Name: detection of post-replicative gaps accumulation and repair in human cells using the dna fiber assay
Uploaded: 2022-02-03T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Post-Replicative Gaps Accumulation and Repair in Human Cells Using the DNA Fiber Assay at JoVE.com

העבודה במעבדת C.F.M.M. נתמכת על ידי Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, סאו פאולו, ברזיל, מענקים #2019/19435-3, #2013/08028-1 ו-2017/05680-0) במסגרת מחקר שיתוף הפעולה הבינלאומי של FAPESP והארגון ההולנדי למחקר מדעי (NWO, הולנד); Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, Brasília, DF, Brazil, Grants # 308868/2018-8] and Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal do Ensino Superior (CAPES, Brasília, DF, Brazil, Finance Code 001).

מכיוון שהמחקר משתמש בתאים אנושיים, העבודה אושרה על ידי ועדת האתיקה של המכון למדע ביו-רפואי באוניברסיטת סאו פאולו (ICB-USP, מספר אישור #48347515.3.00005467) למחקר עם דגימות אנושיות.
הערה: הפרוטוקולים המתוארים כאן שימשו בפרסומים קודמים עם שינויים קלים 14,16,28....

<ol>
	<li>Rupp, W. D., Howard-Flanders, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discontinuities+in+the+DNA+synthesized+in+an+excision-defective+strain+of+Escherichia+coli+following+ultraviolet+irradiation.">Discontinuities in the DNA synthesized in an excision-defective strain of Escherichia coli following ultraviolet irradiation.</a> Journal of Molecular Biology. 31 (2), 291-304 (1968).</li><li>Meneghini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gaps+in+DNA+synthesized+by+ultraviolet+light-irradiated+WI38+human+cells.">Gaps in DNA synthesized by ultraviolet light-irradiated WI38 human cells.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 425 (4), 419-427 (1976).</li><li>Meneghini, R., Cordeiro-Stone, M., Schumacher, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+and+frequency+of+gaps+in+newly+synthesized+DNA+of+xeroderma+pigmentosum+human+cells+irradiated+with+ultraviolet+light.">Size and frequency of gaps in newly synthesized DNA of xeroderma pigmentosum human cells irradiated with ultraviolet light.</a> Biophysical Journal. 33 (1), 81-92 (1981).</li><li>Lopes, M., Foiani, M., Sogo, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+mechanisms+control+chromosome+integrity+after+replication+fork+uncoupling+and+restart+at+irreparable+UV+lesions.">Multiple mechanisms control chromosome integrity after replication fork uncoupling and restart at irreparable UV lesions.</a> Molecular Cell. 21 (1), 15-27 (2006).</li><li>Heller, R. C., Marians, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+fork+reactivation+downstream+of+a+blocked+nascent+leading+strand.">Replication fork reactivation downstream of a blocked nascent leading strand.</a> Nature. 439 (7076), 557-562 (2006).</li><li>Bianchi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PrimPol+bypasses+UV+photoproducts+during+eukaryotic+chromosomal+DNA+replication.">PrimPol bypasses UV photoproducts during eukaryotic chromosomal DNA replication.</a> Molecular Cell. 52 (4), 566-573 (2013).</li><li>Garc&#237;a-G&#243;mez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PrimPol,+an+archaic+primase/polymerase+operating+in+human+cells.">PrimPol, an archaic primase/polymerase operating in human cells.</a> Molecular Cell. 52 (4), 541-553 (2013).</li><li>Mour&#243;n, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repriming+of+DNA+synthesis+at+stalled+replication+forks+by+human+PrimPol.">Repriming of DNA synthesis at stalled replication forks by human PrimPol.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 20 (12), 1383-1389 (2013).</li><li>Wan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hPrimpol1/CCDC111+is+a+human+DNA+primase-polymerase+required+for+the+maintenance+of+genome+integrity.">hPrimpol1/CCDC111 is a human DNA primase-polymerase required for the maintenance of genome integrity.</a> EMBO Reports. 14 (12), 1104-1112 (2013).</li><li>Keen, B. A., Jozwiakowski, S. K., Bailey, L. J., Bianchi, J., Doherty, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+dissection+of+the+domain+architecture+and+catalytic+activities+of+human+PrimPol.">Molecular dissection of the domain architecture and catalytic activities of human PrimPol.</a> Nucleic Acids Research. 42 (9), 5830-5845 (2014).</li><li>Tirman, S., Cybulla, E., Quinet, A., Meroni, A., Vindigni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRIMPOL+ready,+set,+reprime.">PRIMPOL ready, set, reprime.</a> Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 56 (1), 17-30 (2021).</li><li>Quinet, A., Lerner, L. K., Martins, D. J., Menck, C. F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filling+gaps+in+translesion+DNA+synthesis+in+human+cells.">Filling gaps in translesion DNA synthesis in human cells.</a> Mutation Research, Genetic Toxicology Environmental Mutagenesis. 836, 127-142 (2018).</li><li>Ziv, O., Diamant, N., Shachar, S., Hendel, A., Livneh, Z., Bjergb&#230;k, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+measurement+of+translesion+DNA+synthesis+in+mammalian+cells.">Quantitative measurement of translesion DNA synthesis in mammalian cells.</a> DNA Repair Protocols. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). 920, (2012).</li><li>Quinet, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translesion+synthesis+mechanisms+depend+on+the+nature+of+DNA+damage+in+UV-irradiated+human+cells.">Translesion synthesis mechanisms depend on the nature of DNA damage in UV-irradiated human cells.</a> Nucleic Acids Research. 44 (12), 5717-5731 (2016).</li><li>T&#233;cher, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+dynamics:+biases+and+robustness+of+DNA+fiber+analysis.">Replication dynamics: biases and robustness of DNA fiber analysis.</a> Journal of Molecular Biology. 425 (23), 4845-4855 (2013).</li><li>Quinet, A., Carvajal-Maldonado, D., Lemacon, D., Vindigni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+fiber+analysis:+Mind+the+gap.">DNA fiber analysis: Mind the gap.</a> Methods in Enzymology. 591, 55-82 (2017).</li><li>Elvers, I., Johansson, F., Groth, P., Erixon, K., Helleday, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UV+stalled+replication+forks+restart+by+re-priming+in+human+fibroblasts.">UV stalled replication forks restart by re-priming in human fibroblasts.</a> Nucleic Acids Research. 39 (16), 7049-7057 (2011).</li><li>Diamant, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+bypass+operates+in+the+S+and+G2+phases+of+the+cell+cycle+and+exhibits+differential+mutagenicity.">DNA damage bypass operates in the S and G2 phases of the cell cycle and exhibits differential mutagenicity.</a> Nucleic Acids Research. 40 (1), 170-180 (2012).</li><li>Temviriyanukul, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporally+distinct+translesion+synthesis+pathways+for+ultraviolet+light-induced+photoproducts+in+the+mammalian+genome.">Temporally distinct translesion synthesis pathways for ultraviolet light-induced photoproducts in the mammalian genome.</a> DNA Repair. 11 (6), 550-558 (2012).</li><li>Jansen, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redundancy+of+mammalian+Y+family+DNA+polymerases+in+cellular+responses+to+genomic+DNA+lesions+induced+by+ultraviolet+light.">Redundancy of mammalian Y family DNA polymerases in cellular responses to genomic DNA lesions induced by ultraviolet light.</a> Nucleic Acids Research. 42 (17), 11071 (2014).</li><li>Quinet, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap-filling+and+bypass+at+the+replication+fork+are+both+active+mechanisms+for+tolerance+of+low-dose+ultraviolet-induced+DNA+damage+in+the+human+genome.">Gap-filling and bypass at the replication fork are both active mechanisms for tolerance of low-dose ultraviolet-induced DNA damage in the human genome.</a> DNA Repair. 14 (1), 27-38 (2014).</li><li>Callegari, A. J., Clark, E., Pneuman, A., Kelly, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postreplication+gaps+at+UV+lesions+are+signals+for+checkpoint+activation.">Postreplication gaps at UV lesions are signals for checkpoint activation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (18), 8219-8224 (2010).</li><li>Vogt, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+further+properties+of+single-strand-specific+nuclease+from+Aspergillus+oryzae.">Purification and further properties of single-strand-specific nuclease from Aspergillus oryzae.</a> European Journal of Biochemistry. 33 (1), 192-200 (1973).</li><li>Cordeiro-Stone, M., Schumacher, R. I., Meneghini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+replication+fork+in+ultraviolet+light-irradiated+human+cells.">Structure of the replication fork in ultraviolet light-irradiated human cells.</a> Biophysical Journal. 27 (2), 287-300 (1979).</li><li>Lehmann, A. R., Fuchs, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gaps+and+forks+in+DNA+replication:+Rediscovering+old+models.">Gaps and forks in DNA replication: Rediscovering old models.</a> DNA Repair (Amst). 5 (12), 1495-1498 (2006).</li><li>Daigaku, Y., Davies, A. A., Ulrich, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin-dependent+DNA+damage+bypass+is+separable+from+genome+replication.">Ubiquitin-dependent DNA damage bypass is separable from genome replication.</a> Nature. 465 (7300), 951-955 (2010).</li><li>Karras, G. I., Jentsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RAD6+DNA+damage+tolerance+pathway+operates+uncoupled+from+the+replication+fork+and+is+functional+beyond+S+phase.">The RAD6 DNA damage tolerance pathway operates uncoupled from the replication fork and is functional beyond S phase.</a> Cell. 141 (2), 255-267 (2010).</li><li>Tirman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporally+distinct+post-replicative+repair+mechanisms+fill+PRIMPOL-dependent+ssDNA+gaps+in+human+cells.">Temporally distinct post-replicative repair mechanisms fill PRIMPOL-dependent ssDNA gaps in human cells.</a> Molecular Cell. 81 (19), 4026-4040 (2021).</li><li>Cong, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+gaps+are+a+key+determinant+of+PARP+inhibitor+synthetic+lethality+with+BRCA+deficiency.">Replication gaps are a key determinant of PARP inhibitor synthetic lethality with BRCA deficiency.</a> Molecular Cell. 81 (15), 3128-3144 (2021).</li><li>Quinet, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRIMPOL-mediated+adaptive+response+suppresses+replication+fork+reversal+in+BRCA-deficient+cells.">PRIMPOL-mediated adaptive response suppresses replication fork reversal in BRCA-deficient cells.</a> Molecular Cell. 77 (3), 461-474 (2020).</li><li>Jackson, D. A., Pombo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replicon+clusters+are+stable+units+of+chromosome+structure:+evidence+that+nuclear+organization+contributes+to+the+efficient+activation+and+propagation+of+S+phase+in+human+cells.">Replicon clusters are stable units of chromosome structure: evidence that nuclear organization contributes to the efficient activation and propagation of S phase in human cells.</a> The Journal of Cell Biology. 140 (6), 1285-1295 (1998).</li><li>Schwab, R. A., Niedzwiedz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+DNA+replication+in+the+vertebrate+model+system+DT40+using+the+DNA+fiber+technique.">Visualization of DNA replication in the vertebrate model system DT40 using the DNA fiber technique.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (56), e3255 (2011).</li><li>Simoneau, A., Xiong, R., Zou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+trans+cell+cycle+effects+of+PARP+inhibitors+underlie+their+selectivity+toward+BRCA1/2-deficient+cells.">The trans cell cycle effects of PARP inhibitors underlie their selectivity toward BRCA1/2-deficient cells.</a> Genes &amp; Development. 35 (17-18), 1271-1289 (2021).</li><li>Taglialatela, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=REV1-Pol&#950;+maintains+the+viability+of+homologous+recombination-deficient+cancer+cells+through+mutagenic+repair+of+PRIMPOL-dependent+ssDNA+gaps.">REV1-Pol&#950; maintains the viability of homologous recombination-deficient cancer cells through mutagenic repair of PRIMPOL-dependent ssDNA gaps.</a> Molecular Cell. 81 (19), 4008-4025 (2021).</li><li>Lim, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=USP1+Is+required+for+replication+fork+protection+in+BRCA1-deficient+tumors.">USP1 Is required for replication fork protection in BRCA1-deficient tumors.</a> Molecular Cell. 72 (6), 925-941 (2018).</li><li>Peng, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposing+roles+of+FANCJ+and+HLTF+protect+forks+and+restrain+replication+during+stress.">Opposing roles of FANCJ and HLTF protect forks and restrain replication during stress.</a> Cell Reports. 24 (12), 3251-3261 (2018).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA+translocase+FANCM/MHF+promotes+replication+traverse+of+DNA+interstrand+crosslinks.">The DNA translocase FANCM/MHF promotes replication traverse of DNA interstrand crosslinks.</a> Molecular Cell. 52 (3), 434-446 (2013).</li><li>Ding, W., Bishop, M. E., Lyn-Cook, L. E., Davis, K. J., Manjanatha, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+alkaline+comet+assay+and+enzyme-modified+alkaline+comet+assay+for+measuring+DNA+strand+breaks+and+oxidative+DNA+damage+in+rat+liver.">In vivo alkaline comet assay and enzyme-modified alkaline comet assay for measuring DNA strand breaks and oxidative DNA damage in rat liver.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (111), e53833 (2016).</li><li>Lu, Y., Liu, Y., Yang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+in+vitro+DNA+damage+using+comet+assay.">Evaluating in vitro DNA damage using comet assay.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (128), e56450 (2017).</li></ol>

שלבים קריטיים של פרוטוקול בדיקת סיבי הדנ"א הסטנדרטי נדונו בפרסום קודם32. כאן אנו מתארים גרסאות מותאמות של בדיקת סיבי הדנ"א הסטנדרטית כדי לחקור את נוכחותם של פערי ssDNA לאחר שכפול, כמו גם את תיקונם על ידי מילוי פערים, המתוארים לראשונהב-14. בהקשר של נוכחות פער ssDNA לאחר שכ?...

עבודות סמינל סיפקו עדויות להצטברות של פערים חד-גדיליים (ssDNA) לאחר שכפול בעת טיפול בחומרים מזיקים לדנ"א בחיידקים1 ובתאים אנושיים 2,3. במהלך שכפול של תבניות דנ"א פגומות, מנגנוני סינתזת הדנ"א עשויים לעקוף את הנגעים על ידי שימוש בפולימראזות DNA ספציפיות של סינתזת טרנסלציה או באמצעות מנגנוני החלפת תבניות. לחלופין, ה-replisome עשוי גם פשוט לדלג על הנגע ולהשאיר מאחור מרווח ssDNA, שיתוקן מאוחר יותר. לאחרונה, מחקר הראה בבירור כי טיפול בחומרים גנוטוקסיים מוביל לפערי ssDNA באאוקריוטים על ידי שימוש במיקרוסקופיית אלקטרונים כדי לדמיין את המבנה הספציפי של מתווכי שכפול4. היווצרותם של אזורים אלה של פערים לאחר שכפול הוצעה בתחילה להיות תוצאה פשוטה של המצב הבלתי רציף למחצה של שכפול DNA2. במקרה זה, נגע על הגדיל המפגר יכול לחסום את התארכותו של שבר אוקזאקי, אך התקדמות המזלג ניצלת באופן טבעי על ידי שבר אוקזאקי הבא, ומשאירה מאחור פער ssDNA. עם זאת, מחקרים נוספים הראו כי היווצרות פערים על הגדיל המוביל אפשרית גם כן, כפי שהוכח לראשונה בחיידק5. באאוקריוטים, PRIMPOL, פולימראז דנ"א ייחודי עם פעילות פרימאז, הוכח כמי שמסוגל להפעיל מחדש את סינתזת הדנ"א במורד הזרם של נגע חוסם שכפול באמצעות פעילות הנזיפה שלו 6,7,8,9,10,11. לפיכך, פעילות הפרימט PRIMPOL עשויה להסביר את היווצרותם של פערי ssDNA לאחר שכפול בגדיל המוביל עם טיפול בחומר מזיק לדנ"א בתאים אנושיים12. עם זאת, זיהוי פערים אלה, כמו גם תיקון פערים, עד לאחרונה, דרשו גישות עקיפות או גוזלות זמן כגון מיקרוסקופיית אלקטרונים4 או בדיקות מבוססות פלסמיד13. השימוש בנוקלאז S1 הספציפי ל-SsDNA כדי לזהות פערים בתאים אנושיים היה חלוץ במחקרים מוקדמים לפני יותר מארבעים שנה, תוך שימוש בטכניקות גרדיאנט סוכרוז 2,3. לאחרונה, הקבוצה שלנו יישמה את השימוש בנוקלאז זה כדי לזהות ssDNA בשכפול דנ"א (פערים לאחר שכפול) בשיטות אחרות כגון סיבי דנ"א ומבחני שביט14. גישות חדשות אלה סללו את הדרך לגל הנוכחי של מחקרים על פערים שלאחר שכפול. כאן, אנו מתארים אסטרטגיה של שימוש בנוקלאז S1 כדי לזהות פערי ssDNA לאחר שכפול על ידי בדיקת סיבי DNA ומסבירים כיצד ערכת תיוג דיפרנציאלית בפרוטוקול סיבי הדנ"א יכולה לאפשר מחקר של תיקון פערים אלה.
בדיקת סיבי הדנ"א היא טכניקה רבת עוצמה ששימשה מספר גדל והולך של מעבדות וסיפקה תובנות חשובות על דינמיקת מזלג שכפול ומנגנוני תגובת עקה לשכפול. בקצרה, טכניקה זו מבוססת על שילוב רציף של אנלוגים נוקלאוטידים (כגון CldU -5-chloro-2'-deoxyuridine-, ו- IdU -5-iodo-2'-deoxyuridine) בדנ"א המשכפל. לאחר הקציר, התאים נשחקים, ומולקולות דנ"א מתפשטות על מגלשת זכוכית מצופה באופן חיובי. לאחר מכן, CldU ו-IdU מזוהים על ידי נוגדנים ספציפיים, שאותם ניתן לדמיין במיקרוסקופ פלואורסצנטי כסיבים דו-גוניים. לבסוף, אורכי דרכי IdU ו-CldU נמדדים כדי לזהות שינויים כלשהם בדינמיקה של שכפול הדנ"א כתוצאה מאינדוקציה של נזק לדנ"א. ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לחקור תופעות שונות, כגון תקיעת מזלג, האטת מזלג, השפלת דנ"א מתהווה ושינויים בתדירות הירי במקור15,16.
מגבלה אחת של בדיקת סיבי הדנ"א היא הרזולוציה של כמה קילו-בסיסים. מכיוון שפערי ssDNA לאחר שכפול יכולים להיות בטווח של מאות בסיסים, אי אפשר לדמיין את הפערים האלה ישירות על ידי פרוטוקול סיבי הדנ"א הסטנדרטי. נוכחותם של פערי ssDNA על שכפול דנ"א בתאים אנושיים שטופלו בחומרים גנוטוקסיים הייתה מעורבת בעבר בעקיפין. לדוגמה, תצפית של ssDNA כפי שהוערך על ידי גיוס של החלבון הקושר ssDNA, חלבון שכפול A (RPA), בתאים מחוץ לשלב S, או היווצרות של ssDNA כפי שזוהה על ידי הרפיית DNA אלקליין בשילוב עם היעדר עיכוב מזלג ממושך על ידי בדיקת סיבי DNA 12,17,18,19,20,21 יוחסה להצטברות של פערי ssDNA. בנוסף, פערי ssDNA לאחר שכפול גורמים למחסום פאזה G2/M תלוי ATR ותאי מעצר שטופלו ברעלי שכפול 18,19,20,21,22.
הנוקלאז S1 מפרק חומצות גרעין חד-גדיליות המשחררות 5'-פוספוריל מונו- או אוליגונוקלאוטידים ויש לו זיקה גבוהה פי 5 ל-ssDNA בהשוואה לרנ"א. חומצות גרעין דו-גדיליות (DNA:DNA, DNA:RNA, או RNA:RNA) עמידות בפני נוקלאז S1 למעט כאשר משתמשים בהן בריכוזים גבוהים במיוחד. הנוקלאז S1 גם מבקע דנ"א דו-גדילי באזור החד-גדילי הנגרם על-ידי ניק, פער, חוסר התאמה או לולאה. הנוקלאז S1 הוא אפוא אנדונוקלאז ספציפי ל-ssDNA המסוגל לבקוע פערי ssDNA, ובסופו של דבר לייצר שברים דו-גדילייםשל 23,24. לפיכך, הוספת שלבים לעיכול נוקלאז S1 לפרוטוקול סיבי הדנ"א מאפשרת בעקיפין זיהוי של פערי ssDNA לאחר שכפול. בנוכחות פערים, טיפול בגרעינים חשופים עם נוקלאז S1 לפני התפשטות הדנ"א ייצור דרכים קצרות יותר כתוצאה מביקת S1 של ssDNA הנמצאת מטבעה בפערים14. לפיכך, קיצור דרכי הוא הקריאה לפערי ssDNA באמצעות גישה זו. בהשוואה לפרוטוקול סיבי הדנ"א הסטנדרטי, סיבי הדנ"א עם הנוקלאז S1 דורשים רק שני שלבים נוספים: חשיפה גרעינים (חדירת תאים) וטיפול בנוקלאז S1. חשוב לציין כי בקרות מתאימות הן חובה, כגון דגימות המטופלות בחומר הגנוטוקסי אך ללא נוקלאז S1 ודגימות שטופלו בנוקלאז S1 ללא הסוכן הגנוטוקסי. הפרוטוקול עצמו, כולל שילוב אנלוגים, טיפול S1 והתפשטות, יכול להתבצע ביום אחד ואינו דורש חומר יוצא דופן. זה דורש רק את אנלוגי התימידין, את נוקלאז S1 המטוהר, את הנוגדנים הראשוניים והמשניים המתאימים, ומיקרוסקופ פלואורסצנטי. באופן כללי, סיבי הדנ"א המשתמשים בנוקלאז S1 מזהים פערי ssDNA על מזלגות שכפול מתמשכים באמצעות גישה פשוטה יחסית.
ניתן לתקן (או למלא) את פערי ה-ssDNA שלאחר השכפול שנוצרו כתוצאה ממנגנוני תגובת מתח שכפול על ידי מנגנונים שונים, כולל סינתזת DNA של טרנסלציה או החלפת תבניות, בתהליך שנקרא מילוי פערים או תיקון לאחר שכפול (PRR)25. תהליכים אלה מתרחשים מאחורי הפיצולים המתקדמים, הכוללים סינתזת דנ"א בלתי תלויה בשכפול 14,26,27. בהתבסס על ממצאים אלה, ניתן לבצע ערכת תיוג שונה מבדיקת סיבי הדנ"א הסטנדרטית כדי לדמיין אירועים ממלאי פערים בשלב G2 ישירות 14,16,26,28. באופן ספציפי, ניתן להשתמש באנלוגיית תימידין אחת כדי לתייג את מזלג השכפול בזמן הטיפול הגנוטוקסי והיווצרות פערי ssDNA לאחר שכפול, בעוד שניתן להשתמש באנלוגיה אחרת של תימידין כדי לתייג אירועים של מילוי פערים. בפרוטוקול זה, התאים מסומנים באנלוגיה תימידין ראשונה (IdU, למשל) מיד לאחר או במקביל לטיפול גנוטוקסי במשך שעה אחת, כך שהדנ"א המתהווה מסומן בזמן היווצרות הפער. Nocodazole מתווסף עם הטיפול בכל מקום בין 12-24 שעות כדי לעצור תאים ב-G2/M, ובכך למנוע את שלב ה-S הבא. עבור 4 השעות האחרונות של טיפול בנוקודזול, אנלוגי תימידין שני (CldU, למשל) מתווסף למדיה כדי שישולבו במהלך מילוי הפער. חשוב לציין, ניתן להשתמש בבדיקה זו רק כדי לזהות אירועים של מילוי פערים ב-G2 מכיוון שלא ניתן להבחין בין האות הממלא את הפער מ-CldU לבין אות עקב שילוב CldU בשכפול דנ"א בשלב ה-S. לכן, כדי למזער את אות הרקע, התזמון של שילוב CldU לאחר אינדוקציה של נזק צריך לחפוף עם כאשר רוב אוכלוסיית התאים נכנסת לשלבG2 14. לכן, תזמון זה ישתנה בהתאם לקו התא ולמצבי הטיפול. מומלץ למטב את התקדמות מחזור התאים לפני השימוש בבדיקה זו. צביעה משותפת של אנלוגים תימידין אלה מאפשרת הדמיה של דרכי מילוי פערים (PRR) (טלאי CldU) על גבי דנ"א מתהווה (דרכי IdU) המסונתזות במהלך הטיפול הגנוטוקסי כאשר נוצרו פערי ssDNA.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid, Glacial</td>
			<td>Synth</td>
			<td>64-19-7</td>
			<td>Alternatively, BSA - Biosera - REF PM-T1725/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium hydroxide</td>
			<td>Synth</td>
			<td>1336-21-6</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody anti-mouse IgG1 Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11005</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody anti-rat Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21470</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody Mouse anti-BrdU</td>
			<td>Becton Disckson</td>
			<td>347580</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody Rat anti-BrdU</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>&#160;Ab6326</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological security hood</td>
			<td>Pachane</td>
			<td>PA 410</td>
			<td>Use hood present in the laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (Bovine Serum Albumin)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3294</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>179693</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CldU</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>C6891</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cloridric acid</td>
			<td>Synth</td>
			<td>7647-01-0</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Zeiss LSM Series (7, 8 or 9)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass (or coverslips)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>152460</td>
			<td>Alternatively, Olen - Kasvi Cover Glass (24 x 60 mm) - K5-2460</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM - High Glucose</td>
			<td>LGC/Gibco</td>
			<td>BR30211-05/12100046</td>
			<td>Use culture media specific for the cell line used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E5314</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence Microscope Axiovert 200</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12657-029</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forma Series II Water Jacketed CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific 3110</td>
			<td>13-998-074</td>
			<td>Use cell incubator present in the laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide jar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5516</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Idu</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>I7125</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Synth</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>67-56-1</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Denville</td>
			<td>M1021</td>
			<td>Alternatively, Olen - Kasvi Microscope Slides - K5-7105 OR Precision Glass Line - 7105-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS (&#193;cido 3-morfolinopropano 1-sulf&#244;nico)</td>
			<td>Synth</td>
			<td>1132-61-2</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nocodazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31430-18-9</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate Buffer Saline)</td>
			<td>Life Thechnologies</td>
			<td>3002</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold AntiFade Mountant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36930</td>
			<td>Any antifade moutant solution for immunofluorescence could be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S1 nuclease purified from Aspergillus oryzae</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18001-016</td>
			<td>Pre-dilute the S1 nuclease (1/100 - 1/200) in S1 nuclease dilution buffer provided by the manufacturer, aliquote and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0302</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate Trihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>6131-90-4</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Synth</td>
			<td>&#160;7647-14-5</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>57-50-1</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>West Lab Research</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Synth</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200072</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UVC Lamp</td>
			<td>Non Specific</td>
			<td>-</td>
			<td>Essential: emission lenght of 254 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VLX-3W UV Radiometer</td>
			<td>Vilber Loumart</td>
			<td>-</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>557-34-6</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of post-replicative gaps accumulation and repair in human cells using the dna fiber assay

בדיקת סיבי הדנ"א היא שיטה פשוטה וחזקה לניתוח דינמיקה של מזלג שכפול, המבוססת על אימונו-דטקציה של אנלוגים נוקלאוטידים המשולבים במהלך סינתזת דנ"א בתאים אנושיים. עם זאת, טכניקה זו יש רזולוציה מוגבלת של כמה אלפי קילובסיסים. כתוצאה מכך, פערי דנ"א חד-גדילי (ssDNA) לאחר שכפול, קטנים עד כמה מאות בסיסים, אינם ניתנים לזיהוי על ידי הבדיקה הסטנדרטית. כאן אנו מתארים גרסה שונה של בדיקת סיבי הדנ"א המשתמשת בנוקלאז S1, אנזים שמבקע באופן ספציפי את ה-ssDNA. בנוכחות פערי ssDNA לאחר שכפול, הנוקלאז S1 יתמקד במרווחים ויבקע אותם, ויצר דרכים קצרות יותר שיכולות לשמש כקריאה לרווחי ssDNA על מזלגות מתמשכים. פערי ssDNA אלה לאחר שכפול נוצרים כאשר דנ"א פגום משוכפל ללא הרף. ניתן לתקן אותם באמצעות מנגנונים שאינם מחוברים לשכפול הגנום, בתהליך המכונה מילוי פערים או תיקון לאחר שכפול. מאחר שמנגנוני מילוי פערים כוללים סינתזת דנ"א שאינה תלויה בשלב S, ניתן להשתמש בשינויים בסכמת תיוג סיבי הדנ"א גם כדי לעקוב אחר אירועים של מילוי פערים. בסך הכל, שינויים אלה של בדיקת סיבי הדנ"א הם אסטרטגיות רבות עוצמה כדי להבין כיצד נוצרים פערים לאחר שכפול וממלאים את הגנום של התאים האנושיים.

בבדיקת סיבי S1, אם טיפול בחומר גנוטוקסי מוביל לפערים של ssDNA לאחר שכפול, האורך הכולל של סיבי הדנ"א מגרעינים שטופלו ב-S1 יהיה קצר יותר עם הטיפול בנזק לדנ"א בהשוואה לדגימות שלא טופלו, כמו גם לדגימות שטופלו בחומר הגנוטוקסי אך לא הוגשו לביקוע S1 (איור 1).
לחלופין, אם הטי?...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Post-Replicative Gaps Accumulation and Repair in Human Cells Using the DNA Fiber Assay at JoVE.com

Detection of Post-Replicative Gaps Accumulation and Repair in Human Cells Using the DNA Fiber Assay

כאן אנו מתארים שני שינויים של בדיקת סיבי הדנ"א כדי לחקור פערי דנ"א חד-גדיליים בשכפול דנ"א לאחר אינדוקציה של נגע. בדיקת הסיבים S1 מאפשרת זיהוי של פערים לאחר שכפול באמצעות אנדונוקלאז S1 ספציפי ל-SSDNA, בעוד שבדיקת מילוי הפער מאפשרת הדמיה וכימות של תיקון פערים.

זיהוי של פערים לאחר שכפול הצטברות ותיקון בתאים אנושיים באמצעות בדיקת סיבי DNA

The DNA fiber assay is a simple and robust method for the analysis of replication fork dynamics, based on the immunodetection of nucleotide analogs that ...

הפרוטוקול שלנו פותח אפשרויות חדשות לחקור כיצד שכפול מתרחש על דנ"א פגום. הטכניקות יכולות לזהות היווצרות ותיקון של פערי דנ"א חד-גדיליים, מול נגע הדנ"א. הנוקלאז S1 מבקע את הדנ"א החד-גדילי ומאפשר זיהוי של פערים לאחר שכפול.גישה זו שימשה לראשונה את ד"ר מנג'יני וד"ר קורדיירו-סטון בשנות ה-70 בברזיל, ולאחרונה הותאמה על ידינו לבדיקת סיבי הדנ"א. שימוש בטכניקה המתוארת כאן כדי לחקור את היווצרותם ותיקוןם של פערים לאחר שכפול יכול לספק תובנות לגבי המנגנון של תיקון דנ"א ותגובת שכפול עקה השומרת על שלמות הגנום. עבור שני הפרוטוקולים המתוארים כאן, סיב S1 ומבחני מילוי הפערים, חיוני לכלול את כל הבקרות כדי להבטיח פרשנות מדויקת של הנתונים.ההליך יודגם על ידי דבי ג'יי מרטינס, דוקטורנט מהמעבדה שלנו, וד"ר אנאבל קווינט, משתפת פעולה שפיתחה בעבר את הטכניקות הללו כשעבדה בקבוצה שלנו. ראשית, שאפו למדיית התרבית והוסיפו מיד את מדיית התרבית עם 20 מיקרומולר של מדיה IDU לתאים. הדגירה של התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני למשך 20 דקות בדיוק.לאחר מכן, לשטוף במהירות את התאים עם PBS מחומם מראש פעמיים ולהקרין אותם עם 20 ג'אול למטר UV-C מרובע. השתמש בתאים לא מטופלים כבקרות. מיד להוסיף את המדיה עם 200 מיקרומולר CldU לתאים ולדגום אותם ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך 60 דקות בדיוק.לאחר מכן, לשטוף את התאים עם PBS מחומם מראש פעמיים ולחלחל אותם עם חיץ CSK 100 במשך שתיים עד 10 דקות על פי קו התא בטמפרטורת החדר. לאחר חלחול CSK, ניתן לראות את הגרעינים שכמעט ללא ציטופלסמה ניתן לראות בהשוואה לאלה שלפני החדירה. יש לשפוך בזהירות את PBS לצד של כל באר כדי לשטוף את הגרעינים עם PBS.לאחר מכן, לשטוף את הגרעינים עם חיץ S1. דגירה של הגרעינים במאגר S1 עם 20 יחידות למיליליטר S1 נוקלאז, וללא נוקלאז S1, למשך 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, שאפו למאגר S1 והוסיפו 0.1% BSA ב-PBS.לגרד את הגרעינים ולהעביר אותם לצינור 1.5 מיליליטר מבואר בערך. שמור את הצינורות על קרח כל הזמן. צנטריפוגה של הגרעינים בסביבות 4, 600 פעמים G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.בצעו החייאה של הכדורים ב-PBS בריכוז של כ-1, 500 תאים למיקרוליטר. הניחו את הצינורות על הקרח והמשיכו מיד להכנת סיבי DNA על ידי פרוטוקול התפשטות. הביאו את שקופיות המיקרוסקופ בעיפרון פחמן והניחו אותן שטוחות על מגש.הקש על החלק התחתון של הצינור כדי להבטיח הומוגניזציה והוסף שני מיקרוליטרים של תאים בחלק העליון של השקופית המתאימה. מוסיפים שישה מיקרוליטרים של מאגר הליזיס ומניחים את התאים על ידי צנרת למעלה ולמטה כחמש פעמים. השתמשו בקצה הפיפטה כדי למשוך את הטיפה מעט לכיוון תחתית המגלשה ודגרו במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר כדי לשקר את הגרעינים.הטה את השקופית בערך 20 עד 40 מעלות ואפשר לירידה להתפשט לתחתית המגלשה במהירות נמוכה קבועה. אפשרו למגלשה להתייבש בטמפרטורת החדר בחושך למשך 10 עד 15 דקות. לאחר מכן, טבלו אותם בצנצנת המכילה את תמיסת התיקון שזה עתה הוכנה ודגרו במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר כדי לתקן את הדנ"א על השקופיות.שטפו את המגלשות עם PBS פעמיים במשך חמש דקות ופענחו את הדנ"א עם חומצה קלורידרית 2.5-טוחנות שהוכנה לאחרונה למשך 40 עד 60 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף את השקופיות עם PBS שלוש פעמים במשך חמש דקות ולחסום עם 5% BSA התחמם בעבר במשך 30 עד 60 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. הקש בעדינות על הנייר כדי להסיר את הנוזל העודף מהשקופיות.הוסיפו 30 מיקרוליטרים של נוגדנים ראשוניים לשקופיות באופן טיפתי והניחו החלקת כיסוי על גביה. דגירה למשך שעה עד שעה וחצי בטמפרטורת החדר בחדר חשוך ולח. מניחים את השקופיות בצנצנת עם PBS למשך דקה עד שתי דקות ולאחר מכן מסירים בזהירות את תלושי הכיסוי.יש לשטוף עם PBST בצנצנת שלוש פעמים במשך חמש דקות ולהניח את השקופיות ב-PBS. הסר את הנוזל העודף על ידי הקשה עדינה על נייר והוסף 30 מיקרוליטרים של הנוגדנים המשניים לשקופיות באופן טיפתי. מניחים פתק כיסוי למעלה.דגירה למשך 45 עד 60 דקות בטמפרטורת החדר בתא חשוך ולח. חזור על השלבים לשטיפת השקופיות והסרת ה- PBS העודף פעם נוספת והוסף 20 מיקרוליטרים של ריאגנט ההרכבה באופן טיפתי לשקופיות. הניחו את החלקת הכיסוי על גביה והימנעו מבועות.הניחו טיפה של שמן טבילה ליד החלקה העליונה של המגלשה שבה התאים היו מונחים. השתמש בערוץ הירוק וחפש את הנקודות הירוקות ברקע כדי למצוא את המוקד. פתח את תוכנת חבילת היישומים של Leica, לחץ על רכישה ובחר את הערוץ הירוק.התאם את ההגדרות של הערוץ הירוק לפני הניתוח. לאחר מכן, שנה לערוץ האדום והתאם את ההגדרות. מצא את הריכוז העיקרי של סיבים ועבור לקצוות כדי למצוא את הסיבים הבודדים המפוזרים היטב, שאינם חופפים.השתמש בערוץ אחד בלבד כדי לבחור את האזורים עבור התמונות ולהימנע מהטיה פוטנציאלית. לחץ על סמל רכישת שכבת-על והתאם את התוכנה להגדלה הנכונה של המיקרוסקופ. צלם כ-15 עד 20 תמונות לכל שקופית לצד השקופית כולה בערוץ הירוק ולאחר מכן בערוץ האדום.שני הערוצים ממוזגים כעת והכיסוי שנוצר מועבר לתיקיה ייחודית. ניתן לראות את הסיבים עם צבעים אדומים וירוקים. פתח את תוכנת ImageJ, לחץ לחיצה ימנית על הסמל החמישי, בחר באפשרות השנייה ולאחר מכן בחר בכלי קו מפולח.לחץ לחיצה שמאלית כדי לצייר את הנתיב המדויק של הדרך האדומה או הירוקה ולחץ לחיצה ימנית כדי לעצור את הציור. לחץ על לחצן M במקלדת כדי למדוד את האורך. עבור סיבי S1, עקוב אחר מדידות דרכי האדמה האדומות והירוקות עבור כל סיב ומדוד את אורכי דרכי האדמה האדומים והירוקים מלפחות 150 סיבים מתמונות שונות.סיב S1 מוצג בתמונות מייצגות אלה. מערכת דנ"א מתהווה-בקרה ללא הפערים ואטומה לביקוע על ידי נוקלאז S1 מוצגת כאן. מערכת דנ"א חיובית לפערים שנבקעו על ידי הנוקלאז S1 הביאה לקיצור אורך דרכי ה-CldU.ניתן לבצע סכמת תיוג דיפרנציאלית המתוארת בהרחבה בכתב היד של הטקסט כדי לתייג אירועים למילוי פערים. במבחן זה, שנקרא מבחן מילוי פערים, רצועות IDU ארוכות יותר עם לפחות תיקון CldU אחד או פחות תיקוני CldU מתאימים לצפיפות מילוי פער נמוכה. דרכי IDU קצרות יותר, עם לפחות תיקון CldU אחד, ודרכי IDU ארוכות יותר עם יותר טלאי CldU, תואמות לצפיפות מילוי פער גבוהה.שלב החדירה של פרוטוקול זה הוא חיוני עבור נוקלאז S1 כדי לפעול על הפערים שנוצרו במהלך שכפול של דנ"א פגום. ניתן להשתמש בנוקלאז S1 גם בפרוטוקול בדיקת השביט כדי לזהות את הפערים שנוצרו במהלך שכפול הדנ"א הפגום שנמשך לאחר הטיפול. בדיקת סיבי S1 סללה את הדרך לפרדיגמה החדשה שלפיה פערים לאחר שכפול עלולים לגרום לפגיעות לסרטן, במיוחד בסרטן השד והשחלות הנושא מוטציות בגנים BRCA1 ו-2.

Research

JoVE Journal

Genetics

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

איתור של שינוי מספר העתקה באמצעות רצף תא יחיד

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Atomic Force Microscopy Investigations of DNA Lesion Recognition in Nucleotide Excision Repair

כוח מיקרוסקופי אטומי חקירות של דלקת הנגע הכרה תיקון כריתה נוקליאוטידים

AFM imaging is a powerful technique for the study of protein-DNA interactions. This single molecule method allows the simultaneous resolution of different ...

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

Immunostaining עבור שינויים DNA: ניתוח חישובית של תמונות קונפוקלי

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

שיבוש גנטי יעילים ביותר מאתר ואנושי Hematopoietic ובתאים מאת CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

A Simple, Rapid, and Quantitative Assay to Measure Repair of DNA-protein Crosslinks on Plasmids Transfected into Mammalian Cells

הנועד פשוטה, מהירה, כמותית למדוד תיקון של חלבון-דנ א Crosslinks על פלסמידים Transfected בתרבית של תאים

The purpose of this method is to provide a flexible, rapid, and quantitative technique to examine the kinetics of DNA-protein crosslink (DPC) repair in ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

אירוע נדיר איתור שגיאות DNA ו RNA רצף

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

מתודולוגיה עבור איתור מדויק של מתילציה DNA מיטוכונדריאלי

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

ATAC-seq Assay with Low Mitochondrial DNA Contamination from Primary Human CD4+ T Lymphocytes

האטא ק-seq Assay עם זיהום נמוכה דנ א מיטוכונדריאלי של ראשי האדם CD4 + לימפוציטים מסוג T

ATAC-seq has become a widely used methodology in the study of epigenetics due to its rapid and simple approach to mapping genome-wide accessible ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay Using Micrococcal Nucleases in Mammalian Cells

כרומטין Immunoprecipitation שימוש בנוקלאוסים מיקרוקוקל בתאי מיונקים

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene ...

Use of Frozen Tissue in the Comet Assay for the Evaluation of DNA Damage

שימוש ברקמות קפואות בתוך שיטת שביט להערכת נזק לדנ א

The comet assay is gaining popularity as a means to assess DNA damage in cultured cells and tissues, particularly following exposure to chemicals or other ...