Name: detection of post-replicative gaps accumulation and repair in human cells using the dna fiber assay
Uploaded: 2022-02-03T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Post-Replicative Gaps Accumulation and Repair in Human Cells Using the DNA Fiber Assay at JoVE.com

Arbeidet i C.F.M.M. laboratoriet støttes av Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, São Paulo, Brasil, Grants #2019/19435-3, #2013/08028-1 og 2017/05680-0) under International Collaboration Research fra FAPESP og Nederland Organization for Scientific Research (NWO, Nederland); Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, Brasília, DF, Brasil, Grants # 308868/2018-8] og Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal do Ensino Superior (CAPES, Brasília, DF, Brasil, Finanskode 001).

Ettersom studien bruker humane celler, ble arbeidet godkjent av Etikkkomiteen ved Institutt for biomedisinsk vitenskap ved Universitetet i São Paulo (ICB-USP, godkjenningsnummer #48347515.3.00005467) for forskning med menneskelige prøver.
MERK: Protokollene som er beskrevet her, ble brukt i tidligere publikasjoner med mindre modifikasjoner 14,16,28. Her er fokuset på bruk av ultrafiolett lys C (UVC...

<ol>
	<li>Rupp, W. D., Howard-Flanders, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discontinuities+in+the+DNA+synthesized+in+an+excision-defective+strain+of+Escherichia+coli+following+ultraviolet+irradiation.">Discontinuities in the DNA synthesized in an excision-defective strain of Escherichia coli following ultraviolet irradiation.</a> Journal of Molecular Biology. 31 (2), 291-304 (1968).</li><li>Meneghini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gaps+in+DNA+synthesized+by+ultraviolet+light-irradiated+WI38+human+cells.">Gaps in DNA synthesized by ultraviolet light-irradiated WI38 human cells.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 425 (4), 419-427 (1976).</li><li>Meneghini, R., Cordeiro-Stone, M., Schumacher, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+and+frequency+of+gaps+in+newly+synthesized+DNA+of+xeroderma+pigmentosum+human+cells+irradiated+with+ultraviolet+light.">Size and frequency of gaps in newly synthesized DNA of xeroderma pigmentosum human cells irradiated with ultraviolet light.</a> Biophysical Journal. 33 (1), 81-92 (1981).</li><li>Lopes, M., Foiani, M., Sogo, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+mechanisms+control+chromosome+integrity+after+replication+fork+uncoupling+and+restart+at+irreparable+UV+lesions.">Multiple mechanisms control chromosome integrity after replication fork uncoupling and restart at irreparable UV lesions.</a> Molecular Cell. 21 (1), 15-27 (2006).</li><li>Heller, R. C., Marians, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+fork+reactivation+downstream+of+a+blocked+nascent+leading+strand.">Replication fork reactivation downstream of a blocked nascent leading strand.</a> Nature. 439 (7076), 557-562 (2006).</li><li>Bianchi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PrimPol+bypasses+UV+photoproducts+during+eukaryotic+chromosomal+DNA+replication.">PrimPol bypasses UV photoproducts during eukaryotic chromosomal DNA replication.</a> Molecular Cell. 52 (4), 566-573 (2013).</li><li>Garc&#237;a-G&#243;mez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PrimPol,+an+archaic+primase/polymerase+operating+in+human+cells.">PrimPol, an archaic primase/polymerase operating in human cells.</a> Molecular Cell. 52 (4), 541-553 (2013).</li><li>Mour&#243;n, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repriming+of+DNA+synthesis+at+stalled+replication+forks+by+human+PrimPol.">Repriming of DNA synthesis at stalled replication forks by human PrimPol.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 20 (12), 1383-1389 (2013).</li><li>Wan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hPrimpol1/CCDC111+is+a+human+DNA+primase-polymerase+required+for+the+maintenance+of+genome+integrity.">hPrimpol1/CCDC111 is a human DNA primase-polymerase required for the maintenance of genome integrity.</a> EMBO Reports. 14 (12), 1104-1112 (2013).</li><li>Keen, B. A., Jozwiakowski, S. K., Bailey, L. J., Bianchi, J., Doherty, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+dissection+of+the+domain+architecture+and+catalytic+activities+of+human+PrimPol.">Molecular dissection of the domain architecture and catalytic activities of human PrimPol.</a> Nucleic Acids Research. 42 (9), 5830-5845 (2014).</li><li>Tirman, S., Cybulla, E., Quinet, A., Meroni, A., Vindigni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRIMPOL+ready,+set,+reprime.">PRIMPOL ready, set, reprime.</a> Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 56 (1), 17-30 (2021).</li><li>Quinet, A., Lerner, L. K., Martins, D. J., Menck, C. F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filling+gaps+in+translesion+DNA+synthesis+in+human+cells.">Filling gaps in translesion DNA synthesis in human cells.</a> Mutation Research, Genetic Toxicology Environmental Mutagenesis. 836, 127-142 (2018).</li><li>Ziv, O., Diamant, N., Shachar, S., Hendel, A., Livneh, Z., Bjergb&#230;k, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+measurement+of+translesion+DNA+synthesis+in+mammalian+cells.">Quantitative measurement of translesion DNA synthesis in mammalian cells.</a> DNA Repair Protocols. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). 920, (2012).</li><li>Quinet, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translesion+synthesis+mechanisms+depend+on+the+nature+of+DNA+damage+in+UV-irradiated+human+cells.">Translesion synthesis mechanisms depend on the nature of DNA damage in UV-irradiated human cells.</a> Nucleic Acids Research. 44 (12), 5717-5731 (2016).</li><li>T&#233;cher, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+dynamics:+biases+and+robustness+of+DNA+fiber+analysis.">Replication dynamics: biases and robustness of DNA fiber analysis.</a> Journal of Molecular Biology. 425 (23), 4845-4855 (2013).</li><li>Quinet, A., Carvajal-Maldonado, D., Lemacon, D., Vindigni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+fiber+analysis:+Mind+the+gap.">DNA fiber analysis: Mind the gap.</a> Methods in Enzymology. 591, 55-82 (2017).</li><li>Elvers, I., Johansson, F., Groth, P., Erixon, K., Helleday, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UV+stalled+replication+forks+restart+by+re-priming+in+human+fibroblasts.">UV stalled replication forks restart by re-priming in human fibroblasts.</a> Nucleic Acids Research. 39 (16), 7049-7057 (2011).</li><li>Diamant, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+bypass+operates+in+the+S+and+G2+phases+of+the+cell+cycle+and+exhibits+differential+mutagenicity.">DNA damage bypass operates in the S and G2 phases of the cell cycle and exhibits differential mutagenicity.</a> Nucleic Acids Research. 40 (1), 170-180 (2012).</li><li>Temviriyanukul, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporally+distinct+translesion+synthesis+pathways+for+ultraviolet+light-induced+photoproducts+in+the+mammalian+genome.">Temporally distinct translesion synthesis pathways for ultraviolet light-induced photoproducts in the mammalian genome.</a> DNA Repair. 11 (6), 550-558 (2012).</li><li>Jansen, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redundancy+of+mammalian+Y+family+DNA+polymerases+in+cellular+responses+to+genomic+DNA+lesions+induced+by+ultraviolet+light.">Redundancy of mammalian Y family DNA polymerases in cellular responses to genomic DNA lesions induced by ultraviolet light.</a> Nucleic Acids Research. 42 (17), 11071 (2014).</li><li>Quinet, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap-filling+and+bypass+at+the+replication+fork+are+both+active+mechanisms+for+tolerance+of+low-dose+ultraviolet-induced+DNA+damage+in+the+human+genome.">Gap-filling and bypass at the replication fork are both active mechanisms for tolerance of low-dose ultraviolet-induced DNA damage in the human genome.</a> DNA Repair. 14 (1), 27-38 (2014).</li><li>Callegari, A. J., Clark, E., Pneuman, A., Kelly, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postreplication+gaps+at+UV+lesions+are+signals+for+checkpoint+activation.">Postreplication gaps at UV lesions are signals for checkpoint activation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (18), 8219-8224 (2010).</li><li>Vogt, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+further+properties+of+single-strand-specific+nuclease+from+Aspergillus+oryzae.">Purification and further properties of single-strand-specific nuclease from Aspergillus oryzae.</a> European Journal of Biochemistry. 33 (1), 192-200 (1973).</li><li>Cordeiro-Stone, M., Schumacher, R. I., Meneghini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+replication+fork+in+ultraviolet+light-irradiated+human+cells.">Structure of the replication fork in ultraviolet light-irradiated human cells.</a> Biophysical Journal. 27 (2), 287-300 (1979).</li><li>Lehmann, A. R., Fuchs, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gaps+and+forks+in+DNA+replication:+Rediscovering+old+models.">Gaps and forks in DNA replication: Rediscovering old models.</a> DNA Repair (Amst). 5 (12), 1495-1498 (2006).</li><li>Daigaku, Y., Davies, A. A., Ulrich, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin-dependent+DNA+damage+bypass+is+separable+from+genome+replication.">Ubiquitin-dependent DNA damage bypass is separable from genome replication.</a> Nature. 465 (7300), 951-955 (2010).</li><li>Karras, G. I., Jentsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RAD6+DNA+damage+tolerance+pathway+operates+uncoupled+from+the+replication+fork+and+is+functional+beyond+S+phase.">The RAD6 DNA damage tolerance pathway operates uncoupled from the replication fork and is functional beyond S phase.</a> Cell. 141 (2), 255-267 (2010).</li><li>Tirman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporally+distinct+post-replicative+repair+mechanisms+fill+PRIMPOL-dependent+ssDNA+gaps+in+human+cells.">Temporally distinct post-replicative repair mechanisms fill PRIMPOL-dependent ssDNA gaps in human cells.</a> Molecular Cell. 81 (19), 4026-4040 (2021).</li><li>Cong, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+gaps+are+a+key+determinant+of+PARP+inhibitor+synthetic+lethality+with+BRCA+deficiency.">Replication gaps are a key determinant of PARP inhibitor synthetic lethality with BRCA deficiency.</a> Molecular Cell. 81 (15), 3128-3144 (2021).</li><li>Quinet, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRIMPOL-mediated+adaptive+response+suppresses+replication+fork+reversal+in+BRCA-deficient+cells.">PRIMPOL-mediated adaptive response suppresses replication fork reversal in BRCA-deficient cells.</a> Molecular Cell. 77 (3), 461-474 (2020).</li><li>Jackson, D. A., Pombo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replicon+clusters+are+stable+units+of+chromosome+structure:+evidence+that+nuclear+organization+contributes+to+the+efficient+activation+and+propagation+of+S+phase+in+human+cells.">Replicon clusters are stable units of chromosome structure: evidence that nuclear organization contributes to the efficient activation and propagation of S phase in human cells.</a> The Journal of Cell Biology. 140 (6), 1285-1295 (1998).</li><li>Schwab, R. A., Niedzwiedz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+DNA+replication+in+the+vertebrate+model+system+DT40+using+the+DNA+fiber+technique.">Visualization of DNA replication in the vertebrate model system DT40 using the DNA fiber technique.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (56), e3255 (2011).</li><li>Simoneau, A., Xiong, R., Zou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+trans+cell+cycle+effects+of+PARP+inhibitors+underlie+their+selectivity+toward+BRCA1/2-deficient+cells.">The trans cell cycle effects of PARP inhibitors underlie their selectivity toward BRCA1/2-deficient cells.</a> Genes &amp; Development. 35 (17-18), 1271-1289 (2021).</li><li>Taglialatela, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=REV1-Pol&#950;+maintains+the+viability+of+homologous+recombination-deficient+cancer+cells+through+mutagenic+repair+of+PRIMPOL-dependent+ssDNA+gaps.">REV1-Pol&#950; maintains the viability of homologous recombination-deficient cancer cells through mutagenic repair of PRIMPOL-dependent ssDNA gaps.</a> Molecular Cell. 81 (19), 4008-4025 (2021).</li><li>Lim, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=USP1+Is+required+for+replication+fork+protection+in+BRCA1-deficient+tumors.">USP1 Is required for replication fork protection in BRCA1-deficient tumors.</a> Molecular Cell. 72 (6), 925-941 (2018).</li><li>Peng, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposing+roles+of+FANCJ+and+HLTF+protect+forks+and+restrain+replication+during+stress.">Opposing roles of FANCJ and HLTF protect forks and restrain replication during stress.</a> Cell Reports. 24 (12), 3251-3261 (2018).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA+translocase+FANCM/MHF+promotes+replication+traverse+of+DNA+interstrand+crosslinks.">The DNA translocase FANCM/MHF promotes replication traverse of DNA interstrand crosslinks.</a> Molecular Cell. 52 (3), 434-446 (2013).</li><li>Ding, W., Bishop, M. E., Lyn-Cook, L. E., Davis, K. J., Manjanatha, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+alkaline+comet+assay+and+enzyme-modified+alkaline+comet+assay+for+measuring+DNA+strand+breaks+and+oxidative+DNA+damage+in+rat+liver.">In vivo alkaline comet assay and enzyme-modified alkaline comet assay for measuring DNA strand breaks and oxidative DNA damage in rat liver.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (111), e53833 (2016).</li><li>Lu, Y., Liu, Y., Yang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+in+vitro+DNA+damage+using+comet+assay.">Evaluating in vitro DNA damage using comet assay.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (128), e56450 (2017).</li></ol>

Kritiske trinn i standard DNA fiberanalyseprotokoll ble diskutert i en tidligere publikasjon32. Her beskriver vi modifiserte versjoner av standard DNA fiberanalyse for å undersøke tilstedeværelsen av postrepliktive ssDNA-hull samt reparasjon ved gapfylling, opprinnelig beskrevet i14. I sammenheng med postreplikativ ssDNA-gaptilstedeværelse vil bruken av S1-kjernen i S1 Fiber-protokollen mest sannsynlig være egnet etter eksponering av et gentoksisk middel i minst 1 time...

Seminale arbeider har gitt bevis for opphopning av postrepliktive enkeltstrengede (ssDNA) hull ved behandling med DNA-skadelige midler i bakterie1 og humane celler 2,3. Under replikering av skadede DNA-maler kan DNA-syntesemaskineriet omgå lesjonene ved å bruke spesifikke translesionsyntese DNA-polymeraser eller gjennom malvekslingsmekanismer. Alternativt kan den svarte også bare hoppe over lesjonen og etterlate et ssDNA-gap bak, som skal repareres senere. Mer nylig viste en studie tydelig at behandling med gentoksiske midler fører til ssDNA-hull i eukaryoter ved å bruke elektronmikroskopi for å visualisere den spesifikke strukturen til replikasjons mellomprodukter4. Dannelsen av disse regionene av postrepliktive hull ble opprinnelig foreslått å være et enkelt resultat av den semi-diskontinuerlige modusen for DNA-replikasjon2. I dette tilfellet kan en lesjon på den hengende tråden blokkere forlengelsen av et Okazaki-fragment, men gaffelprogresjon blir naturlig reddet av følgende Okazaki-fragment, og etterlater et ssDNA-gap. Videre studier viste imidlertid at dannelsen av hull på den ledende tråden også er mulig, som først vist i bakterie5. I eukaryoter ble PRIMPOL, en unik DNA-polymerase med primasisk aktivitet, vist seg å kunne starte DNA-syntesen nedstrøms en replikeringsblokkeringslesjon gjennom sin reprimingaktivitet 6,7,8,9,10,11. Dermed kan PRIMPOL primase-aktiviteten forklare dannelsen av postrepliktive ssDNA-hull i den ledende tråden ved behandling med et DNA-skadelig middel i humane celler12. Likevel krevde deteksjon av disse hullene samt gapreparasjon inntil nylig indirekte eller tidkrevende tilnærminger som elektronmikroskopi4 eller plasmidbaserte analyser13. Bruken av den ssDNA-spesifikke S1-kjernen for å oppdage hull i menneskelige celler ble banebrytende av tidlige studier for mer enn førti år siden, ved hjelp av sukrose gradient teknikker 2,3. Mer nylig brukte gruppen vår bruken av denne kjernen for å oppdage ssDNA i å replikere DNA (postreplikerende hull) ved hjelp av andre metoder som DNA-fiber og kometanalyser14. Disse nye tilnærmingene banet vei for den nåværende bølgen av studier på postrepliktive hull. Her beskriver vi en strategi for å bruke S1-kjernease for å oppdage postrepliktive ssDNA-hull ved DNA-fiberanalyse og forklare hvordan en differensialmerkingsordning i DNA-fiberprotokollen kan tillate studiet av reparasjon av disse hullene.
DNA-fiberanalysen er en kraftig teknikk som har blitt brukt av et økende antall laboratorier og har gitt verdifull innsikt i replikeringsgaffeldynamikk og replikeringsspenningsresponsmekanismer. Kort sagt er denne teknikken basert på sekvensiell inkorporering av nukleotidanaloger (som CldU -5-klor-2'-deoksyuridin- og IdU -5-iodo-2'-deoksyuridin) i det replikerende DNA. Etter høsting lyser cellene, og DNA-molekyler sprer seg på en positivt belagt glasssklie. CldU og IdU oppdages deretter av spesifikke antistoffer, som kan visualiseres i et fluorescerende mikroskop som bicolored fibre. Til slutt måles lengdene på IdU- og CldU-traktatene for å identifisere eventuelle endringer i DNA-replikeringsdynamikken som følge av DNA-skadeinduksjon. Denne teknikken kan brukes til å undersøke forskjellige fenomener, for eksempel gaffelboding, gaffelbremsing, nascent DNA-nedbrytning og variasjoner i opprinnelsesfrekvensen som avfyrer15,16.
En begrensning av DNA-fiberanalysen er oppløsningen på noen få kilobaser. Fordi postrepliktive ssDNA-hull kan være i området med hundrevis av baser, er det umulig å visualisere disse hullene direkte av standard DNA fiberprotokoll. Tilstedeværelsen av ssDNA-hull på replikering av DNA i humane celler behandlet med gentoksiske midler har blitt indirekte implisert før. For eksempel, observasjon av ssDNA som vurdert ved rekruttering av ssDNA-bindende protein, replikasjonsprotein A (RPA), i celler utenfor S-fasen, eller dannelsen av ssDNA som påvist ved alkalisk DNA-avslapping kombinert med fravær av langvarig gaffel stalling av DNA fiberanalyse 12,17,18,19,20,21 ble tilskrevet akkumulering av ssDNA-hull. I tillegg induserer postrepliktive ssDNA-hull et ATR-avhengig G2/M fasekontrollpunkt og arrestceller behandlet med replikasjonsgifter 18,19,20,21,22.
S1-kjernen forringes enkeltstrengede nukleinsyrer som frigjør 5'-fosforylmono- eller oligonukleotider og har en 5 ganger høyere affinitet til ssDNA sammenlignet med RNA. Dobbeltstrengede nukleinsyrer (DNA:DNA, DNA:RNA eller RNA:RNA) er motstandsdyktige mot S1-kjernen, unntatt når de brukes i ekstremt høye konsentrasjoner. S1-kjernen klemmer også dobbeltstrenget DNA i den enstrengede regionen forårsaket av en nick, gap, mismatch eller loop. S1-kjernen er dermed en ssDNA-spesifikk endonuclease som er i stand til å spalte ssDNA-hull, og til slutt generere dobbeltstrengede pauser23,24. Dermed muliggjør det å legge til trinn for S1-nuklease fordøyelse til DNA fiberprotokollen indirekte deteksjon av postrepliktive ssDNA-hull. I nærvær av hull vil behandling av eksponerte kjerner med S1-kjernen før DNA-spredning generere kortere trakter som følge av S1 spalting av ssDNA iboende tilstede ved hull14. Følgelig er tract-forkortelsen avlesningen for ssDNA-hull ved hjelp av denne tilnærmingen. Sammenlignet med standard DNA fiberprotokoll, krever DNA-fiberen med S1-kjernen bare to ekstra trinn: nukleieksponering (cellepermeabilisering) og behandling med S1-kjernen. Det er viktig å merke seg at passende kontroller er obligatoriske, for eksempel prøver behandlet med gentoksisk middel, men uten S1-nuklease og prøver behandlet med S1-kjernen uten gentoksisk middel. Protokollen i seg selv, inkludert inkorporering av analoger, S1-behandling og spredning, kan utføres på en dag og krever ikke eksepsjonell materiale. Det krever bare tymidanalogene, den rensede S1-kjernen, de riktige primære og sekundære antistoffene og et fluorescerende mikroskop. Totalt sett oppdager DNA-fiberen som bruker S1-kjernen ssDNA-hull på pågående replikeringsgafler ved hjelp av en relativt enkel tilnærming.
De postrepliktive ssDNA-hullene som dannes som følge av replikeringsspenningsresponsmekanismer, kan repareres (eller fylles) av forskjellige mekanismer, inkludert translesion DNA-syntese eller malveksling, i en prosess som kalles gapfylling eller postreplikeringsreparasjon (PRR)25. Disse prosessene oppstår bak de fremadstormende gaflene, som involverer replikeringsuavhengig DNA-syntese 14,26,27. Basert på disse funnene kan det utføres et merkeskjema som skiller seg fra standard DNA-fiberanalyse for å visualisere gapfyllingshendelser i G2-fasen direkte 14,16,26,28. Spesielt kan en tymidanalog brukes til å merke replikeringsgiffelen på tidspunktet for gentoksisk behandling og postreplikativ ssDNA-gapdannelse, mens en annen tymidinanalog kan brukes til å merke gapfyllingshendelser. I denne protokollen er celler merket med en første tymidinanalog (for eksempel IdU) umiddelbart etter eller samtidig med gentoksisk behandling i 1 time, slik at nascent DNA er merket på tidspunktet for gapdannelse. Nocodazol tilsettes ved behandling i mellom 12-24 timer for å arrestere celler i G2/M, noe som forhindrer følgende S-fase. For de siste 4 t nokodazolbehandling legges en annen tymidanalog (cldU, for eksempel) til mediet som skal innlemmes under gapfylling. Det er viktig at denne analysen bare kan brukes til å oppdage gapfyllingshendelser i G2 fordi gapfyllingssignalet fra CldU ikke kan skilles fra et signal på grunn av CldU-inkorporering i replikering av DNA i S-fasen. Derfor, for å minimere bakgrunnssignalet, bør tidspunktet for CldU-inkorporering etter skadeinduksjon falle sammen med når mesteparten av cellepopulasjonen går inn i G2 fase14. Derfor vil denne timingen variere avhengig av cellelinje og behandlingsforhold. Optimalisering av cellesyklusprogresjon før bruk av denne analysen anbefales. Samtidig farging av disse tymidanalogene gjør det mulig å visualisere gapfyllingskanaler (PRR) (CldU-flekker) på toppen av nascent DNA (IdU-traktater) syntetisert under gentoksisk behandling når ssDNA-hull ble generert.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid, Glacial</td>
			<td>Synth</td>
			<td>64-19-7</td>
			<td>Alternatively, BSA - Biosera - REF PM-T1725/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium hydroxide</td>
			<td>Synth</td>
			<td>1336-21-6</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody anti-mouse IgG1 Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11005</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody anti-rat Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21470</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody Mouse anti-BrdU</td>
			<td>Becton Disckson</td>
			<td>347580</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody Rat anti-BrdU</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>&#160;Ab6326</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological security hood</td>
			<td>Pachane</td>
			<td>PA 410</td>
			<td>Use hood present in the laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (Bovine Serum Albumin)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3294</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>179693</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CldU</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>C6891</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cloridric acid</td>
			<td>Synth</td>
			<td>7647-01-0</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Zeiss LSM Series (7, 8 or 9)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass (or coverslips)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>152460</td>
			<td>Alternatively, Olen - Kasvi Cover Glass (24 x 60 mm) - K5-2460</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM - High Glucose</td>
			<td>LGC/Gibco</td>
			<td>BR30211-05/12100046</td>
			<td>Use culture media specific for the cell line used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E5314</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence Microscope Axiovert 200</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12657-029</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forma Series II Water Jacketed CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific 3110</td>
			<td>13-998-074</td>
			<td>Use cell incubator present in the laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide jar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5516</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Idu</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>I7125</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Synth</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>67-56-1</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Denville</td>
			<td>M1021</td>
			<td>Alternatively, Olen - Kasvi Microscope Slides - K5-7105 OR Precision Glass Line - 7105-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS (&#193;cido 3-morfolinopropano 1-sulf&#244;nico)</td>
			<td>Synth</td>
			<td>1132-61-2</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nocodazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31430-18-9</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate Buffer Saline)</td>
			<td>Life Thechnologies</td>
			<td>3002</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold AntiFade Mountant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36930</td>
			<td>Any antifade moutant solution for immunofluorescence could be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S1 nuclease purified from Aspergillus oryzae</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18001-016</td>
			<td>Pre-dilute the S1 nuclease (1/100 - 1/200) in S1 nuclease dilution buffer provided by the manufacturer, aliquote and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0302</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate Trihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>6131-90-4</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Synth</td>
			<td>&#160;7647-14-5</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>57-50-1</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>West Lab Research</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Synth</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200072</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UVC Lamp</td>
			<td>Non Specific</td>
			<td>-</td>
			<td>Essential: emission lenght of 254 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VLX-3W UV Radiometer</td>
			<td>Vilber Loumart</td>
			<td>-</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>557-34-6</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of post-replicative gaps accumulation and repair in human cells using the dna fiber assay

DNA-fiberanalysen er en enkel og robust metode for analyse av replikerings gaffeldynamikk, basert på immunodeteksjon av nukleotidanaloger som er innlemmet under DNA-syntese i menneskelige celler. Denne teknikken har imidlertid en begrenset oppløsning på noen få tusen kilobaser. Følgelig kan ikke postrepliktive enkeltstrengede DNA-hull (ssDNA) så små som noen få hundre baser påvises av standardanalysen. Her beskriver vi en modifisert versjon av DNA-fiberanalysen som benytter S1-kjernen, et enzym som spesifikt cleaves ssDNA. I nærvær av postrepliktive ssDNA-hull vil S1-kjernen målrette og spalte hullene, og generere kortere trakter som kan brukes som en avlesning for ssDNA-hull på pågående gafler. Disse postrepliktive ssDNA-hullene dannes når skadet DNA replikeres diskontinuerlig. De kan repareres via mekanismer som ikke er koblet fra genomreplikering, i en prosess kjent som gapfylling eller postreplikativ reparasjon. Fordi gapfyllingsmekanismer involverer DNA-syntese uavhengig av S-fasen, kan endringer i DNA fibermerkingsordningen også brukes til å overvåke gapfyllingshendelser. Til sammen er disse modifikasjonene av DNA-fiberanalysen kraftige strategier for å forstå hvordan postrepliktive hull dannes og fylles i genomet av menneskelige celler.

I S1 Fiber-analysen, hvis behandling med et gentoksisk middel fører til postrepliktive ssDNA-hull, vil de totale lengdene på DNA-fibre fra S1-behandlede kjerner bli kortere ved behandling med DNA-skade sammenlignet med ubehandlede prøver, samt til prøver som ble behandlet med gentoksisk middel, men ikke ble sendt til S1 spalting (figur 1).
Alternativt, hvis behandling med S1-kjernen ikke påvirker lengden på DNA-fibre i forhold til ubehandlede celler, er fors...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Post-Replicative Gaps Accumulation and Repair in Human Cells Using the DNA Fiber Assay at JoVE.com

Detection of Post-Replicative Gaps Accumulation and Repair in Human Cells Using the DNA Fiber Assay

Her beskriver vi to modifikasjoner av DNA-fiberanalysen for å undersøke enkeltstrengede DNA-hull i replikering av DNA etter lesjonsinduksjon. S1 fiberanalyse gjør det mulig å oppdage postrepliktive hull ved hjelp av den ssDNA-spesifikke S1 endonuclease, mens gapfyllingsanalysen tillater visualisering og kvantifisering av gapreparasjon.

Påvisning av postrepliktive hull akkumulering og reparasjon i menneskelige celler ved hjelp av DNA Fiber Assay

The DNA fiber assay is a simple and robust method for the analysis of replication fork dynamics, based on the immunodetection of nucleotide analogs that ...

Vår protokoll åpner nye muligheter for å undersøke hvordan replikering skjer på skadet DNA. Teknikkene kan oppdage dannelsen og reparasjonen av enkeltstrengede DNA-hull, overfor DNA-lesjonen. S1-kjernen spalter det enstrengede DNA-et og tillater påvisning av postrepliktive hull.Denne tilnærmingen ble først brukt av Dr.Meneghini og Dr.Cordiero-Stone på 1970-tallet i Brasil, og nylig tilpasset av oss til DNA-fiberanalysen. Ved hjelp av teknikken som er beskrevet her for å studere dannelsen og reparasjonen av postrepliktive hull, kan du gi innsikt i mekanismen for DNA-reparasjon og replikeringsspenningsrespons som opprettholder genomintegritet. For begge protokollene beskrevet her, S1 fiber og gap-fylling analyser, Det er avgjørende å inkludere alle kontrollene for å sikre nøyaktig tolkning av dataene.Prosedyren vil bli demonstrert av Davi J.Martins, en ph.d.-student fra laboratoriet vårt, og Dr.Annabel Quinet, en samarbeidspartner som tidligere utviklet disse teknikkene når de jobbet i vår gruppe. Til å begynne med aspirerer du kulturmediene og legger umiddelbart til kulturmediene med 20 mikromolar IDU-medier til cellene. Inkuber cellene ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid i nøyaktig 20 minutter.Vask deretter cellene raskt med forvarmet PBS to ganger og bestråle dem med 20 joule per meter firkantet UV-C. Bruk ubehandlede celler som kontroller. Tilsett umiddelbart media med 200-mikromolar CldU i cellene og inkuber dem ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid i nøyaktig 60 minutter.Deretter vasker du cellene med forvarmet PBS to ganger og gjennomsyrer dem med CSK 100-bufferen i to til 10 minutter i henhold til cellelinjen ved romtemperatur. Etter CSK permeabilisering kan kjernene med nesten ingen cytoplasma ses sammenlignet med de før permeabiliseringen. Hell FORSIKTIG PBS ned på siden av hver brønn for å vaske kjernen med PBS.Vask deretter kjernene med S1 buffer. Inkuber kjernene i S1-bufferen med 20 enheter per milliliter S1-kjerne, og uten S1-kjernen, i 30 minutter ved 37 grader Celsius. Deretter aspirerer du S1-bufferen og legger til 0,1 %BSA i PBS.Skrap kjernene og overfør dem til et omtrent kommentert 1,5 milliliter rør. Hold rørene på is hele tiden. Sentrifuger kjernen på rundt 4600 ganger G i fem minutter ved fire grader Celsius.Resuspend pellets i PBS i en konsentrasjon på ca. 1500 celler per mikroliter. Plasser rørene på isen og fortsett umiddelbart til DNA-fiberforberedelse ved å spre protokollen. Kommenter mikroskopet med en karbonblyant og legg dem flatt på et brett.Trykk på bunnen av røret for å sikre homogenisering og legge til to mikroliter celler på toppen av det tilsvarende lysbildet. Tilsett seks mikroliter av lysisbufferen og lyse cellene ved å pipettere opp og ned omtrent fem ganger. Bruk pipettespissen til å trekke dråpen litt mot bunnen av lysbildet og inkubere i fem minutter ved romtemperatur for å lyse kjernene.Vipp lysbildet rundt 20 til 40 grader, og la fallet spre seg til bunnen av lysbildet med konstant lav hastighet. La gliden tørke ved romtemperatur i mørket i 10 til 15 minutter. Senk dem deretter ned i en krukke som inneholder den nylagde festeløsningen og inkuber i fem minutter ved romtemperatur for å fikse DNA på lysbildene.Vask lysbildene med PBS to ganger i fem minutter og denaturer DNA-et med nytilberedt 2,5-molarer cloridric acid i 40 til 60 minutter ved romtemperatur. Vask lysbildene med PBS tre ganger i fem minutter og blokker med 5% BSA tidligere oppvarmet i 30 til 60 minutter ved 37 grader Celsius. Trykk forsiktig på papiret for å fjerne overflødig væske fra lysbildene.Tilsett 30 mikroliter primær antistoffer på lysbildene dråpevis og legg en dekselslipp på toppen. Inkuber i 1 til 1,5 timer ved romtemperatur i et mørkt, fuktig kammer. Plasser lysbildene i en krukke med PBS i ett til to minutter, og fjern deretter dekselskliene forsiktig.Vask med PBST i en krukke tre ganger i fem minutter og legg lysbildene i PBS. Fjern overflødig væske ved å trykke forsiktig på et papir og tilsett 30 mikroliter av de sekundære antistoffene til lysbildene dråpevis. Sett en dekselslipp på toppen.Inkuber i 45 til 60 minutter ved romtemperatur i et mørkt og fuktig kammer. Gjenta trinnene for å vaske lysbildene og fjerne overflødig PBS igjen og legg til 20 mikroliter av monteringsreagenset fallvis til lysbildene. Sett en dekselslipp på toppen og unngå bobler.Legg en dråpe nedsenkningsolje nær toppen av lysbildet der cellene ble lysnet. Bruk den grønne kanalen og søk i de grønne prikkene i bakgrunnen for å finne fokus. Åpne Leica Application Suite-programvaren, klikk på Skaff deg og velg den grønne kanalen.Juster innstillingene for den grønne kanalen før analyse. Deretter bytter du til den røde kanalen og justerer innstillingene. Finn hovedkonsentrasjonen av fibre og flytt til kantene for å finne brønnspredningen, ikke-overlappende, individuelle fibre.Bruk bare én kanal til å velge områdene for bildene og unngå potensielle skjevheter. Klikk på Acquire Overlay-ikonet og juster programvaren for riktig mikroskopforstørrelse. Ta rundt 15 til 20 bilder per lysbilde ved siden av hele lysbildet på den grønne kanalen og deretter på den røde kanalen.De to kanalene slås nå sammen, og det opprettede overlegget flyttes til en unik mappe. Det er mulig å se fibrene med røde og grønne farger. Åpne ImageJ-programvaren, venstreklikk på det femte ikonet, velg det andre alternativet, og velg deretter Segmentert linje-verktøyet.Venstreklikk for å tegne den nøyaktige banen til den røde eller grønne kanalen, og høyreklikk for å stoppe tegningen. Trykk på M-knappen på tastaturet for å måle lengden. For S1 fiber, hold oversikt over de røde og grønne kanalene målinger for hver fiber og måle røde og grønne tract lengder fra minst 150 fibre fra forskjellige bilder.En S1 fiber vises i disse representative bildene. Kontroll-nascent DNA-kanal uten hull og ugjennomtrengelig for spalting av S1-kjernen er vist her. DNA-kanalen positiv for hull som er klemt av S1-kjernen, resulterte i en kortere CldU-kanallengde.En differensialmerkingsordning som er omfattende beskrevet i tekstmanuskriptet, kan utføres for å merke gapfyllingshendelser. I denne analysen, kalt gapfyllende analyse, samsvarer lengre IDU-spor med minst én CldU-oppdatering eller færre CldU-patcher med lav gapfyllingstetthet. Kortere IDU-traktater, med minst én CldU-patch og lengre IDU-traktater med flere CldU-patcher, tilsvarer høy gapfyllingstetthet.Permeabiliseringstrinnet i denne protokollen er avgjørende for at S1-kjernen skal handle på hullene som dannes under replikering av skadet DNA. S1-kjernen kan også brukes i kometanalyseprotokollen for å oppdage hullene som dannes under replikering av skadet DNA som vedvarer etter behandling. S1 fiberanalyse banet vei for det nye paradigmet om at postrepliktive hull kan forårsake kreftsårbarhet, spesielt i bryst- og eggstokkkreft som bærer mutasjoner i BRCA1 og 2 gener.

Research

JoVE Journal

Genetics

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Påvisning av Kopier nummer Endringer Bruke enkelt celle Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Atomic Force Microscopy Investigations of DNA Lesion Recognition in Nucleotide Excision Repair

Atomic Force Microscopy Undersøkelser av DNA Lesion Recognition i Nucleotide Excision Repair

AFM imaging is a powerful technique for the study of protein-DNA interactions. This single molecule method allows the simultaneous resolution of different ...

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

Immunostaining for DNA modifikasjoner: beregningsorientert analyse av AC Confocal bilder

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Svært effektiv Gene avbrudd i Murine og menneskelig blodkreft stamfar celler av CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

A Simple, Rapid, and Quantitative Assay to Measure Repair of DNA-protein Crosslinks on Plasmids Transfected into Mammalian Cells

En enkel, rask og kvantitative analysen mål reparasjon av DNA-protein krysskoblinger på plasmider transfekterte i pattedyrceller

The purpose of this method is to provide a flexible, rapid, and quantitative technique to examine the kinetics of DNA-protein crosslink (DPC) repair in ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Sjelden hendelse gjenkjenning feil-korrigert DNA og RNA sekvensering

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Metodikk for nøyaktig påvisning av Mitokondrielt DNA metylering

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

ATAC-seq Assay with Low Mitochondrial DNA Contamination from Primary Human CD4+ T Lymphocytes

ATAC-seq analysen med lav Mitokondrielt DNA forurensning fra primære menneskelige CD4 + T-lymfocytter

ATAC-seq has become a widely used methodology in the study of epigenetics due to its rapid and simple approach to mapping genome-wide accessible ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay Using Micrococcal Nucleases in Mammalian Cells

Kromatin Immunutfelling analysen bruke Micrococcal Nukleaser i pattedyrceller

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene ...

Use of Frozen Tissue in the Comet Assay for the Evaluation of DNA Damage

Bruk av frosset vev i kometanalysen for evaluering av DNA-skade

The comet assay is gaining popularity as a means to assess DNA damage in cultured cells and tissues, particularly following exposure to chemicals or other ...