Name: detection of post-replicative gaps accumulation and repair in human cells using the dna fiber assay
Uploaded: 2022-02-03T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Post-Replicative Gaps Accumulation and Repair in Human Cells Using the DNA Fiber Assay at JoVE.com

Работа в лаборатории C.F.M.M. поддерживается Фондом Ампаро в Пескизе на эстаду Сан-Паулу (FAPESP, Сан-Паулу, Бразилия, Гранты No 2019/19435-3, #2013/08028-1 и 2017/05680-0) в рамках Международного сотрудничества исследований от FAPESP и Нидерландской организации научных исследований (NWO, Нидерланды); Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, Brasília, DF, Brazil, Grants # 308868/2018-8] и Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal do Ensino Superior (CAPES, Brasília, DF, Brazil, Finance Code 001).

Поскольку в исследовании используются человеческие клетки, работа была одобрена Комитетом по этике Института биомедицинских наук при Университете Сан-Паулу (ICB-USP, номер одобрения No 48347515.3.00005467) для исследования с образцами человека.
ПРИМЕЧАНИЕ: Протоколы, описанные здес?...

<ol>
	<li>Rupp, W. D., Howard-Flanders, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discontinuities+in+the+DNA+synthesized+in+an+excision-defective+strain+of+Escherichia+coli+following+ultraviolet+irradiation.">Discontinuities in the DNA synthesized in an excision-defective strain of Escherichia coli following ultraviolet irradiation.</a> Journal of Molecular Biology. 31 (2), 291-304 (1968).</li><li>Meneghini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gaps+in+DNA+synthesized+by+ultraviolet+light-irradiated+WI38+human+cells.">Gaps in DNA synthesized by ultraviolet light-irradiated WI38 human cells.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 425 (4), 419-427 (1976).</li><li>Meneghini, R., Cordeiro-Stone, M., Schumacher, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+and+frequency+of+gaps+in+newly+synthesized+DNA+of+xeroderma+pigmentosum+human+cells+irradiated+with+ultraviolet+light.">Size and frequency of gaps in newly synthesized DNA of xeroderma pigmentosum human cells irradiated with ultraviolet light.</a> Biophysical Journal. 33 (1), 81-92 (1981).</li><li>Lopes, M., Foiani, M., Sogo, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+mechanisms+control+chromosome+integrity+after+replication+fork+uncoupling+and+restart+at+irreparable+UV+lesions.">Multiple mechanisms control chromosome integrity after replication fork uncoupling and restart at irreparable UV lesions.</a> Molecular Cell. 21 (1), 15-27 (2006).</li><li>Heller, R. C., Marians, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+fork+reactivation+downstream+of+a+blocked+nascent+leading+strand.">Replication fork reactivation downstream of a blocked nascent leading strand.</a> Nature. 439 (7076), 557-562 (2006).</li><li>Bianchi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PrimPol+bypasses+UV+photoproducts+during+eukaryotic+chromosomal+DNA+replication.">PrimPol bypasses UV photoproducts during eukaryotic chromosomal DNA replication.</a> Molecular Cell. 52 (4), 566-573 (2013).</li><li>Garc&#237;a-G&#243;mez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PrimPol,+an+archaic+primase/polymerase+operating+in+human+cells.">PrimPol, an archaic primase/polymerase operating in human cells.</a> Molecular Cell. 52 (4), 541-553 (2013).</li><li>Mour&#243;n, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repriming+of+DNA+synthesis+at+stalled+replication+forks+by+human+PrimPol.">Repriming of DNA synthesis at stalled replication forks by human PrimPol.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 20 (12), 1383-1389 (2013).</li><li>Wan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hPrimpol1/CCDC111+is+a+human+DNA+primase-polymerase+required+for+the+maintenance+of+genome+integrity.">hPrimpol1/CCDC111 is a human DNA primase-polymerase required for the maintenance of genome integrity.</a> EMBO Reports. 14 (12), 1104-1112 (2013).</li><li>Keen, B. A., Jozwiakowski, S. K., Bailey, L. J., Bianchi, J., Doherty, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+dissection+of+the+domain+architecture+and+catalytic+activities+of+human+PrimPol.">Molecular dissection of the domain architecture and catalytic activities of human PrimPol.</a> Nucleic Acids Research. 42 (9), 5830-5845 (2014).</li><li>Tirman, S., Cybulla, E., Quinet, A., Meroni, A., Vindigni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRIMPOL+ready,+set,+reprime.">PRIMPOL ready, set, reprime.</a> Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 56 (1), 17-30 (2021).</li><li>Quinet, A., Lerner, L. K., Martins, D. J., Menck, C. F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filling+gaps+in+translesion+DNA+synthesis+in+human+cells.">Filling gaps in translesion DNA synthesis in human cells.</a> Mutation Research, Genetic Toxicology Environmental Mutagenesis. 836, 127-142 (2018).</li><li>Ziv, O., Diamant, N., Shachar, S., Hendel, A., Livneh, Z., Bjergb&#230;k, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+measurement+of+translesion+DNA+synthesis+in+mammalian+cells.">Quantitative measurement of translesion DNA synthesis in mammalian cells.</a> DNA Repair Protocols. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). 920, (2012).</li><li>Quinet, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translesion+synthesis+mechanisms+depend+on+the+nature+of+DNA+damage+in+UV-irradiated+human+cells.">Translesion synthesis mechanisms depend on the nature of DNA damage in UV-irradiated human cells.</a> Nucleic Acids Research. 44 (12), 5717-5731 (2016).</li><li>T&#233;cher, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+dynamics:+biases+and+robustness+of+DNA+fiber+analysis.">Replication dynamics: biases and robustness of DNA fiber analysis.</a> Journal of Molecular Biology. 425 (23), 4845-4855 (2013).</li><li>Quinet, A., Carvajal-Maldonado, D., Lemacon, D., Vindigni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+fiber+analysis:+Mind+the+gap.">DNA fiber analysis: Mind the gap.</a> Methods in Enzymology. 591, 55-82 (2017).</li><li>Elvers, I., Johansson, F., Groth, P., Erixon, K., Helleday, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UV+stalled+replication+forks+restart+by+re-priming+in+human+fibroblasts.">UV stalled replication forks restart by re-priming in human fibroblasts.</a> Nucleic Acids Research. 39 (16), 7049-7057 (2011).</li><li>Diamant, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+bypass+operates+in+the+S+and+G2+phases+of+the+cell+cycle+and+exhibits+differential+mutagenicity.">DNA damage bypass operates in the S and G2 phases of the cell cycle and exhibits differential mutagenicity.</a> Nucleic Acids Research. 40 (1), 170-180 (2012).</li><li>Temviriyanukul, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporally+distinct+translesion+synthesis+pathways+for+ultraviolet+light-induced+photoproducts+in+the+mammalian+genome.">Temporally distinct translesion synthesis pathways for ultraviolet light-induced photoproducts in the mammalian genome.</a> DNA Repair. 11 (6), 550-558 (2012).</li><li>Jansen, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redundancy+of+mammalian+Y+family+DNA+polymerases+in+cellular+responses+to+genomic+DNA+lesions+induced+by+ultraviolet+light.">Redundancy of mammalian Y family DNA polymerases in cellular responses to genomic DNA lesions induced by ultraviolet light.</a> Nucleic Acids Research. 42 (17), 11071 (2014).</li><li>Quinet, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap-filling+and+bypass+at+the+replication+fork+are+both+active+mechanisms+for+tolerance+of+low-dose+ultraviolet-induced+DNA+damage+in+the+human+genome.">Gap-filling and bypass at the replication fork are both active mechanisms for tolerance of low-dose ultraviolet-induced DNA damage in the human genome.</a> DNA Repair. 14 (1), 27-38 (2014).</li><li>Callegari, A. J., Clark, E., Pneuman, A., Kelly, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postreplication+gaps+at+UV+lesions+are+signals+for+checkpoint+activation.">Postreplication gaps at UV lesions are signals for checkpoint activation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (18), 8219-8224 (2010).</li><li>Vogt, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+further+properties+of+single-strand-specific+nuclease+from+Aspergillus+oryzae.">Purification and further properties of single-strand-specific nuclease from Aspergillus oryzae.</a> European Journal of Biochemistry. 33 (1), 192-200 (1973).</li><li>Cordeiro-Stone, M., Schumacher, R. I., Meneghini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+replication+fork+in+ultraviolet+light-irradiated+human+cells.">Structure of the replication fork in ultraviolet light-irradiated human cells.</a> Biophysical Journal. 27 (2), 287-300 (1979).</li><li>Lehmann, A. R., Fuchs, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gaps+and+forks+in+DNA+replication:+Rediscovering+old+models.">Gaps and forks in DNA replication: Rediscovering old models.</a> DNA Repair (Amst). 5 (12), 1495-1498 (2006).</li><li>Daigaku, Y., Davies, A. A., Ulrich, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin-dependent+DNA+damage+bypass+is+separable+from+genome+replication.">Ubiquitin-dependent DNA damage bypass is separable from genome replication.</a> Nature. 465 (7300), 951-955 (2010).</li><li>Karras, G. I., Jentsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RAD6+DNA+damage+tolerance+pathway+operates+uncoupled+from+the+replication+fork+and+is+functional+beyond+S+phase.">The RAD6 DNA damage tolerance pathway operates uncoupled from the replication fork and is functional beyond S phase.</a> Cell. 141 (2), 255-267 (2010).</li><li>Tirman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporally+distinct+post-replicative+repair+mechanisms+fill+PRIMPOL-dependent+ssDNA+gaps+in+human+cells.">Temporally distinct post-replicative repair mechanisms fill PRIMPOL-dependent ssDNA gaps in human cells.</a> Molecular Cell. 81 (19), 4026-4040 (2021).</li><li>Cong, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+gaps+are+a+key+determinant+of+PARP+inhibitor+synthetic+lethality+with+BRCA+deficiency.">Replication gaps are a key determinant of PARP inhibitor synthetic lethality with BRCA deficiency.</a> Molecular Cell. 81 (15), 3128-3144 (2021).</li><li>Quinet, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRIMPOL-mediated+adaptive+response+suppresses+replication+fork+reversal+in+BRCA-deficient+cells.">PRIMPOL-mediated adaptive response suppresses replication fork reversal in BRCA-deficient cells.</a> Molecular Cell. 77 (3), 461-474 (2020).</li><li>Jackson, D. A., Pombo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replicon+clusters+are+stable+units+of+chromosome+structure:+evidence+that+nuclear+organization+contributes+to+the+efficient+activation+and+propagation+of+S+phase+in+human+cells.">Replicon clusters are stable units of chromosome structure: evidence that nuclear organization contributes to the efficient activation and propagation of S phase in human cells.</a> The Journal of Cell Biology. 140 (6), 1285-1295 (1998).</li><li>Schwab, R. A., Niedzwiedz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+DNA+replication+in+the+vertebrate+model+system+DT40+using+the+DNA+fiber+technique.">Visualization of DNA replication in the vertebrate model system DT40 using the DNA fiber technique.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (56), e3255 (2011).</li><li>Simoneau, A., Xiong, R., Zou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+trans+cell+cycle+effects+of+PARP+inhibitors+underlie+their+selectivity+toward+BRCA1/2-deficient+cells.">The trans cell cycle effects of PARP inhibitors underlie their selectivity toward BRCA1/2-deficient cells.</a> Genes &amp; Development. 35 (17-18), 1271-1289 (2021).</li><li>Taglialatela, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=REV1-Pol&#950;+maintains+the+viability+of+homologous+recombination-deficient+cancer+cells+through+mutagenic+repair+of+PRIMPOL-dependent+ssDNA+gaps.">REV1-Pol&#950; maintains the viability of homologous recombination-deficient cancer cells through mutagenic repair of PRIMPOL-dependent ssDNA gaps.</a> Molecular Cell. 81 (19), 4008-4025 (2021).</li><li>Lim, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=USP1+Is+required+for+replication+fork+protection+in+BRCA1-deficient+tumors.">USP1 Is required for replication fork protection in BRCA1-deficient tumors.</a> Molecular Cell. 72 (6), 925-941 (2018).</li><li>Peng, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposing+roles+of+FANCJ+and+HLTF+protect+forks+and+restrain+replication+during+stress.">Opposing roles of FANCJ and HLTF protect forks and restrain replication during stress.</a> Cell Reports. 24 (12), 3251-3261 (2018).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA+translocase+FANCM/MHF+promotes+replication+traverse+of+DNA+interstrand+crosslinks.">The DNA translocase FANCM/MHF promotes replication traverse of DNA interstrand crosslinks.</a> Molecular Cell. 52 (3), 434-446 (2013).</li><li>Ding, W., Bishop, M. E., Lyn-Cook, L. E., Davis, K. J., Manjanatha, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+alkaline+comet+assay+and+enzyme-modified+alkaline+comet+assay+for+measuring+DNA+strand+breaks+and+oxidative+DNA+damage+in+rat+liver.">In vivo alkaline comet assay and enzyme-modified alkaline comet assay for measuring DNA strand breaks and oxidative DNA damage in rat liver.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (111), e53833 (2016).</li><li>Lu, Y., Liu, Y., Yang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+in+vitro+DNA+damage+using+comet+assay.">Evaluating in vitro DNA damage using comet assay.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (128), e56450 (2017).</li></ol>

Критические шаги стандартного протокола анализа днк-волокна обсуждались в предыдущей публикации32. Здесь мы описываем модифицированные версии стандартного анализа волокон ДНК для исследования наличия пострепликативных пробелов ssDNA, а также их восстановления путем запол...

Основополагающие работы предоставили доказательства накопления пострепликативных одноцепочечных (ssDNA) пробелов при лечении агентами, повреждающими ДНК, в бактериях1 и клетках человека 2,3. Во время репликации поврежденных шаблонов ДНК механизм синтеза ДНК может обходить поражения, используя специфические транслейсионные синтезные ДНК-полимеразы или с помощью механизмов переключения шаблонов. В качестве альтернативы, реплисома может также просто пропустить поражение, оставив зазор ssDNA позади, чтобы быть восстановленным позже. Совсем недавно исследование ясно показало, что лечение генотоксическими агентами приводит к разрывам ssDNA у эукариот с использованием электронной микроскопии для визуализации специфической структуры промежуточных продуктов репликации4. Формирование этих областей пострепликативных промежутков первоначально предполагалось как простой результат полупереключенного способа репликации ДНК2. В этом случае поражение на запаздывающей нити может блокировать удлинение фрагмента Окадзаки, но прогрессирование вилки естественным образом спасается следующим фрагментом Окадзаки, оставляя после себя разрыв сдНК. Однако дальнейшие исследования показали, что образование промежутков на ведущей нити также возможно, как впервые показано у бактерий5. Было показано, что у эукариот PRIMPOL, уникальная ДНК-полимераза с активностью примазы, способна возобновить синтез ДНК после репликации, блокирующей поражение через ее выговорную активность 6,7,8,9,10,11. Таким образом, активность примазы PRIMPOL может объяснить образование пострепликативных разрывов ссДНК в ведущей цепи при лечении повреждающим ДНК агентом в клетках человека12. Тем не менее, обнаружение этих пробелов, а также восстановление зазоров до недавнего времени требовало косвенных или трудоемких подходов, таких как электронная микроскопия4 или анализы на основе плазмид13. Использование специфической для ssDNA нуклеазы S1 для обнаружения пробелов в клетках человека было впервые предложено ранними исследованиями более сорока лет назад с использованием методов градиента сахарозы 2,3. Совсем недавно наша группа применила использование этой нуклеазы для обнаружения ssDNA в репликации ДНК (пострепликтивные промежутки) с использованием других методов, таких как ДНК-волокно и кометные анализы14. Эти новые подходы проложили путь к нынешнему всплеску исследований пострепликационных пробелов. Здесь мы описываем стратегию использования нуклеазы S1 для обнаружения пострепликативных разрывов ssDNA с помощью анализа волокон ДНК и объясняем, как схема дифференциальной маркировки в протоколе волокна ДНК может позволить изучить восстановление этих пробелов.
Анализ волокон ДНК является мощным методом, который используется растущим числом лабораторий и дает ценную информацию о динамике репликационной вилки и механизмах реакции на стресс репликации. Вкратце, этот метод основан на последовательном включении аналогов нуклеотидов (таких как CldU -5-хлор-2'-дезоксиуридин- и IdU-5-йодо-2'-дезоксиуридин) в реплицирующуюСЯ ДНК. После сбора клеток лизируют, а молекулы ДНК распространяются на стеклянном предметном стекле с положительным покрытием. CldU и IdU затем обнаруживаются специфическими антителами, которые могут быть визуализированы в флуоресцентном микроскопе в виде двухцветных волокон. Наконец, длины трактов IdU и CldU измеряются для выявления любых изменений динамики репликации ДНК в результате индукции повреждения ДНК. Этот метод может быть использован для исследования различных явлений, таких как сваливание вилки, замедление вилки, зарождающаяся деградация ДНК и вариации частоты запуска источника15,16.
Одним из ограничений анализа волокна ДНК является его разрешение в несколько килобаз. Поскольку пострепликтивные пробелы ssDNA могут находиться в диапазоне сотен оснований, невозможно визуализировать эти промежутки непосредственно по стандартному протоколу волокна ДНК. Наличие пробелов ssDNA в репликации ДНК в клетках человека, обработанных генотоксическими агентами, косвенно упоминалось ранее. Например, наблюдение за ssDNA, оцениваемой по набору ssDNA-связывающего белка, репликационного белка A (RPA) в клетках вне S-фазы или образованию ssDNA, обнаруженному при раскручивании щелочной ДНК в сочетании с отсутствием длительного сваливания вилки анализом днк-волокна 12,17,18,19,20,21 было связано с накоплением пробелов в сдНК. Кроме того, пострепликтивные разрывы ssDNA индуцируют ATR-зависимую контрольную точку фазы G2/M и арест клеток, обработанных ядами репликации 18,19,20,21,22.
Нуклеаза S1 разлагает одноцепочечные нуклеиновые кислоты, высвобождая 5'-фосфорилмоно- или олигонуклеотиды, и имеет в 5 раз более высокое сродство к ssDNA по сравнению с РНК. Двухцепочечные нуклеиновые кислоты (ДНК: ДНК, ДНК: РНК или РНК: РНК) устойчивы к нуклеазе S1, за исключением случаев, когда они используются в чрезвычайно высоких концентрациях. Нуклеаза S1 также расщепляет двухцепочечную ДНК в одноцепочечной области, вызванной ником, разрывом, несоответствием или петлей. Таким образом, нуклеаза S1 представляет собой специфическую для ssDNA эндонуклеазу, способную расщеплять промежутки ssDNA, в конечном итоге генерируя двухцепочечные разрывы23,24. Таким образом, добавление шагов для переваривания нуклеазы S1 в протокол волокна ДНК косвенно позволяет обнаружить пострепликтивные пробелы ssDNA. При наличии пробелов обработка открытых ядер нуклеазой S1 до распространения ДНК будет генерировать более короткие тракты в результате расщепления SsDNA SsDNA, по своей сути присутствующего в промежутках14. Соответственно, сокращение тракта является считыванием пробелов в СДНК с использованием этого подхода. По сравнению со стандартным протоколом ДНК-волокна, ДНК-волокно с нуклеазой S1 требует только двух дополнительных этапов: воздействия на ядра (клеточная пермеабилизация) и лечения нуклеазой S1. Важно отметить, что соответствующие средства контроля являются обязательными, такие как образцы, обработанные генотоксическим агентом, но без нуклеазы S1, и образцы, обработанные нуклеазой S1 без генотоксического агента. Сам протокол, включая включение аналогов, обработку S1 и распространение, может быть выполнен за один день и не требует исключительного материала. Для этого требуются только аналоги тимидина, очищенная нуклеаза S1, соответствующие первичные и вторичные антитела и флуоресцентный микроскоп. В целом, днк-волокно, использующее нуклеазу S1, обнаруживает пробелы ssDNA на текущих репликационных вилках, используя относительно простой подход.
Пострепликтивные пробелы сдНК, образовавшиеся в результате механизмов реакции на стресс репликации, могут быть восстановлены (или заполнены) различными механизмами, включая транслейционный синтез ДНК или переключение шаблонов, в процессе, называемом заполнением пробелов или пострепликационным восстановлением (PRR)25. Эти процессы происходят за наступающими форками, включая репликационно-независимый синтез ДНК 14,26,27. Основываясь на этих результатах, схема маркировки, отличная от стандартного анализа волокна ДНК, может быть выполнена для визуализации событий заполнения пробелов в фазе G2 непосредственно 14,16,26,28. В частности, один аналог тимидина может быть использован для маркировки репликационной вилки во время генотоксического лечения и пострепликтивного образования пробелов сдДНК, в то время как другой аналог тимидина может быть использован для маркировки событий заполнения пробелов. В этом протоколе клетки маркируются первым аналогом тимидина (например, IdU) сразу после или одновременно с генотоксическим лечением в течение 1 ч, так что зарождающаяся ДНК мечится в момент образования разрыва. Нокодазол добавляют после лечения в течение 12-24 ч для ареста клеток в G2 / M, предотвращая следующую S-фазу. В течение последних 4 ч лечения нокодазолом второй аналог тимидина (cldU, например) добавляют в среду, которая будет включена во время заполнения пробелов. Важно отметить, что этот анализ может быть использован только для обнаружения событий заполнения пробелов в G2, поскольку сигнал заполнения пробелов от CldU не может быть отличим от сигнала из-за включения CldU в репликацию ДНК в S-фазе. Поэтому, чтобы свести к минимуму фоновый сигнал, время включения CldU после индукции повреждения должно совпадать с тем, когда большая часть клеточной популяции входит в фазу G214. Поэтому эти сроки будут варьироваться в зависимости от клеточной линии и условий лечения. Рекомендуется оптимизировать прогрессию клеточного цикла перед использованием этого анализа. Совместное окрашивание этих аналогов тимидина позволяет визуализировать участки, заполняющие пробелы (PRR) (пластыри CldU) поверх зарождающейся ДНК (тракты IdU), синтезированной во время генотоксического лечения, когда были созданы пробелы ssDNA.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid, Glacial</td>
			<td>Synth</td>
			<td>64-19-7</td>
			<td>Alternatively, BSA - Biosera - REF PM-T1725/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium hydroxide</td>
			<td>Synth</td>
			<td>1336-21-6</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody anti-mouse IgG1 Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11005</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody anti-rat Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21470</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody Mouse anti-BrdU</td>
			<td>Becton Disckson</td>
			<td>347580</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody Rat anti-BrdU</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>&#160;Ab6326</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological security hood</td>
			<td>Pachane</td>
			<td>PA 410</td>
			<td>Use hood present in the laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (Bovine Serum Albumin)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3294</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>179693</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CldU</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>C6891</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cloridric acid</td>
			<td>Synth</td>
			<td>7647-01-0</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Zeiss LSM Series (7, 8 or 9)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass (or coverslips)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>152460</td>
			<td>Alternatively, Olen - Kasvi Cover Glass (24 x 60 mm) - K5-2460</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM - High Glucose</td>
			<td>LGC/Gibco</td>
			<td>BR30211-05/12100046</td>
			<td>Use culture media specific for the cell line used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E5314</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence Microscope Axiovert 200</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12657-029</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forma Series II Water Jacketed CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific 3110</td>
			<td>13-998-074</td>
			<td>Use cell incubator present in the laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide jar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5516</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Idu</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>I7125</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Synth</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>67-56-1</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Denville</td>
			<td>M1021</td>
			<td>Alternatively, Olen - Kasvi Microscope Slides - K5-7105 OR Precision Glass Line - 7105-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS (&#193;cido 3-morfolinopropano 1-sulf&#244;nico)</td>
			<td>Synth</td>
			<td>1132-61-2</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nocodazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31430-18-9</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate Buffer Saline)</td>
			<td>Life Thechnologies</td>
			<td>3002</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold AntiFade Mountant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36930</td>
			<td>Any antifade moutant solution for immunofluorescence could be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S1 nuclease purified from Aspergillus oryzae</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18001-016</td>
			<td>Pre-dilute the S1 nuclease (1/100 - 1/200) in S1 nuclease dilution buffer provided by the manufacturer, aliquote and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0302</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate Trihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>6131-90-4</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Synth</td>
			<td>&#160;7647-14-5</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>57-50-1</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>West Lab Research</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Synth</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200072</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UVC Lamp</td>
			<td>Non Specific</td>
			<td>-</td>
			<td>Essential: emission lenght of 254 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VLX-3W UV Radiometer</td>
			<td>Vilber Loumart</td>
			<td>-</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>557-34-6</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of post-replicative gaps accumulation and repair in human cells using the dna fiber assay

Анализ ДНК-волокна представляет собой простой и надежный метод анализа динамики репликационной вилки, основанный на иммунодетекции аналогов нуклеотидов, которые включаются в синтез ДНК в клетках человека. Однако этот метод имеет ограниченное разрешение в несколько тысяч килобаз. Следовательно, пострепликтивные одноцепочечные разрывы ДНК (ssDNA) размером всего в несколько сотен оснований не обнаруживаются стандартным анализом. Здесь мы описываем модифицированную версию анализа волокна ДНК, которая использует нуклеазу S1, фермент, который специфически расщепляет ssDNA. При наличии пострепликативных разрывов ssDNA нуклеаза S1 будет нацеливаться и расщеплять промежутки, создавая более короткие тракты, которые могут быть использованы в качестве считывания разрывов ssDNA на текущих вилках. Эти пострепликтивные пробелы сдНК образуются, когда поврежденная ДНК реплицируется прерывисто. Они могут быть восстановлены с помощью механизмов, не связанных с репликацией генома, в процессе, известном как заполнение пробелов или пострепликативное восстановление. Поскольку механизмы заполнения пробелов включают синтез ДНК независимо от S-фазы, изменения в схеме маркировки волокон ДНК также могут быть использованы для мониторинга событий заполнения пробелов. В целом, эти модификации анализа волокон ДНК являются мощными стратегиями для понимания того, как пострепликтивные пробелы формируются и заполняются в геноме клеток человека.

В анализе S1 Fiber, если обработка генотоксическим агентом приводит к пострепликативным пробелам ssDNA, общая длина волокон ДНК из Ядер, обработанных S1, будет короче при лечении повреждением ДНК по сравнению с необработанными образцами, а также с образцами, которые были обработаны генотокси?...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Post-Replicative Gaps Accumulation and Repair in Human Cells Using the DNA Fiber Assay at JoVE.com

Detection of Post-Replicative Gaps Accumulation and Repair in Human Cells Using the DNA Fiber Assay

Здесь мы описываем две модификации анализа волокон ДНК для исследования одноцепочечных разрывов ДНК в репликации ДНК после индукции поражения. Анализ волокон S1 позволяет обнаруживать пострепликтивные промежутки с использованием эндонуклеазы S1, специфичной для ssDNA, в то время как анализ заполнения пробелов позволяет визуализировать и количественно оценивать восстановление пробелов.

Обнаружение пострепликативного накопления и восстановления разрывов в клетках человека с помощью анализа волокон ДНК

The DNA fiber assay is a simple and robust method for the analysis of replication fork dynamics, based on the immunodetection of nucleotide analogs that ...

Наш протокол открывает новые возможности для исследования того, как происходит репликация на поврежденной ДНК. Методы могут обнаруживать образование и восстановление одноцепочечных разрывов ДНК, противоположных поражению ДНК. Нуклеаза S1 расщепляет одноцепочечную ДНК и позволяет обнаруживать пострепликтивные промежутки.Этот подход был впервые использован доктором Менегини и доктором Кордиеро-Стоуном в 1970-х годах в Бразилии и недавно адаптирован нами к анализу волокон ДНК. Использование техники, описанной здесь, для изучения образования и восстановления пострепликативных пробелов может дать представление о механизме репарации ДНК и реакции на стресс репликации, которые поддерживают целостность генома. Для обоих протоколов, описанных здесь, волокна S1 и анализов, заполняющих пробелы, крайне важно включить все элементы управления для обеспечения точной интерпретации данных.Процедура будет продемонстрирована Дави Мартинсом, аспирантом из нашей лаборатории, и доктором Аннабель Куинет, сотрудником, который ранее разработал эти методы при работе в нашей группе. Для начала аспирируйте питательные среды и сразу же добавляйте в клетки питательные среды с 20-микромолярной средой IDU. Инкубируйте клетки при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа в течение ровно 20 минут.Затем быстро промыть клетки предварительно нагретым PBS дважды и облучить их 20 джоулями на квадратный метр UV-C. Используйте необработанные клетки в качестве элементов управления. Немедленно добавьте в клетки среду с 200-микромолярным CldU и инкубируйте их при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа в течение ровно 60 минут.После этого дважды промывайте клетки предварительно подогретым PBS и пронизывайте их буфером CSK 100 в течение от двух до 10 минут в соответствии с клеточной линией при комнатной температуре. После пермеабилизации ЦСК можно увидеть ядра почти без цитоплазмы по сравнению с ядрами до пермеабилизации. Осторожно вылейте PBS вниз по бокам каждой лунки, чтобы промыть ядра PBS.Затем промыть ядра буфером S1. Инкубируйте ядра в буфере S1 с 20 единицами на миллилитр нуклеазы S1 и без нуклеазы S1 в течение 30 минут при 37 градусах Цельсия. Затем аспирируйте буфер S1 и добавьте 0,1% BSA в PBS.Соскоблите ядра и перенесите их в примерно аннотированную 1,5-миллилитровую трубку. Держите трубки на льду все время. Центрифугируйте ядра примерно в 4, 600 раз больше G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия.Повторно суспендировать гранулы в PBS в концентрации приблизительно 1 500 клеток на микролитр. Поместите трубки на лед и сразу же приступайте к приготовлению волокна ДНК по протоколу распространения. Аннотируйте слайды микроскопа углеродным карандашом и разложите их плоско на подносе.Нажмите на нижнюю часть трубки, чтобы обеспечить гомогенизацию, и добавьте два микролитра клеток в верхнюю часть соответствующего слайда. Добавьте шесть микролитров буфера лизиса и лизируйте клетки, пипетируя вверх и вниз примерно пять раз. Используйте наконечник пипетки, чтобы немного потянуть каплю к нижней части слайда и инкубировать в течение пяти минут при комнатной температуре, чтобы лизировать ядра.Наклоните горку примерно на 20-40 градусов и позвольте капле распространиться на нижнюю часть слайда с постоянной низкой скоростью. Дайте слайду высохнуть при комнатной температуре в темноте в течение 10-15 минут. Затем погрузите их в банку, содержащую свежеприготовленный фиксирующий раствор, и инкубируйте в течение пяти минут при комнатной температуре, чтобы зафиксировать ДНК на слайдах.Дважды вымойте слайды PBS в течение пяти минут и денатурируйте ДНК свежеприготовленной 2,5-молярной клоридриновой кислотой в течение 40-60 минут при комнатной температуре. Вымойте слайды PBS три раза в течение пяти минут и блокируйте с 5% BSA, предварительно нагретым в течение 30-60 минут при 37 градусах Цельсия. Осторожно постучите по бумаге, чтобы удалить лишнюю жидкость со слайдов.Добавьте 30 микролитров первичных антител к слайдам по каплям и поместите сверху крышку. Инкубировать в течение 1 - 1,5 часов при комнатной температуре в темной, влажной камере. Поместите слайды в банку с PBS на одну-две минуты, а затем аккуратно снимите крышку.Вымойте PBST в банке три раза в течение пяти минут и поместите слайды в PBS. Удалите лишнюю жидкость, осторожно постучав по бумаге, и добавьте 30 микролитров вторичных антител к слайдам по каплям. Сверху поместите крышку.Инкубировать в течение 45-60 минут при комнатной температуре в темной и влажной камере. Повторите шаги по промывке слайдов и удалению избытка PBS еще раз и добавьте 20 микролитров монтажного реагента по каплям к слайдам. Положите сверху крышку и избегайте пузырьков.Поместите каплю погружного масла в верхнюю часть слайда, где ячейки были лизированы. Используйте зеленый канал и выполните поиск по зеленым точкам в фоновом режиме, чтобы найти фокус. Откройте программное обеспечение Leica Application Suite, нажмите «Получить» и выберите зеленый канал.Отрегулируйте настройки зеленого канала перед анализом. Затем перейдите на красный канал и настройте настройки. Найдите основную концентрацию волокон и двигайтесь к краям, чтобы найти хорошо распространенные, не перекрывающиеся, отдельные волокна.Используйте только один канал, чтобы выбрать регионы для изображений и избежать потенциального смещения. Нажмите на значок «Получить наложение» и настройте программное обеспечение для правильного увеличения микроскопа. Сделайте от 15 до 20 снимков на слайд вместе со всем слайдом на зеленом канале, а затем на красном канале.Теперь два канала объединены, а созданный наложение перемещается в уникальную папку. Можно увидеть волокна красного и зеленого цветов. Откройте программное обеспечение ImageJ, щелкните левой кнопкой мыши пятый значок, выберите второй вариант, а затем выберите инструмент Сегментированная линия.Щелкните левой кнопкой мыши, чтобы нарисовать точный контур красного или зеленого тракта, и щелкните правой кнопкой мыши, чтобы остановить рисунок. Нажмите кнопку M на клавиатуре, чтобы измерить длину. Для волокна S1 отслеживайте измерения красного и зеленого трактов для каждого волокна и измеряйте длины красного и зеленого трактов по крайней мере от 150 волокон из разных изображений.На этих репрезентативных изображениях показано волокно S1. Здесь показан контрольно-зарождающийся тракт ДНК без разрывов и непроницаемый для расщепления нуклеазой S1. Положительный результат ДНК-тракта на промежутки, расщепленные нуклеазой S1, привел к более короткой длине тракта CldU.Схема дифференциальной маркировки, подробно описанная в рукописи текста, может быть выполнена для обозначения событий заполнения пробелов. В этом анализе, называемом анализом заполнения пробелов, более длинные следы IDU с по крайней мере одним участком CldU или меньшим количеством пластырей CldU соответствуют низкой плотности заполнения зазоров. Более короткие тракты IDU, по крайней мере, с одним пластырем CldU, и более длинные тракты IDU с большим количеством участков CldU соответствуют высокой плотности заполнения зазоров.Стадия пермеабилизации этого протокола имеет решающее значение для того, чтобы нуклеаза S1 действовала на промежутки, образующиеся во время репликации поврежденной ДНК. Нуклеаза S1 также может быть использована в протоколе кометного анализа для обнаружения пробелов, образующихся во время репликации поврежденной ДНК, которая сохраняется после лечения. Анализ волокон S1 проложил путь к новой парадигме, согласно которой пострепликационные промежутки могут вызывать уязвимость к раку, особенно при раке молочной железы и яичников, несущем мутации в генах BRCA1 и 2.

Research

JoVE Journal

Genetics

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Обнаружение Copy Number Изменений Использование Single Cell Секвенирование

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Atomic Force Microscopy Investigations of DNA Lesion Recognition in Nucleotide Excision Repair

Атомно-силовая микроскопия Исследования распознавания повреждения ДНК при восстановлении эксцизии нуклеотидов

AFM imaging is a powerful technique for the study of protein-DNA interactions. This single molecule method allows the simultaneous resolution of different ...

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

Иммуноокрашивания для модификации ДНК: Вычислительный анализ конфокальный изображений

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Высокоэффективные гена срыв мышиных и человека гемопоэтических предшественников клеток ТРИФОСФАТЫ/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

A Simple, Rapid, and Quantitative Assay to Measure Repair of DNA-protein Crosslinks on Plasmids Transfected into Mammalian Cells

Простой, быстрый и количественные Assay мера ремонт ДНК белковых сшивки на плазмид Transfected в клетки млекопитающих

The purpose of this method is to provide a flexible, rapid, and quantitative technique to examine the kinetics of DNA-protein crosslink (DPC) repair in ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Обнаружение редких событий, с помощью Исправлена ошибка ДНК и РНК последовательности

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Методология для точного обнаружения метилирования митохондриальной ДНК

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

ATAC-seq Assay with Low Mitochondrial DNA Contamination from Primary Human CD4+ T Lymphocytes

ATAC-seq Assay с низкой митохондриальной ДНК загрязнения от первичного человека CD4 + Т-лимфоцитов

ATAC-seq has become a widely used methodology in the study of epigenetics due to its rapid and simple approach to mapping genome-wide accessible ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay Using Micrococcal Nucleases in Mammalian Cells

Хроматин ИммунопрецитатА Ассасси использованием микрококковой nucleases в клетках млекопитающих

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene ...

Use of Frozen Tissue in the Comet Assay for the Evaluation of DNA Damage

Использование замороженных тканей в ассе кометы для оценки повреждения ДНК

The comet assay is gaining popularity as a means to assess DNA damage in cultured cells and tissues, particularly following exposure to chemicals or other ...