 (6), 550-558 (2012).</li><li>Jansen, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redundancy+of+mammalian+Y+family+DNA+polymerases+in+cellular+responses+to+genomic+DNA+lesions+induced+by+ultraviolet+light.">Redundancy of mammalian Y family DNA polymerases in cellular responses to genomic DNA lesions induced by ultraviolet light.</a> Nucleic Acids Research. 42 (17), 11071 (2014).</li><li>Quinet, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap-filling+and+bypass+at+the+replication+fork+are+both+active+mechanisms+for+tolerance+of+low-dose+ultraviolet-induced+DNA+damage+in+the+human+genome.">Gap-filling and bypass at the replication fork are both active mechanisms for tolerance of low-dose ultraviolet-induced DNA damage in the human genome.</a> DNA Repair. 14 (1), 27-38 (2014).</li><li>Callegari, A. J., Clark, E., Pneuman, A., Kelly, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postreplication+gaps+at+UV+lesions+are+signals+for+checkpoint+activation.">Postreplication gaps at UV lesions are signals for checkpoint activation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (18), 8219-8224 (2010).</li><li>Vogt, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+further+properties+of+single-strand-specific+nuclease+from+Aspergillus+oryzae.">Purification and further properties of single-strand-specific nuclease from Aspergillus oryzae.</a> European Journal of Biochemistry. 33 (1), 192-200 (1973).</li><li>Cordeiro-Stone, M., Schumacher, R. I., Meneghini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+replication+fork+in+ultraviolet+light-irradiated+human+cells.">Structure of the replication fork in ultraviolet light-irradiated human cells.</a> Biophysical Journal. 27 (2), 287-300 (1979).</li><li>Lehmann, A. R., Fuchs, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gaps+and+forks+in+DNA+replication:+Rediscovering+old+models.">Gaps and forks in DNA replication: Rediscovering old models.</a> DNA Repair (Amst). 5 (12), 1495-1498 (2006).</li><li>Daigaku, Y., Davies, A. A., Ulrich, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin-dependent+DNA+damage+bypass+is+separable+from+genome+replication.">Ubiquitin-dependent DNA damage bypass is separable from genome replication.</a> Nature. 465 (7300), 951-955 (2010).</li><li>Karras, G. I., Jentsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RAD6+DNA+damage+tolerance+pathway+operates+uncoupled+from+the+replication+fork+and+is+functional+beyond+S+phase.">The RAD6 DNA damage tolerance pathway operates uncoupled from the replication fork and is functional beyond S phase.</a> Cell. 141 (2), 255-267 (2010).</li><li>Tirman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporally+distinct+post-replicative+repair+mechanisms+fill+PRIMPOL-dependent+ssDNA+gaps+in+human+cells.">Temporally distinct post-replicative repair mechanisms fill PRIMPOL-dependent ssDNA gaps in human cells.</a> Molecular Cell. 81 (19), 4026-4040 (2021).</li><li>Cong, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+gaps+are+a+key+determinant+of+PARP+inhibitor+synthetic+lethality+with+BRCA+deficiency.">Replication gaps are a key determinant of PARP inhibitor synthetic lethality with BRCA deficiency.</a> Molecular Cell. 81 (15), 3128-3144 (2021).</li><li>Quinet, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRIMPOL-mediated+adaptive+response+suppresses+replication+fork+reversal+in+BRCA-deficient+cells.">PRIMPOL-mediated adaptive response suppresses replication fork reversal in BRCA-deficient cells.</a> Molecular Cell. 77 (3), 461-474 (2020).</li><li>Jackson, D. A., Pombo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replicon+clusters+are+stable+units+of+chromosome+structure:+evidence+that+nuclear+organization+contributes+to+the+efficient+activation+and+propagation+of+S+phase+in+human+cells.">Replicon clusters are stable units of chromosome structure: evidence that nuclear organization contributes to the efficient activation and propagation of S phase in human cells.</a> The Journal of Cell Biology. 140 (6), 1285-1295 (1998).</li><li>Schwab, R. A., Niedzwiedz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+DNA+replication+in+the+vertebrate+model+system+DT40+using+the+DNA+fiber+technique.">Visualization of DNA replication in the vertebrate model system DT40 using the DNA fiber technique.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (56), e3255 (2011).</li><li>Simoneau, A., Xiong, R., Zou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+trans+cell+cycle+effects+of+PARP+inhibitors+underlie+their+selectivity+toward+BRCA1/2-deficient+cells.">The trans cell cycle effects of PARP inhibitors underlie their selectivity toward BRCA1/2-deficient cells.</a> Genes &amp; Development. 35 (17-18), 1271-1289 (2021).</li><li>Taglialatela, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=REV1-Pol&#950;+maintains+the+viability+of+homologous+recombination-deficient+cancer+cells+through+mutagenic+repair+of+PRIMPOL-dependent+ssDNA+gaps.">REV1-Pol&#950; maintains the viability of homologous recombination-deficient cancer cells through mutagenic repair of PRIMPOL-dependent ssDNA gaps.</a> Molecular Cell. 81 (19), 4008-4025 (2021).</li><li>Lim, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=USP1+Is+required+for+replication+fork+protection+in+BRCA1-deficient+tumors.">USP1 Is required for replication fork protection in BRCA1-deficient tumors.</a> Molecular Cell. 72 (6), 925-941 (2018).</li><li>Peng, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposing+roles+of+FANCJ+and+HLTF+protect+forks+and+restrain+replication+during+stress.">Opposing roles of FANCJ and HLTF protect forks and restrain replication during stress.</a> Cell Reports. 24 (12), 3251-3261 (2018).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA+translocase+FANCM/MHF+promotes+replication+traverse+of+DNA+interstrand+crosslinks.">The DNA translocase FANCM/MHF promotes replication traverse of DNA interstrand crosslinks.</a> Molecular Cell. 52 (3), 434-446 (2013).</li><li>Ding, W., Bishop, M. E., Lyn-Cook, L. E., Davis, K. J., Manjanatha, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+alkaline+comet+assay+and+enzyme-modified+alkaline+comet+assay+for+measuring+DNA+strand+breaks+and+oxidative+DNA+damage+in+rat+liver.">In vivo alkaline comet assay and enzyme-modified alkaline comet assay for measuring DNA strand breaks and oxidative DNA damage in rat liver.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (111), e53833 (2016).</li><li>Lu, Y., Liu, Y., Yang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+in+vitro+DNA+damage+using+comet+assay.">Evaluating in vitro DNA damage using comet assay.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (128), e56450 (2017).</li></ol>

Kritische stappen van het standaard DNA-vezeltestprotocol werden besproken in een eerdere publicatie32. Hier beschrijven we aangepaste versies van de standaard DNA-vezeltest om de aanwezigheid van postreplicerende ssDNA-hiaten te onderzoeken, evenals hun reparatie door het vullen van gaten, aanvankelijk beschreven in14. In de context van post-replicatieve ssDNA gap aanwezigheid, zou het gebruik van de S1-nuclease in het S1 Fiber-protocol hoogstwaarschijnlijk geschikt zijn n...

Baanbrekende werken hebben bewijs geleverd van de accumulatie van post-replicatieve enkelstrengs (ssDNA) hiaten bij behandeling met DNA-schadelijke stoffen in bacteriën1 en menselijke cellen 2,3. Tijdens de replicatie van beschadigde DNA-sjablonen kan de DNA-synthesemachine de laesies omzeilen door gebruik te maken van specifieke translesiesynthese DNA-polymerasen of door sjabloonschakelmechanismen. Als alternatief kan het replisoom ook gewoon de laesie overslaan en een ssDNA-opening achterlaten, om later te worden gerepareerd. Meer recent toonde een studie duidelijk aan dat behandeling met genotoxische middelen leidt tot ssDNA-hiaten in eukaryoten door gebruik te maken van elektronenmicroscopie om de specifieke structuur van replicatietussenproducten te visualiseren4. De vorming van deze gebieden van post-replicatieve hiaten werd aanvankelijk voorgesteld als een eenvoudig resultaat van de semi-discontinue modus van DNA-replicatie2. In dit geval kan een laesie op de achterblijvende streng de verlenging van een Okazaki-fragment blokkeren, maar vorkprogressie wordt op natuurlijke wijze gered door het volgende Okazaki-fragment, waardoor een ssDNA-opening achterblijft. Verdere studies toonden echter aan dat de vorming van gaten op de leidende streng ook mogelijk is, zoals voor het eerst aangetoond bij bacteriën5. In eukaryoten bleek PRIMPOL, een uniek DNA-polymerase met primase-activiteit, in staat om de DNA-synthese stroomafwaarts van een replicatieblokkerende laesie te herstarten door zijn repriming-activiteit 6,7,8,9,10,11. De PRIMPOL primase-activiteit kan dus de vorming van postreplicerende ssDNA-hiaten in de leidende streng verklaren bij behandeling met een DNA-beschadigend middel in menselijke cellen12. Niettemin vereiste de detectie van deze hiaten en het repareren van spleten tot voor kort indirecte of tijdrovende benaderingen zoals elektronenmicroscopie4 of op plasmide gebaseerde assays13. Het gebruik van het ssDNA-specifieke S1-nuclease om hiaten in menselijke cellen te detecteren, werd meer dan veertig jaar geleden gepionierd door vroege studies, met behulp van sucrosegradiënttechnieken 2,3. Meer recent heeft onze groep het gebruik van dit nuclease toegepast om ssDNA te detecteren bij het repliceren van DNA (post-replicatieve hiaten) met behulp van andere methoden zoals DNA-vezel en komeettests14. Deze nieuwe benaderingen maakten de weg vrij voor de huidige golf van studies over post-replicatieve hiaten. Hier beschrijven we een strategie van het gebruik van S1-nuclease om postreplicatieve ssDNA-hiaten te detecteren door DNA-vezeltest en leggen we uit hoe een differentieel etiketteringsschema in het DNA-vezelprotocol de studie van de reparatie van deze hiaten mogelijk kan maken.
De DNA-vezeltest is een krachtige techniek die door een groeiend aantal laboratoria is gebruikt en waardevolle inzichten heeft opgeleverd in replicatievorkdynamiek en replicatiestressresponsmechanismen. In het kort is deze techniek gebaseerd op de sequentiële opname van nucleotide-analogen (zoals CldU -5-chloor-2'-deoxyuridine- en IdU -5-jood-2'-deoxyuridine) in het replicerende DNA. Na het oogsten worden cellen gelyseerd en verspreiden DNA-moleculen zich op een positief gecoate glazen dia. CldU en IdU worden vervolgens gedetecteerd door specifieke antilichamen, die in een fluorescerende microscoop kunnen worden gevisualiseerd als tweekleurige vezels. Ten slotte worden de lengtes van de IdU- en CldU-kanalen gemeten om eventuele veranderingen in de DNA-replicatiedynamiek als gevolg van DNA-schade-inductie te identificeren. Deze techniek kan worden gebruikt om verschillende verschijnselen te onderzoeken, zoals vork stalling, vorkvertraging, ontluikende DNA-afbraak en variaties in de frequentie van oorsprong die wordt afgevuurd15,16.
Een beperking van de DNA-vezeltest is de resolutie van een paar kilobases. Omdat post-replicatieve ssDNA-hiaten zich in het bereik van honderden basen kunnen bevinden, is het onmogelijk om deze hiaten rechtstreeks te visualiseren met het standaard DNA-vezelprotocol. De aanwezigheid van ssDNA-hiaten bij het repliceren van DNA in menselijke cellen die zijn behandeld met genotoxische middelen is eerder indirect betrokken geweest. Bijvoorbeeld, de observatie van ssDNA zoals beoordeeld door rekrutering van het ssDNA-bindende eiwit, replicatie-eiwit A (RPA), in cellen buiten de S-fase, of de vorming van ssDNA zoals gedetecteerd door alkalische DNA-afwikkeling in combinatie met de afwezigheid van langdurige vorkblokkering door DNA-vezeltest 12,17,18,19,20,21 werd toegeschreven aan de accumulatie van ssDNA-hiaten. Bovendien induceren postreplicatieve ssDNA-hiaten een ATR-afhankelijk G2 / M-fasecontrolepunt en arresteren cellen behandeld met replicatiegif 18,19,20,21,22.
Het S1-nuclease degradeert enkelstrengs nucleïnezuren die 5'-fosforylmono- of oligonucleotiden afgeven en heeft een 5-keer hogere affiniteit met ssDNA in vergelijking met RNA. Dubbelstrengs nucleïnezuren (DNA:DNA, DNA:RNA of RNA:RNA) zijn resistent tegen het S1-nuclease, behalve wanneer ze in extreem hoge concentraties worden gebruikt. De S1-nuclease splijt ook dubbelstrengs DNA in het enkelstrengsgebied veroorzaakt door een nick, gap, mismatch of lus. Het S1-nuclease is dus een ssDNA-specifiek endonuclease dat in staat is om ssDNA-openingen te splijten, waardoor uiteindelijk dubbelstrengsbreukenvan 23,24 worden gegenereerd. Het toevoegen van stappen voor S1-nucleasevertering aan het DNA-vezelprotocol maakt dus indirect de detectie van postreplicatieve ssDNA-hiaten mogelijk. In aanwezigheid van hiaten zal de behandeling van blootgestelde kernen met het S1-nuclease voorafgaand aan DNA-verspreiding kortere kanalen genereren als gevolg van S1-splitsing van ssDNA die inherent aanwezig is bij hiaten14. Dienovereenkomstig is traktaatverkorting de uitlezing voor ssDNA-hiaten met behulp van deze aanpak. In vergelijking met het standaard DNA-vezelprotocol vereist de DNA-vezel met het S1-nuclease slechts twee extra stappen: blootstelling aan kernen (celpermeabilisatie) en behandeling met het S1-nuclease. Het is belangrijk op te merken dat passende controles verplicht zijn, zoals monsters die zijn behandeld met het genotoxische middel maar zonder het S1-nuclease en monsters die zijn behandeld met het S1-nuclease zonder het genotoxische middel. Het protocol zelf, inclusief de integratie van analogen, S1-behandeling en verspreiding, kan in één dag worden uitgevoerd en vereist geen uitzonderlijk materiaal. Het vereist alleen de thymidine-analogen, het gezuiverde S1-nuclease, de juiste primaire en secundaire antilichamen en een fluorescerende microscoop. Over het algemeen detecteert de DNA-vezel die de S1-nuclease gebruikt ssDNA-hiaten op lopende replicatievorken met behulp van een relatief eenvoudige aanpak.
De postreplicatieve ssDNA-hiaten die zijn gevormd als gevolg van replicatiestressresponsmechanismen kunnen worden gerepareerd (of opgevuld) door verschillende mechanismen, waaronder translesie-DNA-synthese of sjabloonschakeling, in een proces dat gap-filling of post-replication repair (PRR)25 wordt genoemd. Deze processen vinden plaats achter de voortschrijdende vorken, waarbij replicatie-onafhankelijke DNA-synthese 14,26,27 betrokken is. Op basis van deze bevindingen kan een etiketteringsschema worden uitgevoerd dat verschilt van de standaard DNA-vezeltest om gap-filling events in de G2-fase directte visualiseren 14,16,26,28. In het bijzonder kan één thymidine-analoog worden gebruikt om de replicatievork te labelen op het moment van genotoxische behandeling en postreplicatieve ssDNA-gapvorming, terwijl een ander thymidine-analoog kan worden gebruikt om gap-filling events te labelen. In dit protocol worden cellen gelabeld met een eerste thymidine-analoog (IdU, bijvoorbeeld) onmiddellijk na of gelijktijdig met genotoxische behandeling gedurende 1 uur, zodat het ontluikende DNA wordt gelabeld op het moment van gap-vorming. Nocodazol wordt toegevoegd na behandeling gedurende ergens tussen 12-24 uur om cellen in G2 / M te stoppen, waardoor de volgende S-fase wordt voorkomen. Voor de laatste 4 uur nocodazolbehandeling wordt een tweede thymidine-analoog (CldU, bijvoorbeeld) toegevoegd aan de media om te worden opgenomen tijdens het vullen van gaten. Belangrijk is dat deze test alleen kan worden gebruikt om gap-filling events in G2 te detecteren, omdat het gap-filling signaal van CldU niet kan worden onderscheiden van een signaal als gevolg van CldU-integratie in replicerend DNA in de S-fase. Daarom, om het achtergrondsignaal te minimaliseren, moet de timing van CldU-opname na schade-inductie samenvallen met wanneer het grootste deel van de celpopulatie de G2-fase14 binnengaat. Daarom zal deze timing variëren afhankelijk van de cellijn en de behandelingsomstandigheden. Het optimaliseren van de progressie van de celcyclus voorafgaand aan het gebruik van deze test wordt geadviseerd. Co-kleuring van deze thymidine-analogen maakt de visualisatie mogelijk van gap-filling (PRR) tracts (CldU-patches) bovenop ontluikend DNA (IdU-kanalen) gesynthetiseerd tijdens de genotoxische behandeling wanneer ssDNA-hiaten werden gegenereerd.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid, Glacial</td>
			<td>Synth</td>
			<td>64-19-7</td>
			<td>Alternatively, BSA - Biosera - REF PM-T1725/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium hydroxide</td>
			<td>Synth</td>
			<td>1336-21-6</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody anti-mouse IgG1 Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11005</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody anti-rat Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21470</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody Mouse anti-BrdU</td>
			<td>Becton Disckson</td>
			<td>347580</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody Rat anti-BrdU</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>&#160;Ab6326</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological security hood</td>
			<td>Pachane</td>
			<td>PA 410</td>
			<td>Use hood present in the laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (Bovine Serum Albumin)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3294</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>179693</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CldU</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>C6891</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cloridric acid</td>
			<td>Synth</td>
			<td>7647-01-0</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Zeiss LSM Series (7, 8 or 9)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass (or coverslips)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>152460</td>
			<td>Alternatively, Olen - Kasvi Cover Glass (24 x 60 mm) - K5-2460</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM - High Glucose</td>
			<td>LGC/Gibco</td>
			<td>BR30211-05/12100046</td>
			<td>Use culture media specific for the cell line used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E5314</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence Microscope Axiovert 200</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12657-029</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forma Series II Water Jacketed CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific 3110</td>
			<td>13-998-074</td>
			<td>Use cell incubator present in the laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide jar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5516</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Idu</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>I7125</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Synth</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>67-56-1</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Denville</td>
			<td>M1021</td>
			<td>Alternatively, Olen - Kasvi Microscope Slides - K5-7105 OR Precision Glass Line - 7105-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS (&#193;cido 3-morfolinopropano 1-sulf&#244;nico)</td>
			<td>Synth</td>
			<td>1132-61-2</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nocodazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31430-18-9</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate Buffer Saline)</td>
			<td>Life Thechnologies</td>
			<td>3002</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold AntiFade Mountant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36930</td>
			<td>Any antifade moutant solution for immunofluorescence could be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S1 nuclease purified from Aspergillus oryzae</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18001-016</td>
			<td>Pre-dilute the S1 nuclease (1/100 - 1/200) in S1 nuclease dilution buffer provided by the manufacturer, aliquote and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0302</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate Trihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>6131-90-4</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Synth</td>
			<td>&#160;7647-14-5</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>57-50-1</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>West Lab Research</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Synth</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200072</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UVC Lamp</td>
			<td>Non Specific</td>
			<td>-</td>
			<td>Essential: emission lenght of 254 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VLX-3W UV Radiometer</td>
			<td>Vilber Loumart</td>
			<td>-</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>557-34-6</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of post-replicative gaps accumulation and repair in human cells using the dna fiber assay

De DNA-vezeltest is een eenvoudige en robuuste methode voor de analyse van replicatievorkdynamica, gebaseerd op de immunodetectie van nucleotide-analogen die worden opgenomen tijdens DNA-synthese in menselijke cellen. Deze techniek heeft echter een beperkte resolutie van een paar duizend kilobases. Bijgevolg zijn post-replicatieve enkelstrengs DNA (ssDNA) gaten zo klein als een paar honderd basen niet detecteerbaar door de standaardtest. Hier beschrijven we een gemodificeerde versie van de DNA-vezeltest die gebruik maakt van de S1-nuclease, een enzym dat specifiek ssDNA splitst. In aanwezigheid van post-replicatieve ssDNA-openingen zal het S1-nuclease de openingen richten en splitsen, waardoor kortere tracties worden gegenereerd die kunnen worden gebruikt als uitlezing voor ssDNA-hiaten op lopende vorken. Deze post-replicatieve ssDNA-hiaten worden gevormd wanneer beschadigd DNA continu wordt gerepliceerd. Ze kunnen worden gerepareerd via mechanismen die zijn losgekoppeld van genoomreplicatie, in een proces dat bekend staat als gap-filling of post-replicative repair. Omdat gap-filling mechanismen DNA-synthese onafhankelijk van de S-fase omvatten, kunnen wijzigingen in het DNA-vezeletiketteringsschema ook worden gebruikt om gap-filling events te monitoren. Al met al zijn deze modificaties van de DNA-vezeltest krachtige strategieën om te begrijpen hoe post-replicatieve hiaten worden gevormd en opgevuld in het genoom van menselijke cellen.

In de S1 Fiber-assay, als behandeling met een genotoxisch middel leidt tot post-replicatieve ssDNA-hiaten, zullen de totale lengtes van DNA-vezels uit met S1 behandelde kernen korter zijn bij behandeling met DNA-schade in vergelijking met onbehandelde monsters en monsters die werden behandeld met het genotoxische middel, maar niet werden onderworpen aan S1-splitsing (figuur 1).
Als alternatief, als behandeling met het S1-nuclease de lengte van DNA-vezels in vergel...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Post-Replicative Gaps Accumulation and Repair in Human Cells Using the DNA Fiber Assay at JoVE.com

Detection of Post-Replicative Gaps Accumulation and Repair in Human Cells Using the DNA Fiber Assay

Hier beschrijven we twee modificaties van de DNA-vezeltest om enkelstrengs DNA-hiaten te onderzoeken bij het repliceren van DNA na laesie-inductie. De S1-vezeltest maakt de detectie van post-replicatieve hiaten mogelijk met behulp van het ssDNA-specifieke S1-endonuclease, terwijl de gap-filling assay visualisatie en kwantificering van gap repair mogelijk maakt.

Detectie van post-replicatieve hiaten accumulatie en reparatie in menselijke cellen met behulp van de DNA-vezeltest

The DNA fiber assay is a simple and robust method for the analysis of replication fork dynamics, based on the immunodetection of nucleotide analogs that ...

Ons protocol opent nieuwe mogelijkheden om te onderzoeken hoe replicatie plaatsvindt op beschadigd DNA. De technieken kunnen de vorming en reparatie van enkelstrengs DNA-hiaten detecteren, tegenover de DNA-laesie. Het S1-nuclease splijt het enkelstrengs DNA en maakt de detectie van postreplicatieve hiaten mogelijk.Deze aanpak werd voor het eerst gebruikt door Dr. Meneghini en Dr. Cordiero-Stone in de jaren 1970 in Brazilië en onlangs door ons aangepast aan de DNA-vezeltest. Het gebruik van de hier beschreven techniek om de vorming en reparatie van post-replicatieve hiaten te bestuderen, kan inzicht geven in het mechanisme van DNA-reparatie en replicatiestressrespons die de integriteit van het genoom behouden. Voor beide hier beschreven protocollen, de S1-vezel en de gap-filling assays, is het cruciaal om alle controles op te nemen om een nauwkeurige interpretatie van de gegevens te garanderen.De procedure zal worden gedemonstreerd door Davi J.Martins, een promovendus uit ons lab, en Dr.Annabel Quinet, een medewerker die deze technieken eerder ontwikkelde toen hij in onze groep werkte. Om te beginnen, adem de kweekmedia op en voeg onmiddellijk de kweekmedia met 20-micromolaire IDU-media toe aan de cellen. Incubeer de cellen bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide gedurende precies 20 minuten.Was vervolgens de cellen snel twee keer met voorverwarmd PBS en bestraal ze met 20 joule per vierkante meter UV-C. Gebruik onbehandelde cellen als besturingselementen. Voeg onmiddellijk de media met 200-micromolaire CldU toe aan de cellen en incubeer ze bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide gedurende precies 60 minuten.Was daarna de cellen twee keer met voorverwarmd PBS en permeabiliseer ze met de CSK 100-buffer gedurende twee tot 10 minuten volgens de cellijn bij kamertemperatuur. Na CSK-permeabilisatie kunnen de kernen met bijna geen cytoplasma worden gezien in vergelijking met die vóór de permeabilisatie. Giet PBS voorzichtig langs de zijkant van elke put om de kernen met PBS te wassen.Was vervolgens de kernen met S1-buffer. Incubeer de kernen in de S1-buffer met 20 eenheden per milliliter S1-nuclease en zonder het S1-nuclease gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius. Zuig vervolgens de S1-buffer op en voeg 0,1% BSA toe in PBS.Schraap de kernen en breng ze over in een ongeveer geannoteerde buis van 1,5 milliliter. Houd de buizen de hele tijd op ijs. Centrifugeer de kernen op ongeveer 4.600 keer G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius.Resuspendeer de pellets in PBS in een concentratie van ongeveer 1.500 cellen per microliter. Plaats de buisjes op ijs en ga onmiddellijk over tot DNA-vezelvoorbereiding door het verspreiden van het protocol. Annoteer de microscoopglaasjes met een carbonpotlood en leg ze plat op een dienblad.Tik op de onderkant van de buis om homogenisatie te garanderen en voeg twee microliter cellen toe aan de bovenkant van de bijbehorende dia. Voeg zes microliter van de lysisbuffer toe en lyseer de cellen door ongeveer vijf keer op en neer te pipetteren. Gebruik de pipetpunt om de druppel iets naar de bodem van de glijbaan te trekken en incubeer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur om de kernen te lyseren.Kantel de glijbaan op ongeveer 20 tot 40 graden en laat de druppel zich met een constante lage snelheid naar de bodem van de glijbaan verspreiden. Laat de glijbaan 10 tot 15 minuten drogen bij kamertemperatuur in het donker. Dompel ze vervolgens onder in een pot met de vers bereide fixatieoplossing en incubeer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur om DNA op de dia's te fixeren.Was de dia's tweemaal met PBS gedurende vijf minuten en denatureer het DNA met vers bereid 2,5 molair cloridrinezuur gedurende 40 tot 60 minuten bij kamertemperatuur. Was de dia's drie keer met PBS gedurende vijf minuten en blok met 5% BSA die eerder 30 tot 60 minuten was opgewarmd bij 37 graden Celsius. Tik voorzichtig op het papier om de overtollige vloeistof van de dia's te verwijderen.Voeg druppelsgewijs 30 microliter primaire antilichamen toe aan de dia's en plaats er een afdekslip op. Incubeer gedurende 1 tot 1,5 uur bij kamertemperatuur in een donkere, vochtige kamer. Plaats de dia's één tot twee minuten in een pot met PBS en verwijder vervolgens voorzichtig de afdekslipjes.Was met PBST drie keer vijf minuten in een pot en plaats de dia's in PBS. Verwijder de overtollige vloeistof door zachtjes op een papier te tikken en voeg druppelsgewijs 30 microliter van de secundaire antilichamen toe aan de dia's. Leg er een afdekslip op.Incubeer gedurende 45 tot 60 minuten bij kamertemperatuur in een donkere en vochtige kamer. Herhaal de stappen voor het wassen van de dia's en het verwijderen van het overtollige PBS nogmaals en voeg 20 microliter van het montagereagens druppelsgewijs toe aan de dia's. Plaats er een hoeslip op en vermijd bubbels.Plaats een druppel dompelolie in de buurt van de bovenkant van de dia waar de cellen zijn gelyseerd. Gebruik het groene kanaal en zoek de groene stippen op de achtergrond om de focus te vinden. Open de Leica Application Suite software, klik op Acquire en selecteer het groene kanaal.Pas de instellingen van het groene kanaal aan vóór de analyse. Ga vervolgens naar het rode kanaal en pas de instellingen aan. Zoek de belangrijkste concentratie vezels en ga naar de randen om de goed verspreide, niet-overlappende, individuele vezels te vinden.Gebruik slechts één kanaal om de gebieden voor de foto's te selecteren en mogelijke vertekeningen te voorkomen. Klik op het pictogram Overlay verwerven en pas de software aan voor de juiste microscoopvergroting. Maak ongeveer 15 tot 20 foto's per dia naast de hele dia bij het groene kanaal en vervolgens bij het rode kanaal.De twee kanalen zijn nu samengevoegd en de gemaakte overlay wordt verplaatst naar een unieke map. Het is mogelijk om de vezels te zien met rode en groene kleuren. Open de ImageJ-software, klik met de linkermuisknop op het vijfde pictogram, selecteer de tweede optie en selecteer vervolgens het gereedschap Gesegmenteerde lijn.Klik met de linkermuisknop om het exacte pad van het rode of groene traktaat te tekenen en klik met de rechtermuisknop om de tekening te stoppen. Druk op de M-knop op het toetsenbord om de lengte te meten. Houd voor de S1-vezel de rode en groene traktaatmetingen voor elke vezel bij en meet rode en groene traktaatlengtes van ten minste 150 vezels uit verschillende afbeeldingen.Een S1-vezel wordt getoond in deze representatieve afbeeldingen. Controle-ontluikend DNA-kanaal zonder de openingen en ongevoelig voor splitsing door de S1-nuclease wordt hier getoond. DNA-tractus positief voor gaten die door het S1-nuclease werden gesplitst, resulteerde in een kortere CldU-tractuslengte.Een differentieel etiketteringsschema dat uitgebreid in het tekstmanuscript wordt beschreven, kan worden uitgevoerd om gap-filling events te labelen. In deze assay, genaamd gap-filling assay, komen langere IDU-tracks met ten minste één CldU-patch of minder CldU-patches overeen met een lage gap-filling density. Kortere IDU-tracts, met ten minste één CldU-patch, en langere IDU-tracts met meer CldU-patches, komen overeen met een hoge gap-filling density.De permeabilisatiestap van dit protocol is cruciaal voor het S1-nuclease om in te werken op de hiaten die zijn gevormd tijdens de replicatie van beschadigd DNA. De S1-nuclease kan ook worden gebruikt in het komeettestprotocol om de hiaten te detecteren die zijn gevormd tijdens de replicatie van beschadigd DNA dat na de behandeling blijft bestaan. De S1-vezeltest maakte de weg vrij voor het nieuwe paradigma dat post-replicatieve hiaten kwetsbaarheid voor kanker kunnen veroorzaken, met name bij borst- en eierstokkankers met mutaties in BRCA1- en 2-genen.

Research

JoVE Journal

Genetics

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detectie van Copy Number Wijzigingen met behulp van Single Cell Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Atomic Force Microscopy Investigations of DNA Lesion Recognition in Nucleotide Excision Repair

Atomic Force Microscopy Onderzoek naar DNA Lesion Recognition in Nucleotide Excision Repair

AFM imaging is a powerful technique for the study of protein-DNA interactions. This single molecule method allows the simultaneous resolution of different ...

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

Immunokleuring voor DNA wijzigingen: computationele analyse van Confocal beelden

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Hoogefficiënte Gene verstoring van lymfkliertest en menselijke hematopoïetische voorlopercellen door CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

A Simple, Rapid, and Quantitative Assay to Measure Repair of DNA-protein Crosslinks on Plasmids Transfected into Mammalian Cells

Een eenvoudige, snelle en kwantitatieve bepaling aan maatregel reparatie van DNA-proteïne Crosslinks op plasmiden Transfected in zoogdiercellen

The purpose of this method is to provide a flexible, rapid, and quantitative technique to examine the kinetics of DNA-protein crosslink (DPC) repair in ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Zeldzame gebeurtenis detectie met behulp van fout-gecorrigeerd DNA en RNA Sequencing

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Methodologie voor nauwkeurige detectie van mitochondriaal DNA methylatie

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

ATAC-seq Assay with Low Mitochondrial DNA Contamination from Primary Human CD4+ T Lymphocytes

ATAC-seq Assay met lage mitochondriaal DNA besmetting van primaire menselijke CD4 + T lymfocyten

ATAC-seq has become a widely used methodology in the study of epigenetics due to its rapid and simple approach to mapping genome-wide accessible ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay Using Micrococcal Nucleases in Mammalian Cells

Chromatische immunoprecipitatie test met behulp van Micrococcal nucleasen in zoogdiercellen

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene ...

Use of Frozen Tissue in the Comet Assay for the Evaluation of DNA Damage

Gebruik van bevroren weefsel in de Komeet Assay voor de evaluatie van DNA-schade

The comet assay is gaining popularity as a means to assess DNA damage in cultured cells and tissues, particularly following exposure to chemicals or other ...