Name: detection of post-replicative gaps accumulation and repair in human cells using the dna fiber assay
Uploaded: 2022-02-03T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Post-Replicative Gaps Accumulation and Repair in Human Cells Using the DNA Fiber Assay at JoVE.com

Die Arbeit im C.F.M.M.-Labor wird von der Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, São Paulo, Brasilien, Grants #2019/19435-3, #2013/08028-1 und 2017/05680-0) im Rahmen der International Collaboration Research von FAPESP und der Niederländischen Organisation für wissenschaftliche Forschung (NWO, Niederlande) unterstützt; Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, Brasília, DF, Brazil, Grants # 308868/2018-8] und Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal do Ensino Superior (CAPES, Brasília, DF, Brazil, Finance Code 001).

Da die Studie menschliche Zellen verwendet, wurde die Arbeit von der Ethikkommission des Instituts für Biomedizinische Wissenschaften an der Universität von São Paulo (ICB-USP, Zulassungsnummer # 48347515.3.00005467) für die Forschung mit menschlichen Proben genehmigt.
HINWEIS: Die hier beschriebenen Protokolle wurden in früheren Veröffentlichungen mit geringfügigen Änderungen14,16,28 verwende...

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	<li>Rupp, W. D., Howard-Flanders, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discontinuities+in+the+DNA+synthesized+in+an+excision-defective+strain+of+Escherichia+coli+following+ultraviolet+irradiation.">Discontinuities in the DNA synthesized in an excision-defective strain of Escherichia coli following ultraviolet irradiation.</a> Journal of Molecular Biology. 31 (2), 291-304 (1968).</li><li>Meneghini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gaps+in+DNA+synthesized+by+ultraviolet+light-irradiated+WI38+human+cells.">Gaps in DNA synthesized by ultraviolet light-irradiated WI38 human cells.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 425 (4), 419-427 (1976).</li><li>Meneghini, R., Cordeiro-Stone, M., Schumacher, R. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redundancy+of+mammalian+Y+family+DNA+polymerases+in+cellular+responses+to+genomic+DNA+lesions+induced+by+ultraviolet+light.">Redundancy of mammalian Y family DNA polymerases in cellular responses to genomic DNA lesions induced by ultraviolet light.</a> Nucleic Acids Research. 42 (17), 11071 (2014).</li><li>Quinet, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap-filling+and+bypass+at+the+replication+fork+are+both+active+mechanisms+for+tolerance+of+low-dose+ultraviolet-induced+DNA+damage+in+the+human+genome.">Gap-filling and bypass at the replication fork are both active mechanisms for tolerance of low-dose ultraviolet-induced DNA damage in the human genome.</a> DNA Repair. 14 (1), 27-38 (2014).</li><li>Callegari, A. J., Clark, E., Pneuman, A., Kelly, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postreplication+gaps+at+UV+lesions+are+signals+for+checkpoint+activation.">Postreplication gaps at UV lesions are signals for checkpoint activation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (18), 8219-8224 (2010).</li><li>Vogt, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+further+properties+of+single-strand-specific+nuclease+from+Aspergillus+oryzae.">Purification and further properties of single-strand-specific nuclease from Aspergillus oryzae.</a> European Journal of Biochemistry. 33 (1), 192-200 (1973).</li><li>Cordeiro-Stone, M., Schumacher, R. 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E., Lyn-Cook, L. E., Davis, K. J., Manjanatha, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+alkaline+comet+assay+and+enzyme-modified+alkaline+comet+assay+for+measuring+DNA+strand+breaks+and+oxidative+DNA+damage+in+rat+liver.">In vivo alkaline comet assay and enzyme-modified alkaline comet assay for measuring DNA strand breaks and oxidative DNA damage in rat liver.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (111), e53833 (2016).</li><li>Lu, Y., Liu, Y., Yang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+in+vitro+DNA+damage+using+comet+assay.">Evaluating in vitro DNA damage using comet assay.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (128), e56450 (2017).</li></ol>

Kritische Schritte des Standard-DNA-Faser-Assay-Protokolls wurden in einer früheren Publikationdiskutiert 32. Hier beschreiben wir modifizierte Versionen des Standard-DNA-Faser-Assays, um das Vorhandensein von postreplizierenden ssDNA-Lücken sowie deren Reparatur durch Lückenfüllung zu untersuchen, die ursprünglich in14 beschrieben wurden. Im Zusammenhang mit der postreplizierenden Präsenz von ssDNA-Lücken wäre die Verwendung der S1-Nuklease im S1-Faserprotokoll hö...

Bahnbrechende Arbeiten haben Hinweise auf die Anhäufung von postreplizierenden einzelsträngigen (ssDNA) Lücken bei der Behandlung mit DNA-schädigenden Wirkstoffen in Bakterien 1 und menschlichen Zellen 2,3 geliefert. Während der Replikation beschädigter DNA-Vorlagen kann die DNA-Synthese-Maschinerie die Läsionen umgehen, indem sie spezifische Transläsionssynthese-DNA-Polymerasen oder durch Template-Switching-Mechanismen verwendet. Alternativ kann das Replisom auch einfach die Läsion überspringen und eine ssDNA-Lücke hinterlassen, die später repariert werden soll. In jüngerer Zeit zeigte eine Studie deutlich, dass die Behandlung mit genotoxischen Wirkstoffen zu ssDNA-Lücken in Eukaryoten führt, indem Elektronenmikroskopie verwendet wird, um die spezifische Struktur von Replikationszwischenprodukten zu visualisieren4. Die Bildung dieser Regionen postreplikativer Lücken wurde ursprünglich als einfaches Ergebnis des semi-diskontinuierlichen Modus der DNA-Replikationvorgeschlagen 2. In diesem Fall kann eine Läsion am nachlaufenden Strang die Verlängerung eines Okazaki-Fragments blockieren, aber die Gabelprogression wird natürlich durch das folgende Okazaki-Fragment gerettet und hinterlässt eine ssDNA-Lücke. Weitere Studien zeigten jedoch, dass auch die Bildung von Lücken am führenden Strang möglich ist, wie erstmals bei Bakteriengezeigt wurde 5. In Eukaryoten wurde gezeigt, dass PRIMPOL, eine einzigartige DNA-Polymerase mit Primase-Aktivität, in der Lage ist, die DNA-Synthese stromabwärts einer replikationsblockierenden Läsion durch ihre Zurechtweisungsaktivität 6,7,8,9,10,11 wieder aufzunehmen. Somit kann die PRIMPOL-Primase-Aktivität die Bildung von postreplizierenden ssDNA-Lücken im führenden Strang bei der Behandlung mit einem DNA-schädigenden Wirkstoff in menschlichen Zellenerklären 12. Dennoch erforderte der Nachweis dieser Lücken sowie die Lückenreparatur bis vor kurzem indirekte oder zeitaufwändige Ansätze wie Elektronenmikroskopie4 oder plasmidbasierte Assays13. Die Verwendung der ssDNA-spezifischen S1-Nuklease zum Nachweis von Lücken in menschlichen Zellen wurde vor mehr als vierzig Jahren durch frühe Studien unter Verwendung von Saccharosegradiententechnikenvorangetrieben 2,3. In jüngerer Zeit wandte unsere Gruppe die Verwendung dieser Nuklease an, um ssDNA bei der Replikation von DNA (postreplizierte Lücken) mit anderen Methoden wie DNA-Faser- und Kometenassays14 nachzuweisen. Diese neuen Ansätze ebneten den Weg für die aktuelle Welle von Studien zu postreplizierenden Lücken. Hier beschreiben wir eine Strategie der Verwendung von S1-Nuklease zum Nachweis postreplizierter ssDNA-Lücken durch DNA-Faserassay und erklären, wie ein differentielles Markierungsschema im DNA-Faserprotokoll die Untersuchung der Reparatur dieser Lücken ermöglichen kann.
Der DNA-Faser-Assay ist eine leistungsstarke Technik, die von einer wachsenden Anzahl von Labors eingesetzt wurde und wertvolle Einblicke in die Replikationsgabeldynamik und die Replikationsstressreaktionsmechanismen geliefert hat. Kurz gesagt, diese Technik basiert auf dem sequentiellen Einbau von Nukleotidanaloga (wie CldU-5-Chlor-2'-desoxyuridin- und IdU-5-Jod-2'-desoxyuridin) in die replizierende DNA. Nach der Ernte werden Zellen lysiert und DNA-Moleküle auf einem positiv beschichteten Glasobjektträger verteilt. CldU und IdU werden dann durch spezifische Antikörper nachgewiesen, die in einem fluoreszierenden Mikroskop als zweifarbige Fasern sichtbar gemacht werden können. Schließlich werden die Längen der IdU- und CldU-Trakte gemessen, um Veränderungen der DNA-Replikationsdynamik als Folge der DNA-Schadensinduktion zu identifizieren. Diese Technik kann verwendet werden, um verschiedene Phänomene zu untersuchen, wie z.B. Gabelabriss, Gabelverlangsamung, entstehender DNA-Abbau und Variationen in der Häufigkeit des Ursprungsfeuers15,16.
Eine Einschränkung des DNA-Faser-Assays ist seine Auflösung von wenigen Kilobasen. Da postreplizierte ssDNA-Lücken im Bereich von Hunderten von Basen liegen können, ist es unmöglich, diese Lücken direkt mit dem Standard-DNA-Faserprotokoll zu visualisieren. Das Vorhandensein von ssDNA-Lücken auf replizierender DNA in menschlichen Zellen, die mit genotoxischen Wirkstoffen behandelt wurden, wurde bereits indirekt in Verbindung gebracht. Zum Beispiel die Beobachtung von ssDNA, wie sie durch Rekrutierung des ssDNA-bindenden Proteins, des Replikationsproteins A (RPA), in Zellen außerhalb der S-Phase bewertet wird, oder die Bildung von ssDNA, wie sie durch alkalische DNA-Abwicklung nachgewiesen wird, kombiniert mit dem Fehlen eines längeren Gabelstopps durch DNA-Faserassay 12,17,18,19,20,21 wurde auf die Anhäufung von ssDNA-Lücken zurückgeführt. Darüber hinaus induzieren postreplizierte ssDNA-Lücken einen ATR-abhängigen G2/M-Phasen-Checkpoint und blockieren Zellen, die mit Replikationsgiften 18,19,20,21,22 behandelt wurden.
Die S1-Nuklease baut einzelsträngige Nukleinsäuren unter Freisetzung von 5'-Phosphorylmono- oder Oligonukleotiden ab und hat im Vergleich zu RNA eine 5-mal höhere Affinität zu ssDNA. Doppelsträngige Nukleinsäuren (DNA:DNA, DNA:RNA oder RNA:RNA) sind resistent gegen die S1-Nuklease, außer wenn sie in extrem hohen Konzentrationen eingesetzt werden. Die S1-Nuklease spaltet auch doppelsträngige DNA in der einzelsträngigen Region, die durch einen Nick, eine Lücke, eine Fehlanpassung oder eine Schleife verursacht wird. Die S1-Nuklease ist somit eine ssDNA-spezifische Endonuklease, die in der Lage ist, ssDNA-Lücken zu spalten und letztendlich doppelsträngige Brüche23,24 zu erzeugen. Das Hinzufügen von Schritten für den S1-Nuklease-Aufschluss zum DNA-Faserprotokoll ermöglicht daher indirekt den Nachweis von postreplizierenden ssDNA-Lücken. In Gegenwart von Lücken erzeugt die Behandlung von exponierten Kernen mit der S1-Nuklease vor der DNA-Ausbreitung kürzere Bahnen als Folge der S1-Spaltung der ssDNA, die von Natur aus in Lücken14 vorhanden ist. Dementsprechend ist die Traktverkürzung das Auslesen von ssDNA-Lücken mit diesem Ansatz. Im Vergleich zum Standard-DNA-Faserprotokoll benötigt die DNA-Faser mit der S1-Nuklease nur zwei zusätzliche Schritte: Kernexposition (Zellpermeabilisierung) und Behandlung mit der S1-Nuklease. Es ist wichtig zu beachten, dass geeignete Kontrollen obligatorisch sind, z. B. Proben, die mit dem genotoxischen Mittel, aber ohne die S1-Nuklease behandelt wurden, und Proben, die mit der S1-Nuklease ohne das genotoxische Mittel behandelt wurden. Das Protokoll selbst, einschließlich der Einbeziehung von Analoga, der S1-Behandlung und der Ausbreitung, kann an einem Tag durchgeführt werden und erfordert kein außergewöhnliches Material. Es benötigt nur die Thymidin-Analoga, die gereinigte S1-Nuklease, die entsprechenden primären und sekundären Antikörper und ein fluoreszierendes Mikroskop. Insgesamt erkennt die DNA-Faser, die die S1-Nuklease verwendet, ssDNA-Lücken auf laufenden Replikationsgabeln mit einem relativ einfachen Ansatz.
Die postreplizierten ssDNA-Lücken, die als Folge von Replikations-Stress-Response-Mechanismen gebildet werden, können durch verschiedene Mechanismen, einschließlich Transläsions-DNA-Synthese oder Template-Switching, in einem Prozess namens Gap-Filling oder Post-Replication Repair (PRR)25 repariert (oder gefüllt) werden. Diese Prozesse finden hinter den vorrückenden Gabeln statt und beinhalten eine replikationsunabhängige DNA-Synthese 14,26,27. Basierend auf diesen Ergebnissen kann ein Markierungsschema durchgeführt werden, das sich vom Standard-DNA-Faserassay unterscheidet, um lückenfüllende Ereignisse in der G2-Phase direkt zu visualisieren 14,16,26,28. Insbesondere kann ein Thymidinanalogon verwendet werden, um die Replikationsgabel zum Zeitpunkt der genotoxischen Behandlung und der postreplizierenden ssDNA-Lückenbildung zu markieren, während ein anderes Thymidinanalogon verwendet werden kann, um lückenfüllende Ereignisse zu markieren. In diesem Protokoll werden die Zellen unmittelbar nach oder gleichzeitig mit einer genotoxischen Behandlung für 1 h mit einem ersten Thymidinanalogon (z. B. IdU) markiert, so dass die entstehende DNA zum Zeitpunkt der Lückenbildung markiert wird. Nocodazol wird bei der Behandlung zwischen 12 und 24 h hinzugefügt, um Zellen in G2 / M zu stoppen und die folgende S-Phase zu verhindern. Für die letzten 4 h der Nocodazol-Behandlung wird dem Medium, das beim Lückenfüllen eingearbeitet werden soll, ein zweites Thymidinanalogon (z. B. CldU) zugesetzt. Wichtig ist, dass dieser Assay nur verwendet werden kann, um lückenfüllende Ereignisse in G2 zu erkennen, da das lückenfüllende Signal von CldU aufgrund der Einarbeitung von CldU in die replizierende DNA in der S-Phase nicht von einem Signal unterschieden werden kann. Um das Hintergrundsignal zu minimieren, sollte daher der Zeitpunkt der CldU-Inkorporation nach Schadensinduktion mit dem Zeitpunkt zusammenfallen, zu dem der größte Teil der Zellpopulation in die G2-Phase14 eintritt. Daher variiert dieser Zeitpunkt je nach Zelllinie und Behandlungsbedingungen. Es wird empfohlen, die Progression des Zellzyklus vor der Anwendung dieses Assays zu optimieren. Die Co-Färbung dieser Thymidin-Analoga ermöglicht die Visualisierung von lückenfüllenden (PRR) Trakten (CldU-Pflastern) auf aufkeimender DNA (IdU-Trakte), die während der genotoxischen Behandlung synthetisiert wurden, wenn ssDNA-Lücken erzeugt wurden.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid, Glacial</td>
			<td>Synth</td>
			<td>64-19-7</td>
			<td>Alternatively, BSA - Biosera - REF PM-T1725/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium hydroxide</td>
			<td>Synth</td>
			<td>1336-21-6</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody anti-mouse IgG1 Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11005</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody anti-rat Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21470</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody Mouse anti-BrdU</td>
			<td>Becton Disckson</td>
			<td>347580</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody Rat anti-BrdU</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>&#160;Ab6326</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological security hood</td>
			<td>Pachane</td>
			<td>PA 410</td>
			<td>Use hood present in the laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (Bovine Serum Albumin)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3294</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>179693</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CldU</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>C6891</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cloridric acid</td>
			<td>Synth</td>
			<td>7647-01-0</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Zeiss LSM Series (7, 8 or 9)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass (or coverslips)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>152460</td>
			<td>Alternatively, Olen - Kasvi Cover Glass (24 x 60 mm) - K5-2460</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM - High Glucose</td>
			<td>LGC/Gibco</td>
			<td>BR30211-05/12100046</td>
			<td>Use culture media specific for the cell line used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E5314</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence Microscope Axiovert 200</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12657-029</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forma Series II Water Jacketed CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific 3110</td>
			<td>13-998-074</td>
			<td>Use cell incubator present in the laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide jar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5516</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Idu</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>I7125</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Synth</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>67-56-1</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Denville</td>
			<td>M1021</td>
			<td>Alternatively, Olen - Kasvi Microscope Slides - K5-7105 OR Precision Glass Line - 7105-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS (&#193;cido 3-morfolinopropano 1-sulf&#244;nico)</td>
			<td>Synth</td>
			<td>1132-61-2</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nocodazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31430-18-9</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate Buffer Saline)</td>
			<td>Life Thechnologies</td>
			<td>3002</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold AntiFade Mountant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36930</td>
			<td>Any antifade moutant solution for immunofluorescence could be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S1 nuclease purified from Aspergillus oryzae</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18001-016</td>
			<td>Pre-dilute the S1 nuclease (1/100 - 1/200) in S1 nuclease dilution buffer provided by the manufacturer, aliquote and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0302</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate Trihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>6131-90-4</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Synth</td>
			<td>&#160;7647-14-5</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>57-50-1</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>West Lab Research</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Synth</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200072</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UVC Lamp</td>
			<td>Non Specific</td>
			<td>-</td>
			<td>Essential: emission lenght of 254 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VLX-3W UV Radiometer</td>
			<td>Vilber Loumart</td>
			<td>-</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>557-34-6</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of post-replicative gaps accumulation and repair in human cells using the dna fiber assay

Der DNA-Faser-Assay ist eine einfache und robuste Methode zur Analyse der Replikationsgabeldynamik, basierend auf dem Immunnachweis von Nukleotidanaloga, die während der DNA-Synthese in menschliche Zellen eingebaut werden. Diese Technik hat jedoch eine begrenzte Auflösung von einigen tausend Kilobasen. Folglich sind postreplizierte einzelsträngige DNA-Lücken (ssDNA), die so klein wie einige hundert Basen sind, mit dem Standardassay nicht nachweisbar. Hier beschreiben wir eine modifizierte Version des DNA-Faserassays, der die S1-Nuklease verwendet, ein Enzym, das speziell ssDNA spaltet. In Gegenwart von postreplizierenden ssDNA-Lücken zielt die S1-Nuklease auf die Lücken ab und spaltet sie, wodurch kürzere Traktate erzeugt werden, die als Auslesevorgang für ssDNA-Lücken auf laufenden Gabeln verwendet werden können. Diese postreplizierenden ssDNA-Lücken entstehen, wenn beschädigte DNA diskontinuierlich repliziert wird. Sie können über Mechanismen repariert werden, die von der Genomreplikation entkoppelt sind, in einem Prozess, der als lückenfüllende oder postreplizierte Reparatur bekannt ist. Da lückenfüllende Mechanismen eine DNA-Synthese unabhängig von der S-Phase beinhalten, können auch Änderungen im DNA-Fasermarkierungsschema verwendet werden, um lückenfüllende Ereignisse zu überwachen. Insgesamt sind diese Modifikationen des DNA-Faser-Assays mächtige Strategien, um zu verstehen, wie postreplizierende Lücken im Genom menschlicher Zellen gebildet und gefüllt werden.

Wenn im S1-Faser-Assay die Behandlung mit einem genotoxischen Wirkstoff zu postreplizierenden ssDNA-Lücken führt, sind die Gesamtlängen der DNA-Fasern aus S1-behandelten Kernen bei der Behandlung mit DNA-Schäden kürzer als bei unbehandelten Proben sowie bei Proben, die mit dem genotoxischen Mittel behandelt wurden, aber keiner S1-Spaltung unterzogen wurden (Abbildung 1).
Alternativ, wenn die Behandlung mit der S1-Nuklease die Länge der DNA-Fasern im Vergleic...

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Detection of Post-Replicative Gaps Accumulation and Repair in Human Cells Using the DNA Fiber Assay

Hier beschreiben wir zwei Modifikationen des DNA-Faserassays zur Untersuchung einzelsträngiger DNA-Lücken bei der Replikation von DNA nach Läsionsinduktion. Der S1-Faserassay ermöglicht die Detektion von postreplizierenden Lücken mit der ssDNA-spezifischen S1-Endonuklease, während der lückenfüllende Assay die Visualisierung und Quantifizierung der Spaltreparatur ermöglicht.

Nachweis der postreplizierenden Lückenakkumulation und -reparatur in menschlichen Zellen mit dem DNA-Faser-Assay

The DNA fiber assay is a simple and robust method for the analysis of replication fork dynamics, based on the immunodetection of nucleotide analogs that ...

Unser Protokoll eröffnet neue Möglichkeiten, um zu untersuchen, wie die Replikation auf beschädigter DNA abläuft. Die Techniken können die Bildung und Reparatur von einzelsträngigen DNA-Lücken gegenüber der DNA-Läsion nachweisen. Die S1-Nuklease spaltet die einzelsträngige DNA und ermöglicht den Nachweis von postreplizierenden Lücken.Dieser Ansatz wurde erstmals von Dr. Meneghini und Dr. Cordiero-Stone in den 1970er Jahren in Brasilien verwendet und kürzlich von uns an den DNA-Faser-Assay angepasst. Die Verwendung der hier beschriebenen Technik zur Untersuchung der Bildung und Reparatur von postreplizierenden Lücken kann Einblicke in den Mechanismus der DNA-Reparatur und der Replikationsstressreaktion geben, die die Integrität des Genoms aufrechterhalten. Für beide hier beschriebenen Protokolle, die S1-Faser und die lückenfüllenden Assays, ist es wichtig, alle Kontrollen einzubeziehen, um eine genaue Interpretation der Daten zu gewährleisten.Das Verfahren wird von Davi J.Martins, einem Doktoranden aus unserem Labor, und Dr. Annabel Quinet, einer Mitarbeiterin, die diese Techniken zuvor bei der Arbeit in unserer Gruppe entwickelt hat, demonstriert. Aspirieren Sie zunächst die Kulturmedien und fügen Sie sofort die Kulturmedien mit 20-Mikromolar IDU-Medien zu den Zellen hinzu. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für genau 20 Minuten.Dann waschen Sie die Zellen schnell zweimal mit vorgewärmtem PBS und bestrahlen Sie sie mit 20 Joule pro Quadratmeter UV-C. Verwenden Sie unbehandelte Zellen als Kontrollen. Fügen Sie sofort die Medien mit 200-Mikromolar CldU zu den Zellen hinzu und inkubieren Sie sie bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für genau 60 Minuten.Danach waschen Sie die Zellen zweimal mit vorgewärmtem PBS und permeabilisieren Sie sie mit dem CSK 100-Puffer für zwei bis 10 Minuten entsprechend der Zelllinie bei Raumtemperatur. Nach der CSK-Permeabilisierung können die Kerne mit fast keinem Zytoplasma im Vergleich zu denen vor der Permeabilisierung gesehen werden. Gießen Sie PBS vorsichtig an der Seite jedes Brunnens, um die Kerne mit PBS zu waschen.Dann waschen Sie die Kerne mit S1-Puffer. Inkubieren Sie die Kerne im S1-Puffer mit 20 Einheiten pro Milliliter-S1-Nuklease und ohne die S1-Nuklease für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius. Als nächstes aspirieren Sie den S1-Puffer und fügen Sie 0,1% BSA in PBS hinzu.Kratzen Sie die Kerne und übertragen Sie sie in ein ungefähr annotiertes 1,5-Milliliter-Rohr. Halten Sie die Röhren die ganze Zeit auf Eis. Zentrifugieren Sie die Kerne bei etwa 4.600 mal G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius.Resuspendieren Sie die Pellets in PBS in einer Konzentration von etwa 1.500 Zellen pro Mikroliter. Legen Sie die Röhrchen auf Eis und fahren Sie sofort mit der DNA-Faservorbereitung fort, indem Sie das Protokoll verteilen. Kommentieren Sie die Objektträger mit einem Kohlestift und legen Sie sie flach auf ein Tablett.Klopfen Sie auf den Boden des Rohres, um eine Homogenisierung zu gewährleisten, und fügen Sie zwei Mikroliter Zellen auf der Oberseite des entsprechenden Objektträgers hinzu. Fügen Sie sechs Mikroliter des Lysepuffers hinzu und lysieren Sie die Zellen, indem Sie etwa fünfmal auf und ab pipettieren. Verwenden Sie die Pipettenspitze, um den Tropfen leicht in Richtung des Bodens des Objektträgers zu ziehen, und inkubieren Sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur, um die Kerne zu lysieren.Neigen Sie die Folie um etwa 20 bis 40 Grad und lassen Sie den Tropfen mit konstant niedriger Geschwindigkeit auf den Boden der Rutsche ausbreiten. Lassen Sie den Schieber bei Raumtemperatur im Dunkeln 10 bis 15 Minuten trocknen. Tauchen Sie sie dann in ein Glas mit der frisch zubereiteten Fixierlösung und inkubieren Sie sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur, um DNA auf den Objektträgern zu fixieren.Waschen Sie die Objektträger zweimal mit PBS für fünf Minuten und denaturieren Sie die DNA mit frisch zubereiteter 2,5-Molaren-Cloridsäure für 40 bis 60 Minuten bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Dias dreimal mit PBS für fünf Minuten und blockieren Sie mit 5% BSA, das zuvor für 30 bis 60 Minuten bei 37 Grad Celsius erwärmt wurde. Tippen Sie vorsichtig auf das Papier, um die überschüssige Flüssigkeit aus den Objektträgern zu entfernen.Fügen Sie 30 Mikroliter primäre Antikörper tropfenweise zu den Objektträgern hinzu und legen Sie einen Deckzettel darauf. Inkubieren Sie für 1 bis 1,5 Stunden bei Raumtemperatur in einer dunklen, feuchten Kammer. Legen Sie die Dias für ein bis zwei Minuten in ein Glas mit PBS und entfernen Sie dann vorsichtig die Deckgläser.Mit PBST dreimal für fünf Minuten in einem Glas waschen und die Dias in PBS legen. Entfernen Sie die überschüssige Flüssigkeit, indem Sie vorsichtig auf ein Papier klopfen und fügen Sie 30 Mikroliter der sekundären Antikörper zu den Objektträgern tropfenweise hinzu. Legen Sie einen Deckzettel darauf.45 bis 60 Minuten bei Raumtemperatur in einer dunklen und feuchten Kammer inkubieren. Wiederholen Sie die Schritte zum Waschen der Objektträger und zum Entfernen des überschüssigen PBS erneut und fügen Sie 20 Mikroliter des Montagereagenzes tropfenweise zu den Objektträgern hinzu. Legen Sie einen Deckzettel darauf und vermeiden Sie Blasen.Legen Sie einen Tropfen Tauchöl in die Nähe der Oberseite des Objektträgers, wo die Zellen lysiert wurden. Verwenden Sie den grünen Kanal und suchen Sie nach den grünen Punkten im Hintergrund, um den Fokus zu finden. Öffnen Sie die Leica Application Suite, klicken Sie auf Acquire und wählen Sie den grünen Kanal aus.Passen Sie vor der Analyse die Einstellungen des grünen Kanals an. Wechseln Sie dann zum roten Kanal und passen Sie die Einstellungen an. Finden Sie die Hauptkonzentration der Fasern und bewegen Sie sich zu den Rändern, um die gut gespreizten, nicht überlappenden, einzelnen Fasern zu finden.Verwenden Sie nur einen Kanal, um die Bereiche für die Bilder auszuwählen und mögliche Verzerrungen zu vermeiden. Klicken Sie auf das Symbol Overlay erfassen und passen Sie die Software auf die richtige Mikroskopvergrößerung an. Nehmen Sie etwa 15 bis 20 Bilder pro Folie neben der gesamten Folie am grünen Kanal und dann am roten Kanal auf.Die beiden Kanäle werden nun zusammengeführt und das erstellte Overlay wird in einen eindeutigen Ordner verschoben. Es ist möglich, die Fasern mit roten und grünen Farben zu sehen. Öffnen Sie die ImageJ-Software, klicken Sie mit der linken Maustaste auf das fünfte Symbol, wählen Sie die zweite Option aus und wählen Sie dann das Werkzeug Segmentierte Linie aus.Klicken Sie mit der linken Maustaste, um den genauen Pfad des roten oder grünen Trakts zu zeichnen, und klicken Sie mit der rechten Maustaste, um die Zeichnung zu stoppen. Drücken Sie die M-Taste auf der Tastatur, um die Länge zu messen. Behalten Sie für die S1-Faser die roten und grünen Traktmessungen für jede Faser im Auge und messen Sie rote und grüne Traktlängen von mindestens 150 Fasern aus verschiedenen Bildern.Eine S1-Faser ist in diesen repräsentativen Bildern zu sehen. Kontrollnaszenter DNA-Trakt ohne die Lücken und unempfindlich gegen Spaltung durch die S1-Nuklease wird hier gezeigt. DNA-Trakt, der positiv auf Lücken ist, die durch die S1-Nuklease gespalten wurden, führte zu einer kürzeren CldU-Traktlänge.Ein im Textmanuskript ausführlich beschriebenes differentielles Beschriftungsschema kann durchgeführt werden, um lückenfüllende Ereignisse zu kennzeichnen. In diesem Assay, dem sogenannten Gap-Filling Assay, entsprechen längere IDU-Tracks mit mindestens einem CldU-Pflaster oder weniger CldU-Patches einer geringen Lückenfülldichte. Kürzere IDU-Trakte mit mindestens einem CldU-Patch und längere IDU-Trakte mit mehr CldU-Patches entsprechen einer hohen lückenfüllenden Dichte.Der Permeabilisierungsschritt dieses Protokolls ist entscheidend dafür, dass die S1-Nuklease auf die Lücken einwirkt, die während der Replikation beschädigter DNA gebildet werden. Die S1-Nuklease kann auch im Kometen-Assay-Protokoll verwendet werden, um die Lücken zu erkennen, die während der Replikation beschädigter DNA gebildet werden, die nach der Behandlung bestehen bleibt. Der S1-Faserassay ebnete den Weg für das neue Paradigma, dass postreplizierende Lücken eine Krebsanfälligkeit verursachen können, insbesondere bei Brust- und Eierstockkrebs, die Mutationen in BRCA1- und 2-Genen tragen.

Research

JoVE Journal

Genetics

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Der Nachweis von Copy Number Änderungen Single Cell-Sequenzierung

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Forschung

Genetik

Atomic Force Microscopy Investigations of DNA Lesion Recognition in Nucleotide Excision Repair

Atommikroskopie Untersuchungen zur DNA-Läsionserkennung bei der Nucleotide Excision Repair

AFM imaging is a powerful technique for the study of protein-DNA interactions. This single molecule method allows the simultaneous resolution of different ...

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

Immunostaining für DNA-Modifikationen: computergestützte Analyse der konfokalen Bilder

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Hocheffiziente gen Störung der murinen und menschlichen hämatopoetischen Vorläuferzellen von CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

A Simple, Rapid, and Quantitative Assay to Measure Repair of DNA-protein Crosslinks on Plasmids Transfected into Mammalian Cells

Ein einfacher, rasches und quantitativen Assay zur Maßnahme Reparatur von DNA-Protein-Querverbindungen auf Plasmide transfiziert in Säugerzellen

The purpose of this method is to provide a flexible, rapid, and quantitative technique to examine the kinetics of DNA-protein crosslink (DPC) repair in ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Seltenes Ereigniserkennung mit Fehler korrigiert DNA und RNA Sequenzierung

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Methodik für die präzise Erkennung der mitochondrialen DNA-Methylierung

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

ATAC-seq Assay with Low Mitochondrial DNA Contamination from Primary Human CD4+ T Lymphocytes

ATAC-Seq-Assay mit niedrigen mitochondriale DNA Kontamination von primären menschlichen CD4 + T-Lymphozyten

ATAC-seq has become a widely used methodology in the study of epigenetics due to its rapid and simple approach to mapping genome-wide accessible ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay Using Micrococcal Nucleases in Mammalian Cells

Chromatin Immunoprecipitation Assay mit Mikrokokken-Nukleasen in Säugetierzellen

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene ...

Use of Frozen Tissue in the Comet Assay for the Evaluation of DNA Damage

Verwendung von gefrorenem Gewebe im Kometentest zur Bewertung von DNA-Schäden

The comet assay is gaining popularity as a means to assess DNA damage in cultured cells and tissues, particularly following exposure to chemicals or other ...