Name: detection of post-replicative gaps accumulation and repair in human cells using the dna fiber assay
Uploaded: 2022-02-03T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Post-Replicative Gaps Accumulation and Repair in Human Cells Using the DNA Fiber Assay at JoVE.com

C.F.M.M.研究所での研究は、FAPESPとオランダ科学研究機構(NWO、オランダ)の国際共同研究の下で、サンパウロ財団(ブラジル、サンパウロ、FAPESP、助成金#2019/19435-3、#2013/08028-1、2017/05680-0)の支援を受けています。Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, Brasília, DF, Brazil, Grants # 308868/2018-8] および Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal do Ensino Superior (CAPES, Brasília, DF, Brazil, Finance Code 001).

この研究はヒト細胞を使用しているため、この研究はサンパウロ大学生物医学研究所の倫理委員会(ICB-USP、承認番号#48347515.3.00005467)によってヒトサンプルを用いた研究のために承認されました。
注:ここで説明するプロトコルは、以前の出版物で使用されており、若干の変更が加えられています14,16,28。</sup...

<ol>
	<li>Rupp, W. D., Howard-Flanders, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discontinuities+in+the+DNA+synthesized+in+an+excision-defective+strain+of+Escherichia+coli+following+ultraviolet+irradiation.">Discontinuities in the DNA synthesized in an excision-defective strain of Escherichia coli following ultraviolet irradiation.</a> Journal of Molecular Biology. 31 (2), 291-304 (1968).</li><li>Meneghini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gaps+in+DNA+synthesized+by+ultraviolet+light-irradiated+WI38+human+cells.">Gaps in DNA synthesized by ultraviolet light-irradiated WI38 human cells.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 425 (4), 419-427 (1976).</li><li>Meneghini, R., Cordeiro-Stone, M., Schumacher, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+and+frequency+of+gaps+in+newly+synthesized+DNA+of+xeroderma+pigmentosum+human+cells+irradiated+with+ultraviolet+light.">Size and frequency of gaps in newly synthesized DNA of xeroderma pigmentosum human cells irradiated with ultraviolet light.</a> Biophysical Journal. 33 (1), 81-92 (1981).</li><li>Lopes, M., Foiani, M., Sogo, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+mechanisms+control+chromosome+integrity+after+replication+fork+uncoupling+and+restart+at+irreparable+UV+lesions.">Multiple mechanisms control chromosome integrity after replication fork uncoupling and restart at irreparable UV lesions.</a> Molecular Cell. 21 (1), 15-27 (2006).</li><li>Heller, R. C., Marians, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+fork+reactivation+downstream+of+a+blocked+nascent+leading+strand.">Replication fork reactivation downstream of a blocked nascent leading strand.</a> Nature. 439 (7076), 557-562 (2006).</li><li>Bianchi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PrimPol+bypasses+UV+photoproducts+during+eukaryotic+chromosomal+DNA+replication.">PrimPol bypasses UV photoproducts during eukaryotic chromosomal DNA replication.</a> Molecular Cell. 52 (4), 566-573 (2013).</li><li>Garc&#237;a-G&#243;mez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PrimPol,+an+archaic+primase/polymerase+operating+in+human+cells.">PrimPol, an archaic primase/polymerase operating in human cells.</a> Molecular Cell. 52 (4), 541-553 (2013).</li><li>Mour&#243;n, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repriming+of+DNA+synthesis+at+stalled+replication+forks+by+human+PrimPol.">Repriming of DNA synthesis at stalled replication forks by human PrimPol.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 20 (12), 1383-1389 (2013).</li><li>Wan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hPrimpol1/CCDC111+is+a+human+DNA+primase-polymerase+required+for+the+maintenance+of+genome+integrity.">hPrimpol1/CCDC111 is a human DNA primase-polymerase required for the maintenance of genome integrity.</a> EMBO Reports. 14 (12), 1104-1112 (2013).</li><li>Keen, B. A., Jozwiakowski, S. K., Bailey, L. J., Bianchi, J., Doherty, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+dissection+of+the+domain+architecture+and+catalytic+activities+of+human+PrimPol.">Molecular dissection of the domain architecture and catalytic activities of human PrimPol.</a> Nucleic Acids Research. 42 (9), 5830-5845 (2014).</li><li>Tirman, S., Cybulla, E., Quinet, A., Meroni, A., Vindigni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRIMPOL+ready,+set,+reprime.">PRIMPOL ready, set, reprime.</a> Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 56 (1), 17-30 (2021).</li><li>Quinet, A., Lerner, L. K., Martins, D. J., Menck, C. F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filling+gaps+in+translesion+DNA+synthesis+in+human+cells.">Filling gaps in translesion DNA synthesis in human cells.</a> Mutation Research, Genetic Toxicology Environmental Mutagenesis. 836, 127-142 (2018).</li><li>Ziv, O., Diamant, N., Shachar, S., Hendel, A., Livneh, Z., Bjergb&#230;k, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+measurement+of+translesion+DNA+synthesis+in+mammalian+cells.">Quantitative measurement of translesion DNA synthesis in mammalian cells.</a> DNA Repair Protocols. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). 920, (2012).</li><li>Quinet, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translesion+synthesis+mechanisms+depend+on+the+nature+of+DNA+damage+in+UV-irradiated+human+cells.">Translesion synthesis mechanisms depend on the nature of DNA damage in UV-irradiated human cells.</a> Nucleic Acids Research. 44 (12), 5717-5731 (2016).</li><li>T&#233;cher, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+dynamics:+biases+and+robustness+of+DNA+fiber+analysis.">Replication dynamics: biases and robustness of DNA fiber analysis.</a> Journal of Molecular Biology. 425 (23), 4845-4855 (2013).</li><li>Quinet, A., Carvajal-Maldonado, D., Lemacon, D., Vindigni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+fiber+analysis:+Mind+the+gap.">DNA fiber analysis: Mind the gap.</a> Methods in Enzymology. 591, 55-82 (2017).</li><li>Elvers, I., Johansson, F., Groth, P., Erixon, K., Helleday, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UV+stalled+replication+forks+restart+by+re-priming+in+human+fibroblasts.">UV stalled replication forks restart by re-priming in human fibroblasts.</a> Nucleic Acids Research. 39 (16), 7049-7057 (2011).</li><li>Diamant, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+bypass+operates+in+the+S+and+G2+phases+of+the+cell+cycle+and+exhibits+differential+mutagenicity.">DNA damage bypass operates in the S and G2 phases of the cell cycle and exhibits differential mutagenicity.</a> Nucleic Acids Research. 40 (1), 170-180 (2012).</li><li>Temviriyanukul, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporally+distinct+translesion+synthesis+pathways+for+ultraviolet+light-induced+photoproducts+in+the+mammalian+genome.">Temporally distinct translesion synthesis pathways for ultraviolet light-induced photoproducts in the mammalian genome.</a> DNA Repair. 11 (6), 550-558 (2012).</li><li>Jansen, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redundancy+of+mammalian+Y+family+DNA+polymerases+in+cellular+responses+to+genomic+DNA+lesions+induced+by+ultraviolet+light.">Redundancy of mammalian Y family DNA polymerases in cellular responses to genomic DNA lesions induced by ultraviolet light.</a> Nucleic Acids Research. 42 (17), 11071 (2014).</li><li>Quinet, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap-filling+and+bypass+at+the+replication+fork+are+both+active+mechanisms+for+tolerance+of+low-dose+ultraviolet-induced+DNA+damage+in+the+human+genome.">Gap-filling and bypass at the replication fork are both active mechanisms for tolerance of low-dose ultraviolet-induced DNA damage in the human genome.</a> DNA Repair. 14 (1), 27-38 (2014).</li><li>Callegari, A. J., Clark, E., Pneuman, A., Kelly, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postreplication+gaps+at+UV+lesions+are+signals+for+checkpoint+activation.">Postreplication gaps at UV lesions are signals for checkpoint activation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (18), 8219-8224 (2010).</li><li>Vogt, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+further+properties+of+single-strand-specific+nuclease+from+Aspergillus+oryzae.">Purification and further properties of single-strand-specific nuclease from Aspergillus oryzae.</a> European Journal of Biochemistry. 33 (1), 192-200 (1973).</li><li>Cordeiro-Stone, M., Schumacher, R. I., Meneghini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+replication+fork+in+ultraviolet+light-irradiated+human+cells.">Structure of the replication fork in ultraviolet light-irradiated human cells.</a> Biophysical Journal. 27 (2), 287-300 (1979).</li><li>Lehmann, A. R., Fuchs, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gaps+and+forks+in+DNA+replication:+Rediscovering+old+models.">Gaps and forks in DNA replication: Rediscovering old models.</a> DNA Repair (Amst). 5 (12), 1495-1498 (2006).</li><li>Daigaku, Y., Davies, A. A., Ulrich, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin-dependent+DNA+damage+bypass+is+separable+from+genome+replication.">Ubiquitin-dependent DNA damage bypass is separable from genome replication.</a> Nature. 465 (7300), 951-955 (2010).</li><li>Karras, G. I., Jentsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RAD6+DNA+damage+tolerance+pathway+operates+uncoupled+from+the+replication+fork+and+is+functional+beyond+S+phase.">The RAD6 DNA damage tolerance pathway operates uncoupled from the replication fork and is functional beyond S phase.</a> Cell. 141 (2), 255-267 (2010).</li><li>Tirman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporally+distinct+post-replicative+repair+mechanisms+fill+PRIMPOL-dependent+ssDNA+gaps+in+human+cells.">Temporally distinct post-replicative repair mechanisms fill PRIMPOL-dependent ssDNA gaps in human cells.</a> Molecular Cell. 81 (19), 4026-4040 (2021).</li><li>Cong, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+gaps+are+a+key+determinant+of+PARP+inhibitor+synthetic+lethality+with+BRCA+deficiency.">Replication gaps are a key determinant of PARP inhibitor synthetic lethality with BRCA deficiency.</a> Molecular Cell. 81 (15), 3128-3144 (2021).</li><li>Quinet, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRIMPOL-mediated+adaptive+response+suppresses+replication+fork+reversal+in+BRCA-deficient+cells.">PRIMPOL-mediated adaptive response suppresses replication fork reversal in BRCA-deficient cells.</a> Molecular Cell. 77 (3), 461-474 (2020).</li><li>Jackson, D. A., Pombo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replicon+clusters+are+stable+units+of+chromosome+structure:+evidence+that+nuclear+organization+contributes+to+the+efficient+activation+and+propagation+of+S+phase+in+human+cells.">Replicon clusters are stable units of chromosome structure: evidence that nuclear organization contributes to the efficient activation and propagation of S phase in human cells.</a> The Journal of Cell Biology. 140 (6), 1285-1295 (1998).</li><li>Schwab, R. A., Niedzwiedz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+DNA+replication+in+the+vertebrate+model+system+DT40+using+the+DNA+fiber+technique.">Visualization of DNA replication in the vertebrate model system DT40 using the DNA fiber technique.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (56), e3255 (2011).</li><li>Simoneau, A., Xiong, R., Zou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+trans+cell+cycle+effects+of+PARP+inhibitors+underlie+their+selectivity+toward+BRCA1/2-deficient+cells.">The trans cell cycle effects of PARP inhibitors underlie their selectivity toward BRCA1/2-deficient cells.</a> Genes &amp; Development. 35 (17-18), 1271-1289 (2021).</li><li>Taglialatela, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=REV1-Pol&#950;+maintains+the+viability+of+homologous+recombination-deficient+cancer+cells+through+mutagenic+repair+of+PRIMPOL-dependent+ssDNA+gaps.">REV1-Pol&#950; maintains the viability of homologous recombination-deficient cancer cells through mutagenic repair of PRIMPOL-dependent ssDNA gaps.</a> Molecular Cell. 81 (19), 4008-4025 (2021).</li><li>Lim, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=USP1+Is+required+for+replication+fork+protection+in+BRCA1-deficient+tumors.">USP1 Is required for replication fork protection in BRCA1-deficient tumors.</a> Molecular Cell. 72 (6), 925-941 (2018).</li><li>Peng, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposing+roles+of+FANCJ+and+HLTF+protect+forks+and+restrain+replication+during+stress.">Opposing roles of FANCJ and HLTF protect forks and restrain replication during stress.</a> Cell Reports. 24 (12), 3251-3261 (2018).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA+translocase+FANCM/MHF+promotes+replication+traverse+of+DNA+interstrand+crosslinks.">The DNA translocase FANCM/MHF promotes replication traverse of DNA interstrand crosslinks.</a> Molecular Cell. 52 (3), 434-446 (2013).</li><li>Ding, W., Bishop, M. E., Lyn-Cook, L. E., Davis, K. J., Manjanatha, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+alkaline+comet+assay+and+enzyme-modified+alkaline+comet+assay+for+measuring+DNA+strand+breaks+and+oxidative+DNA+damage+in+rat+liver.">In vivo alkaline comet assay and enzyme-modified alkaline comet assay for measuring DNA strand breaks and oxidative DNA damage in rat liver.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (111), e53833 (2016).</li><li>Lu, Y., Liu, Y., Yang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+in+vitro+DNA+damage+using+comet+assay.">Evaluating in vitro DNA damage using comet assay.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (128), e56450 (2017).</li></ol>

標準的なDNAファイバーアッセイプロトコルの重要なステップは、以前の刊行物32で議論された。ここでは、複製後のssDNAギャップの存在とギャップ充填によるそれらの修復を調査するための標準的なDNAファイバーアッセイの改変バージョンについて述べる(14で最初に記載)。複製後のssDNAギャップ存在の文脈において、S1ファイバープロトコルにおけるS1ヌク?...

精液研究は、細菌1およびヒト細胞2,3におけるDNA損傷剤による処理時に、複製後一本鎖(ssDNA)ギャップの蓄積の証拠を提供している。損傷したDNAテンプレートの複製中、DNA合成機構は、特異的な病変転移合成DNAポリメラーゼを採用することによって、またはテンプレート切り替え機構を介して病変をバイパスすることができる。あるいは、レプリソームはまた、ssDNAギャップを残して病変を単にスキップし、後で修復することもできる。より最近では、遺伝毒性物質による治療が、電子顕微鏡法を利用して複製中間体の特異的構造を可視化することによって、真核生物のssDNAギャップをもたらすことが明らかに示された研究4。複製後ギャップのこれらの領域の形成は、DNA複製の半不連続モードの単純な結果であると最初に提案された2。この場合、遅れ鎖上の病変は岡崎断片の伸長を遮ることができるが、フォークの進行は次の岡崎断片によって自然に救助され、ssDNAギャップが残る。しかし、さらなる研究は、細菌5で最初に示されたように、先行鎖上のギャップの形成も可能であることを実証した。真核生物において、プリマーゼ活性を有するユニークなDNAポリメラーゼであるPRIMPOLは、そのリプライミング活性を介して複製遮断病変の下流でDNA合成を再開できることが示された6、7、8、9、10、11。したがって、PRIMPOL primase活性は、ヒト細胞12においてDNA損傷剤で処理した際の先行鎖における複製後ssDNAギャップの形成を説明し得る。それにもかかわらず、これらのギャップの検出ならびにギャップ修復は、最近まで、電子顕微鏡4またはプラスミドベースのアッセイ13などの間接的または時間のかかるアプローチを必要とした。ヒト細胞のギャップを検出するためのssDNA特異的S1ヌクレアーゼの使用は、スクロース勾配技術を用いた40年以上前の初期の研究によって開拓された2,3。より最近では、我々のグループは、DNAファイバーアッセイや彗星アッセイなどの他の方法を用いて、DNAを複製する際のssDNAを検出するために、このヌクレアーゼの使用を適用した14。これらの新しいアプローチは、複製後のギャップに関する研究の現在の急増への道を開いた。ここでは、S1ヌクレアーゼを使用してDNAファイバーアッセイによる複製後のssDNAギャップを検出する戦略を説明し、DNAファイバープロトコルの差動標識スキームがこれらのギャップの修復の研究をどのように可能にできるかを説明する。
DNAファイバーアッセイは、ますます多くのラボで使用されている強力な技術であり、レプリケーションフォークダイナミクスとレプリケーションストレス応答メカニズムに関する貴重な洞察を提供してきました。簡単に述べると、この技術は、ヌクレオチド類似体(CldU−5−クロロ−2'−デオキシウリジン−、およびIdU−5−ヨード−2'−デオキシウリジンなど)の複製DNAへの逐次的な組み込みに基づいている。回収後、細胞を溶解し、DNA分子を正にコーティングしたスライドガラス上に広げる。その後、CldUおよびIdUは特異的抗体によって検出され、蛍光顕微鏡で二色繊維として可視化することができる。最後に、IdU および CldU 管の長さを測定して、DNA 損傷誘導の結果としての DNA 複製ダイナミクスの変化を同定します。この技術は、フォーク失速、フォーク減速、新生DNA分解、および起源発火の頻度の変動などの異なる現象を調査するために利用することができる15,16。
DNAファイバーアッセイの限界の1つは、数キロ塩基の分解能です。複製後のssDNAギャップは数百塩基の範囲にある可能性があるため、標準的なDNAファイバープロトコルによってこれらのギャップを直接視覚化することは不可能です。遺伝毒性物質で処理されたヒト細胞における複製DNA上のssDNAギャップの存在は、以前に間接的に関与していた。例えば、ssDNA結合タンパク質のリクルートによって評価されるssDNAの観察は、複製プロテインA(RPA)、S期外の細胞において、またはアルカリDNA解舒によって検出されるようなssDNAの形成と、DNAファイバーアッセイによる長時間のフォークストールの不在との組み合わせ12、17、18、19、20、21 ssDNAギャップの蓄積に起因するものであった。さらに、複製後のssDNAギャップは、ATR依存性のG2/M期チェックポイントを誘導し、複製毒18、19、20、21、22で処理された細胞を逮捕する。
S1ヌクレアーゼは、5'-ホスホリルモノヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを放出する一本鎖核酸を分解し、RNAと比較してssDNAに対して5倍高い親和性を有する。二本鎖核酸(DNA:DNA、DNA:RNA、またはRNA:RNA)は、極端に高濃度で使用される場合を除き、S1ヌクレアーゼに対して耐性を有する。S1ヌクレアーゼはまた、ニック、ギャップ、ミスマッチ、またはループによって引き起こされる一本鎖領域で二本鎖DNAを切断する。したがって、S1ヌクレアーゼは、ssDNAギャップを切断することができるssDNA特異的エンドヌクレアーゼであり、最終的に二本鎖切断23、24を生成する。したがって、S1ヌクレアーゼ消化のためのステップをDNAファイバープロトコルに間接的に追加することにより、複製後のssDNAギャップの検出が可能になる。ギャップの存在下では、DNA拡散の前にS1ヌクレアーゼで露出した核を処理すると、ギャップ14に本質的に存在するssDNAのS1切断の結果として、より短いトラクトが生成されます。したがって、トラクト短縮は、このアプローチを用いたssDNAギャップの読み出しである。標準的なDNAファイバープロトコルと比較して、S1ヌクレアーゼを用いたDNAファイバーは、核曝露(細胞透過処理)およびS1ヌクレアーゼによる処理の2つの余分なステップしか必要としない。遺伝毒性物質で処理したがS1ヌクレアーゼを含まないサンプルや、遺伝毒性物質を含まないS1ヌクレアーゼで処理したサンプルなど、適切なコントロールが必須であることに注意することが重要です。類似体の組み込み、S1処理、および拡散を含むプロトコル自体は、1日で実行することができ、例外的な材料を必要としない。必要なのは、チミジン類似体、精製S1ヌクレアーゼ、適切な一次抗体および二次抗体、および蛍光顕微鏡のみです。全体として、S1ヌクレアーゼを採用したDNAファイバーは、比較的単純なアプローチを使用して、進行中の複製フォーク上のssDNAギャップを検出する。
複製ストレス応答機構の結果として形成された複製後ssDNAギャップは、ギャップ充填または複製後修復(PRR)25と呼ばれるプロセスにおいて、病変転移DNA合成またはテンプレートスイッチングを含む異なる機構によって修復(または充填)され得る25。これらのプロセスは、進行するフォークの後ろで起こり、複製に依存しないDNA合成を伴う14,26,27。これらの知見に基づいて、標準的なDNAファイバーアッセイとは異なる標識スキームを実行して、G2相におけるギャップ充填事象を直接視覚化することができる14、16、26、28。具体的には、1つのチミジン類似体は、遺伝毒性治療および複製後のssDNAギャップ形成時に複製フォークを標識するために使用でき、一方、別のチミジン類似体は、ギャップ充填事象を標識するために使用することができる。このプロトコールでは、細胞は、1時間の遺伝毒性処理の直後またはそれと同時に、第1のチミジン類似体(例えばIdU)で標識され、その結果、新生DNAはギャップ形成時に標識される。ノコダゾールは、G2 / Mの細胞を停止させるために12〜24時間の間の任意の場所で治療時に添加され、以下のS期を防止する。ノコダゾール処理の最後の4時間のために、第2のチミジン類似体(例えばCldU)を、ギャップ充填中に組み込まれる媒体に添加する。重要なことに、このアッセイは、CldUからのギャップ充填シグナルがS期の複製DNAへのCldUの取り込みによるシグナルと区別できないため、G2のギャップ充填事象を検出するためにのみ使用することができる。したがって、バックグラウンドシグナルを最小限に抑えるために、損傷誘導後のCldU取り込みのタイミングは、細胞集団の大部分がG2期14に入っているときと一致するべきである。したがって、このタイミングは、細胞株および処理条件によって異なるであろう。このアッセイを採用する前に細胞周期の進行を最適化することが推奨される。これらのチミジン類似体の共染色により、ssDNAギャップが生成されたときに遺伝毒性処理中に合成された新生DNA(IdUトラクト)の上にギャップ充填(PRR)トラクト(CldUパッチ)を可視化することができます。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid, Glacial</td>
			<td>Synth</td>
			<td>64-19-7</td>
			<td>Alternatively, BSA - Biosera - REF PM-T1725/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium hydroxide</td>
			<td>Synth</td>
			<td>1336-21-6</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody anti-mouse IgG1 Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11005</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody anti-rat Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21470</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody Mouse anti-BrdU</td>
			<td>Becton Disckson</td>
			<td>347580</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody Rat anti-BrdU</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>&#160;Ab6326</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological security hood</td>
			<td>Pachane</td>
			<td>PA 410</td>
			<td>Use hood present in the laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (Bovine Serum Albumin)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3294</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>179693</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CldU</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>C6891</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cloridric acid</td>
			<td>Synth</td>
			<td>7647-01-0</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Zeiss LSM Series (7, 8 or 9)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass (or coverslips)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>152460</td>
			<td>Alternatively, Olen - Kasvi Cover Glass (24 x 60 mm) - K5-2460</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM - High Glucose</td>
			<td>LGC/Gibco</td>
			<td>BR30211-05/12100046</td>
			<td>Use culture media specific for the cell line used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E5314</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence Microscope Axiovert 200</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12657-029</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forma Series II Water Jacketed CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific 3110</td>
			<td>13-998-074</td>
			<td>Use cell incubator present in the laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide jar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5516</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Idu</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>I7125</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Synth</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>67-56-1</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Denville</td>
			<td>M1021</td>
			<td>Alternatively, Olen - Kasvi Microscope Slides - K5-7105 OR Precision Glass Line - 7105-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS (&#193;cido 3-morfolinopropano 1-sulf&#244;nico)</td>
			<td>Synth</td>
			<td>1132-61-2</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nocodazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31430-18-9</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate Buffer Saline)</td>
			<td>Life Thechnologies</td>
			<td>3002</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold AntiFade Mountant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36930</td>
			<td>Any antifade moutant solution for immunofluorescence could be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S1 nuclease purified from Aspergillus oryzae</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18001-016</td>
			<td>Pre-dilute the S1 nuclease (1/100 - 1/200) in S1 nuclease dilution buffer provided by the manufacturer, aliquote and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0302</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate Trihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>6131-90-4</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Synth</td>
			<td>&#160;7647-14-5</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>57-50-1</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>West Lab Research</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Synth</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200072</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UVC Lamp</td>
			<td>Non Specific</td>
			<td>-</td>
			<td>Essential: emission lenght of 254 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VLX-3W UV Radiometer</td>
			<td>Vilber Loumart</td>
			<td>-</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>557-34-6</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of post-replicative gaps accumulation and repair in human cells using the dna fiber assay

DNAファイバーアッセイは、ヒト細胞におけるDNA合成中に組み込まれるヌクレオチド類似体の免疫検出に基づいて、複製フォークダイナミクスを分析するための簡単で堅牢な方法です。しかし、この手法の分解能は数千キロベースに制限されています。その結果、複製後の一本鎖DNA(ssDNA)ギャップは数百塩基ほど小さく、標準的なアッセイでは検出できません。ここでは、ssDNAを特異的に切断する酵素であるS1ヌクレアーゼを利用するDNAファイバーアッセイの改変版について説明する。複製後のssDNAギャップの存在下で、S1ヌクレアーゼはギャップを標的にして切断し、進行中のフォーク上のssDNAギャップの読み出しとして使用できるより短いトラクトを生成する。これらの複製後のssDNAギャップは、損傷したDNAが不連続に複製されるときに形成される。それらは、ゲノム複製から結合されていないメカニズム を介して 、ギャップ充填または複製後修復として知られるプロセスで修復することができる。ギャップ充填機構はS相とは無関係にDNA合成を伴うため、DNAファイバー標識スキームの変化を利用してギャップ充填事象を監視することもできます。全体として、DNAファイバーアッセイのこれらの改変は、複製後のギャップがヒト細胞のゲノムにどのように形成され、埋められるかを理解するための強力な戦略です。

S1ファイバーアッセイでは、遺伝毒性物質による処理が複製後のssDNAギャップにつながる場合、S1処理された核からのDNAファイバーの全長は、未処理のサンプルおよび遺伝毒性物質で処理されたがS1切断に提出されなかったサンプルと比較して、DNA損傷による処理時に短くなります(図1)。
あるいは、S1ヌクレアーゼによる治療が未処理の細胞と比較し?...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Post-Replicative Gaps Accumulation and Repair in Human Cells Using the DNA Fiber Assay at JoVE.com

Detection of Post-Replicative Gaps Accumulation and Repair in Human Cells Using the DNA Fiber Assay

ここでは、病変誘導後のDNA複製における一本鎖DNAギャップを調べるためのDNAファイバーアッセイの2つの改変について説明する。S1ファイバーアッセイは、ssDNA特異的S1エンドヌクレアーゼを使用して複製後ギャップの検出を可能にし、ギャップ充填アッセイはギャップ修復の視覚化および定量を可能にする。

DNAファイバーアッセイを用いたヒト細胞における複製後ギャップの蓄積と修復の検出

The DNA fiber assay is a simple and robust method for the analysis of replication fork dynamics, based on the immunodetection of nucleotide analogs that ...

私たちのプロトコルは、損傷したDNA上で複製がどのように起こるかを調査する新しい可能性を開きます。この技術は、DNA病変の反対側の一本鎖DNAギャップの形成および修復を検出することができる。S1ヌクレアーゼは、一本鎖DNAを切断し、複製後のギャップの検出を可能にする。このアプローチは、1970年代にブラジルでMeneghini博士とCordiero-Stone博士によって最初に使用され、最近DNAファイバーアッセイに適応しました。ここで説明する技術を使用して複製後ギャップの形成と修復を研究することで、ゲノムの完全性を維持するDNA修復と複製ストレス応答のメカニズムに関する洞察を得ることができます。本明細書に記載される両方のプロトコルについて、S1ファイバおよびギャップ充填アッセイには、データの正確な解釈を確実にするためにすべての制御を含めることが極めて重要である。この手順は、私たちの研究室の博士課程の学生であるDavi J.Martinsと、私たちのグループで働く際に以前にこれらの技術を開発した共同研究者であるAnnabel Quinet博士によって実証されます。まず、培養培地を吸引し、直ちに20マイクロモルのIDU培地を含む培養培地を細胞に加える。細胞を摂氏37度と二酸化炭素5%で正確に20分間インキュベートする。その後、予め加温したPBSで細胞を2回素早く洗浄し、1メートル平方UV-Cあたり20ジュールを照射する。未処理のセルをコントロールとして使用します。直ちに200マイクロモルのCldUを含む培地を細胞に加え、摂氏37度および二酸化炭素5%で正確に60分間インキュベートする。その後、予め加温したPBSで細胞を2回洗浄し、室温で細胞株に従ってCSK 100バッファーで2〜10分間透過処理する。CSK透過処理後、透過処理前のものと比較して、細胞質をほとんど持たない核が見られる。PBSを各ウェルの側面に慎重に注ぎ、PBSで核を洗浄する。その後、核をS1緩衝液で洗浄する。S1バッファー中の核を、1ミリリットル当たり20単位のS1ヌクレアーゼと共に、そしてS1ヌクレアーゼを用いずに、摂氏37度で30分間インキュベートする。次に、S1 バッファーを吸引し、PBS に 0.1% BSA を追加します。原子核をこすり、約注釈付きの1.5ミリリットルのチューブに移します。チューブは常に氷の上に置いてください。核を約4, 600倍のGで4°Cで5分間遠心分離する。ペレットをPBS中に約1,500細胞/マイクロリットルの濃度で再懸濁する。チューブを氷の上に置き、すぐにプロトコールを広げることによってDNA繊維調製に進む。顕微鏡スライドにカーボンペンシルで注釈を付け、トレイの上に平らに置きます。均質化を確実にするためにチューブの底部をタップし、対応するスライドの上部に2マイクロリットルの細胞を加える。6マイクロリットルの溶解バッファーを加え、上下約5回ピペッティングして細胞を溶解する。ピペットチップを使用して滴をスライドの底部に向かってわずかに引っ張り、室温で5分間インキュベートして核を溶解します。スライドを約 20 ~ 40 度傾け、一定の低速でスライドの底まで落下が広がるようにします。スライドを室温の暗闇の中で10〜15分間乾燥させます。次いで、それらを新しく調製した固定溶液を入れた瓶に浸し、室温で5分間インキュベートしてDNAをスライド上に固定する。スライドをPBSで5分間2回洗浄し、新しく調製した2.5モルのクロリド酸でDNAを室温で40〜60分間変性させる。スライドをPBSで5分間3回洗浄し、以前に37°Cで30〜60分間温めた5%BSAでブロックします。用紙を軽くタップして、余分な液体をスライドから取り除きます。スライドに30マイクロリットルの一次抗体を滴下し、その上にカバースリップを置きます。暗所の湿気の多いチャンバー内で室温で1〜1.5時間インキュベートする。スライドをPBSの入った瓶に入れて1〜2分間置き、カバースリップを慎重に取り外します。PBSTを瓶に入れて5分間3回洗浄し、スライドをPBSに入れます。紙を軽く叩いて余分な液体を取り除き、30マイクロリットルの二次抗体をスライドに滴下して加えます。カバースリップを上に置きます。暗湿したチャンバー内で室温で45〜60分間インキュベートする。スライドを洗浄し、余分なPBSをもう一度除去する手順を繰り返し、20マイクロリットルのマウント試薬をスライドに滴下して加えます。カバースリップを上に置き、泡を避けてください。細胞が溶解したスライドの上部近くに浸漬油の滴を置きます。緑色のチャンネルを使用し、背景の緑色の点を検索してフォーカスを見つけます。Leica Application Suiteソフトウェアを開き、[取得]をクリックして、緑色のチャンネルを選択します。解析前に緑色のチャンネルの設定を調整します。次に、赤いチャンネルに変更し、設定を調整します。繊維の主な濃度を見つけ、エッジに移動して、よく広がる、重なり合っていない個々の繊維を見つけます。1 つのチャンネルのみを使用して画像の領域を選択し、潜在的なバイアスを回避します。オーバーレイの取得アイコンをクリックし、正しい顕微鏡倍率になるようにソフトウェアを調整します。スライドごとに約 15 ~ 20 枚の写真を、スライド全体と一緒に緑のチャンネルで撮影し、次に赤のチャンネルで撮影します。これで 2 つのチャンネルがマージされ、作成されたオーバーレイが一意のフォルダーに移動されます。赤と緑の色の繊維を見ることができます。ImageJソフトウェアを開き、5番目のアイコンを左クリックし、2番目のオプションを選択してから、セグメント化された線ツールを選択します。左クリックして赤または緑の地区の正確なパスを描画し、右クリックして描画を停止します。キーボードのMボタンを押して長さを測定します。S1 ファイバーの場合、各ファイバーの赤と緑のトラクトの測定値を追跡し、異なる画像から少なくとも 150 本のファイバーから赤と緑のトラクトの長さを測定します。S1ファイバは、これらの代表的な画像に示されている。S1ヌクレアーゼによる切断に対して隙間がなくかつ不浸透性の対照新生DNA管がここに示されている。S1ヌクレアーゼによって切断されたギャップに対して陽性のDNA管は、より短いCldU管長をもたらした。テキスト原稿に広く記述されている差分ラベル付けスキームを実行して、ギャップを埋めるイベントにラベルを付けることができます。ギャップ充填アッセイと名付けられたこのアッセイでは、少なくとも1つのCldUパッチまたはより少ないCldUパッチを有するより長いIDUトラックは、低いギャップ充填密度に対応する。少なくとも 1 つの CldU パッチを持つ短い IDU トラクトと、より多くの CldU パッチを持つ長い IDU トラクトは、高いギャップ充填密度に対応します。このプロトコルの透過処理ステップは、S1ヌクレアーゼが損傷したDNAの複製中に形成されたギャップに作用するために極めて重要である。S1ヌクレアーゼは、彗星アッセイプロトコルにおいて、治療後に持続する損傷DNAの複製中に形成されるギャップを検出するためにも使用することができる。S1ファイバーアッセイは、複製後のギャップが、特にBRCA1および2遺伝子に変異を有する乳がんおよび卵巣がんにおいて、がんの脆弱性を引き起こす可能性があるという新しいパラダイムへの道を開いた。

Research

JoVE Journal

Genetics

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

単一細胞のシーケンシングを使用したコピー数変化の検出

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Atomic Force Microscopy Investigations of DNA Lesion Recognition in Nucleotide Excision Repair

ヌクレオチド切除修復におけるDNA損傷認識の原子間力顕微鏡検査

AFM imaging is a powerful technique for the study of protein-DNA interactions. This single molecule method allows the simultaneous resolution of different ...

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

DNA 変更染色: 共焦点画像の数値解析

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9 によるマウスおよび人間の造血前駆細胞の高効率遺伝子破壊

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

A Simple, Rapid, and Quantitative Assay to Measure Repair of DNA-protein Crosslinks on Plasmids Transfected into Mammalian Cells

シンプル、迅速、かつ定量的アッセイのプラスミド dna-タンパク質クロスリンクのメジャー修理に哺乳類細胞にトランスフェクション

The purpose of this method is to provide a flexible, rapid, and quantitative technique to examine the kinetics of DNA-protein crosslink (DPC) repair in ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

エラー修正 DNA ・ RNA シーケンスを用いた珍しいイベント検出

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

ミトコンドリア DNA のメチル化の正確な検出のための方法論

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

ATAC-seq Assay with Low Mitochondrial DNA Contamination from Primary Human CD4+ T Lymphocytes

主なヒト cd4 陽性 T リンパ球から低ミトコンドリア DNA 汚染 ATAC seq 試金

ATAC-seq has become a widely used methodology in the study of epigenetics due to its rapid and simple approach to mapping genome-wide accessible ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay Using Micrococcal Nucleases in Mammalian Cells

哺乳類細胞における微小コッカルヌクレアーゼを用いてクロマチン免疫沈殿アッセイ

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene ...

Use of Frozen Tissue in the Comet Assay for the Evaluation of DNA Damage

DNA損傷評価のための彗星アッセイにおける凍結組織の利用

The comet assay is gaining popularity as a means to assess DNA damage in cultured cells and tissues, particularly following exposure to chemicals or other ...