Name: detection of post-replicative gaps accumulation and repair in human cells using the dna fiber assay
Uploaded: 2022-02-03T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Post-Replicative Gaps Accumulation and Repair in Human Cells Using the DNA Fiber Assay at JoVE.com

Arbetet i C.F.M.M.-laboratoriet stöds av Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, São Paulo, Brasilien, Grants #2019/19435-3, #2013/08028-1 och 2017/05680-0) inom ramen för International Collaboration Research från FAPESP och Nederländernas organisation för vetenskaplig forskning (NWO, Nederländerna); Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, Brasília, DF, Brasilien, Grants # 308868/2018-8] och Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal do Ensino Superior (CAPES, Brasília, DF, Brasilien, Finanskod 001).

Eftersom studien använder mänskliga celler godkändes arbetet av etikkommittén vid Institutet för biomedicinsk vetenskap vid universitetet i São Paulo (ICB-USP, godkännandenummer #48347515.3.00005467) för forskning med mänskliga prover.
OBS: Protokollen som beskrivs här användes i tidigare publikationer med mindre ändringar 14,16,28. Här ligger fokus på användningen av ultraviolett ljus ...

<ol>
	<li>Rupp, W. D., Howard-Flanders, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discontinuities+in+the+DNA+synthesized+in+an+excision-defective+strain+of+Escherichia+coli+following+ultraviolet+irradiation.">Discontinuities in the DNA synthesized in an excision-defective strain of Escherichia coli following ultraviolet irradiation.</a> Journal of Molecular Biology. 31 (2), 291-304 (1968).</li><li>Meneghini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gaps+in+DNA+synthesized+by+ultraviolet+light-irradiated+WI38+human+cells.">Gaps in DNA synthesized by ultraviolet light-irradiated WI38 human cells.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 425 (4), 419-427 (1976).</li><li>Meneghini, R., Cordeiro-Stone, M., Schumacher, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+and+frequency+of+gaps+in+newly+synthesized+DNA+of+xeroderma+pigmentosum+human+cells+irradiated+with+ultraviolet+light.">Size and frequency of gaps in newly synthesized DNA of xeroderma pigmentosum human cells irradiated with ultraviolet light.</a> Biophysical Journal. 33 (1), 81-92 (1981).</li><li>Lopes, M., Foiani, M., Sogo, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+mechanisms+control+chromosome+integrity+after+replication+fork+uncoupling+and+restart+at+irreparable+UV+lesions.">Multiple mechanisms control chromosome integrity after replication fork uncoupling and restart at irreparable UV lesions.</a> Molecular Cell. 21 (1), 15-27 (2006).</li><li>Heller, R. C., Marians, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+fork+reactivation+downstream+of+a+blocked+nascent+leading+strand.">Replication fork reactivation downstream of a blocked nascent leading strand.</a> Nature. 439 (7076), 557-562 (2006).</li><li>Bianchi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PrimPol+bypasses+UV+photoproducts+during+eukaryotic+chromosomal+DNA+replication.">PrimPol bypasses UV photoproducts during eukaryotic chromosomal DNA replication.</a> Molecular Cell. 52 (4), 566-573 (2013).</li><li>Garc&#237;a-G&#243;mez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PrimPol,+an+archaic+primase/polymerase+operating+in+human+cells.">PrimPol, an archaic primase/polymerase operating in human cells.</a> Molecular Cell. 52 (4), 541-553 (2013).</li><li>Mour&#243;n, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repriming+of+DNA+synthesis+at+stalled+replication+forks+by+human+PrimPol.">Repriming of DNA synthesis at stalled replication forks by human PrimPol.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 20 (12), 1383-1389 (2013).</li><li>Wan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hPrimpol1/CCDC111+is+a+human+DNA+primase-polymerase+required+for+the+maintenance+of+genome+integrity.">hPrimpol1/CCDC111 is a human DNA primase-polymerase required for the maintenance of genome integrity.</a> EMBO Reports. 14 (12), 1104-1112 (2013).</li><li>Keen, B. A., Jozwiakowski, S. K., Bailey, L. J., Bianchi, J., Doherty, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+dissection+of+the+domain+architecture+and+catalytic+activities+of+human+PrimPol.">Molecular dissection of the domain architecture and catalytic activities of human PrimPol.</a> Nucleic Acids Research. 42 (9), 5830-5845 (2014).</li><li>Tirman, S., Cybulla, E., Quinet, A., Meroni, A., Vindigni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRIMPOL+ready,+set,+reprime.">PRIMPOL ready, set, reprime.</a> Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 56 (1), 17-30 (2021).</li><li>Quinet, A., Lerner, L. K., Martins, D. J., Menck, C. F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filling+gaps+in+translesion+DNA+synthesis+in+human+cells.">Filling gaps in translesion DNA synthesis in human cells.</a> Mutation Research, Genetic Toxicology Environmental Mutagenesis. 836, 127-142 (2018).</li><li>Ziv, O., Diamant, N., Shachar, S., Hendel, A., Livneh, Z., Bjergb&#230;k, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+measurement+of+translesion+DNA+synthesis+in+mammalian+cells.">Quantitative measurement of translesion DNA synthesis in mammalian cells.</a> DNA Repair Protocols. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). 920, (2012).</li><li>Quinet, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translesion+synthesis+mechanisms+depend+on+the+nature+of+DNA+damage+in+UV-irradiated+human+cells.">Translesion synthesis mechanisms depend on the nature of DNA damage in UV-irradiated human cells.</a> Nucleic Acids Research. 44 (12), 5717-5731 (2016).</li><li>T&#233;cher, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+dynamics:+biases+and+robustness+of+DNA+fiber+analysis.">Replication dynamics: biases and robustness of DNA fiber analysis.</a> Journal of Molecular Biology. 425 (23), 4845-4855 (2013).</li><li>Quinet, A., Carvajal-Maldonado, D., Lemacon, D., Vindigni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+fiber+analysis:+Mind+the+gap.">DNA fiber analysis: Mind the gap.</a> Methods in Enzymology. 591, 55-82 (2017).</li><li>Elvers, I., Johansson, F., Groth, P., Erixon, K., Helleday, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UV+stalled+replication+forks+restart+by+re-priming+in+human+fibroblasts.">UV stalled replication forks restart by re-priming in human fibroblasts.</a> Nucleic Acids Research. 39 (16), 7049-7057 (2011).</li><li>Diamant, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+bypass+operates+in+the+S+and+G2+phases+of+the+cell+cycle+and+exhibits+differential+mutagenicity.">DNA damage bypass operates in the S and G2 phases of the cell cycle and exhibits differential mutagenicity.</a> Nucleic Acids Research. 40 (1), 170-180 (2012).</li><li>Temviriyanukul, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporally+distinct+translesion+synthesis+pathways+for+ultraviolet+light-induced+photoproducts+in+the+mammalian+genome.">Temporally distinct translesion synthesis pathways for ultraviolet light-induced photoproducts in the mammalian genome.</a> DNA Repair. 11 (6), 550-558 (2012).</li><li>Jansen, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redundancy+of+mammalian+Y+family+DNA+polymerases+in+cellular+responses+to+genomic+DNA+lesions+induced+by+ultraviolet+light.">Redundancy of mammalian Y family DNA polymerases in cellular responses to genomic DNA lesions induced by ultraviolet light.</a> Nucleic Acids Research. 42 (17), 11071 (2014).</li><li>Quinet, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap-filling+and+bypass+at+the+replication+fork+are+both+active+mechanisms+for+tolerance+of+low-dose+ultraviolet-induced+DNA+damage+in+the+human+genome.">Gap-filling and bypass at the replication fork are both active mechanisms for tolerance of low-dose ultraviolet-induced DNA damage in the human genome.</a> DNA Repair. 14 (1), 27-38 (2014).</li><li>Callegari, A. J., Clark, E., Pneuman, A., Kelly, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postreplication+gaps+at+UV+lesions+are+signals+for+checkpoint+activation.">Postreplication gaps at UV lesions are signals for checkpoint activation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (18), 8219-8224 (2010).</li><li>Vogt, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+further+properties+of+single-strand-specific+nuclease+from+Aspergillus+oryzae.">Purification and further properties of single-strand-specific nuclease from Aspergillus oryzae.</a> European Journal of Biochemistry. 33 (1), 192-200 (1973).</li><li>Cordeiro-Stone, M., Schumacher, R. I., Meneghini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+replication+fork+in+ultraviolet+light-irradiated+human+cells.">Structure of the replication fork in ultraviolet light-irradiated human cells.</a> Biophysical Journal. 27 (2), 287-300 (1979).</li><li>Lehmann, A. R., Fuchs, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gaps+and+forks+in+DNA+replication:+Rediscovering+old+models.">Gaps and forks in DNA replication: Rediscovering old models.</a> DNA Repair (Amst). 5 (12), 1495-1498 (2006).</li><li>Daigaku, Y., Davies, A. A., Ulrich, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin-dependent+DNA+damage+bypass+is+separable+from+genome+replication.">Ubiquitin-dependent DNA damage bypass is separable from genome replication.</a> Nature. 465 (7300), 951-955 (2010).</li><li>Karras, G. I., Jentsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RAD6+DNA+damage+tolerance+pathway+operates+uncoupled+from+the+replication+fork+and+is+functional+beyond+S+phase.">The RAD6 DNA damage tolerance pathway operates uncoupled from the replication fork and is functional beyond S phase.</a> Cell. 141 (2), 255-267 (2010).</li><li>Tirman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporally+distinct+post-replicative+repair+mechanisms+fill+PRIMPOL-dependent+ssDNA+gaps+in+human+cells.">Temporally distinct post-replicative repair mechanisms fill PRIMPOL-dependent ssDNA gaps in human cells.</a> Molecular Cell. 81 (19), 4026-4040 (2021).</li><li>Cong, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+gaps+are+a+key+determinant+of+PARP+inhibitor+synthetic+lethality+with+BRCA+deficiency.">Replication gaps are a key determinant of PARP inhibitor synthetic lethality with BRCA deficiency.</a> Molecular Cell. 81 (15), 3128-3144 (2021).</li><li>Quinet, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRIMPOL-mediated+adaptive+response+suppresses+replication+fork+reversal+in+BRCA-deficient+cells.">PRIMPOL-mediated adaptive response suppresses replication fork reversal in BRCA-deficient cells.</a> Molecular Cell. 77 (3), 461-474 (2020).</li><li>Jackson, D. A., Pombo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replicon+clusters+are+stable+units+of+chromosome+structure:+evidence+that+nuclear+organization+contributes+to+the+efficient+activation+and+propagation+of+S+phase+in+human+cells.">Replicon clusters are stable units of chromosome structure: evidence that nuclear organization contributes to the efficient activation and propagation of S phase in human cells.</a> The Journal of Cell Biology. 140 (6), 1285-1295 (1998).</li><li>Schwab, R. A., Niedzwiedz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+DNA+replication+in+the+vertebrate+model+system+DT40+using+the+DNA+fiber+technique.">Visualization of DNA replication in the vertebrate model system DT40 using the DNA fiber technique.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (56), e3255 (2011).</li><li>Simoneau, A., Xiong, R., Zou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+trans+cell+cycle+effects+of+PARP+inhibitors+underlie+their+selectivity+toward+BRCA1/2-deficient+cells.">The trans cell cycle effects of PARP inhibitors underlie their selectivity toward BRCA1/2-deficient cells.</a> Genes &amp; Development. 35 (17-18), 1271-1289 (2021).</li><li>Taglialatela, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=REV1-Pol&#950;+maintains+the+viability+of+homologous+recombination-deficient+cancer+cells+through+mutagenic+repair+of+PRIMPOL-dependent+ssDNA+gaps.">REV1-Pol&#950; maintains the viability of homologous recombination-deficient cancer cells through mutagenic repair of PRIMPOL-dependent ssDNA gaps.</a> Molecular Cell. 81 (19), 4008-4025 (2021).</li><li>Lim, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=USP1+Is+required+for+replication+fork+protection+in+BRCA1-deficient+tumors.">USP1 Is required for replication fork protection in BRCA1-deficient tumors.</a> Molecular Cell. 72 (6), 925-941 (2018).</li><li>Peng, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposing+roles+of+FANCJ+and+HLTF+protect+forks+and+restrain+replication+during+stress.">Opposing roles of FANCJ and HLTF protect forks and restrain replication during stress.</a> Cell Reports. 24 (12), 3251-3261 (2018).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA+translocase+FANCM/MHF+promotes+replication+traverse+of+DNA+interstrand+crosslinks.">The DNA translocase FANCM/MHF promotes replication traverse of DNA interstrand crosslinks.</a> Molecular Cell. 52 (3), 434-446 (2013).</li><li>Ding, W., Bishop, M. E., Lyn-Cook, L. E., Davis, K. J., Manjanatha, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+alkaline+comet+assay+and+enzyme-modified+alkaline+comet+assay+for+measuring+DNA+strand+breaks+and+oxidative+DNA+damage+in+rat+liver.">In vivo alkaline comet assay and enzyme-modified alkaline comet assay for measuring DNA strand breaks and oxidative DNA damage in rat liver.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (111), e53833 (2016).</li><li>Lu, Y., Liu, Y., Yang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+in+vitro+DNA+damage+using+comet+assay.">Evaluating in vitro DNA damage using comet assay.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (128), e56450 (2017).</li></ol>

Kritiska steg i det vanliga DNA-fiberanalysprotokollet diskuterades i en tidigare publikation32. Här beskriver vi modifierade versioner av standard DNA-fiberanalysen för att undersöka förekomsten av postreplikativa ssDNA-luckor samt deras reparation genom gapfyllning, som ursprungligen beskrivs i14. I samband med postreplikativ ssDNA-gapnärvaro skulle användningen av S1-nukleaset i S1 Fiber-protokollet sannolikt vara lämplig efter exponering av ett genotoxiskt medel ...

Banbrytande arbeten har gett bevis för ackumulering av postreplikativa enkelsträngade (ssDNA) luckor vid behandling med DNA-skadliga medel i bakterier1 och mänskliga celler 2,3. Under replikation av skadade DNA-mallar kan DNA-syntesmaskineriet kringgå lesionerna genom att använda specifika translesionssyntes-DNA-polymeraser eller genom mallväxlingsmekanismer. Alternativt kan replisome också helt enkelt hoppa över lesionen och lämna ett ssDNA-gap bakom sig för att repareras senare. På senare tid visade en studie tydligt att behandling med genotoxiska medel leder till ssDNA-luckor i eukaryoter genom att använda elektronmikroskopi för att visualisera den specifika strukturen hos replikationsmellanprodukter4. Bildandet av dessa regioner av postreplikativa luckor föreslogs ursprungligen vara ett enkelt resultat av det semi-diskontinuerliga läget för DNA-replikation2. I detta fall kan en lesion på den eftersläpande strängen blockera förlängningen av ett Okazaki-fragment, men gaffelprogressionen räddas naturligt av följande Okazaki-fragment och lämnar ett ssDNA-gap. Ytterligare studier visade emellertid att bildandet av luckor på den ledande strängen också är möjlig, vilket först visades i bakterier5. I eukaryoter visade sig PRIMPOL, ett unikt DNA-polymeras med primasaktivitet, kunna starta om DNA-syntesen nedströms en replikationsblockerande lesion genom sin reprimeringsaktivitet 6,7,8,9,10,11. Således kan PRIMPOL-primasaktiviteten förklara bildandet av postreplikativa ssDNA-luckor i den ledande strängen vid behandling med ett DNA-skadligt medel i mänskliga celler12. Icke desto mindre krävde upptäckt av dessa luckor såväl som gapreparation, tills nyligen, indirekta eller tidskrävande metoder såsom elektronmikroskopi4 eller plasmidbaserade analyser13. Användningen av det ssDNA-specifika S1-nukleaset för att upptäcka luckor i mänskliga celler var banbrytande av tidiga studier för mer än fyrtio år sedan, med hjälp av sackarosgradienttekniker 2,3. På senare tid tillämpade vår grupp användningen av detta nukleas för att detektera ssDNA vid replikering av DNA (postreplikativa luckor) med andra metoder som DNA-fiber och kometanalyser14. Dessa nya tillvägagångssätt banade väg för den nuvarande ökningen av studier om postreplikativa luckor. Här beskriver vi en strategi för att använda S1-nukleas för att upptäcka postreplikativa ssDNA-luckor genom DNA-fiberanalys och förklarar hur ett differentiellt märkningsschema i DNA-fiberprotokollet kan möjliggöra studier av reparationen av dessa luckor.
DNA-fiberanalysen är en kraftfull teknik som har använts av ett växande antal laboratorier och har gett värdefulla insikter om replikationsgaffeldynamik och replikationsspänningsresponsmekanismer. Kortfattat är denna teknik baserad på sekventiell införlivande av nukleotidanaloger (såsom CldU -5-klor-2'-deoxyuridin- och IdU-5-jod-2'-deoxiuridin) i det replikerande DNA. Efter skörd lyseras celler och DNA-molekyler sprids på en positivt belagd glasskiva. CldU och IdU detekteras sedan av specifika antikroppar, som kan visualiseras i ett fluorescerande mikroskop som tvåfärgade fibrer. Slutligen mäts längderna på IdU- och CldU-kanalerna för att identifiera eventuella förändringar av DNA-replikationsdynamiken som en följd av DNA-skadeinduktion. Denna teknik kan användas för att undersöka olika fenomen, såsom gaffelstoppning, gaffelbromsning, begynnande DNA-nedbrytning och variationer i ursprungsfrekvensen som skjuter15,16.
En begränsning av DNA-fiberanalysen är dess upplösning på några kilobaser. Eftersom postreplikativa ssDNA-luckor kan ligga i intervallet hundratals baser är det omöjligt att visualisera dessa luckor direkt med standard DNA-fiberprotokollet. Förekomsten av ssDNA-luckor vid replikering av DNA i mänskliga celler behandlade med genotoxiska medel har varit indirekt inblandad tidigare. Till exempel observationen av ssDNA som bedömts genom rekrytering av det ssDNA-bindande proteinet, replikationsproteinet A (RPA), i celler utanför S-fasen, eller bildandet av ssDNA som detekterats genom alkalisk DNA-avveckling i kombination med frånvaron av långvarig gaffelstoppning genom DNA-fiberanalys 12,17,18,19,20,21 tillskrevs ackumuleringen av ssDNA-luckor. Dessutom inducerar postreplikativa ssDNA-luckor en ATR-beroende G2 / M-faskontrollpunkt och arresterar celler behandlade med replikationsgifter 18,19,20,21,22.
S1-nukleaset bryter ned enkelsträngade nukleinsyror som frigör 5'-fosforylmono- eller oligonukleotider och har en 5 gånger högre affinitet till ssDNA jämfört med RNA. Dubbelsträngade nukleinsyror (DNA: DNA, DNA: RNA eller RNA: RNA) är resistenta mot S1-nukleaset utom när de används i extremt höga koncentrationer. S1-nukleaset klyver också dubbelsträngat DNA vid det enkelsträngade området orsakat av ett nick, gap, mismatch eller loop. S1-nukleaset är således ett ssDNA-specifikt endonukleas som kan klyva ssDNA-luckor, vilket i slutändan genererar dubbelsträngade brott 23,24. Således möjliggör tillägg av steg för S1-nukleasförtunning till DNA-fiberprotokollet indirekt detektering av postreplikativa ssDNA-luckor. I närvaro av luckor kommer behandling av exponerade kärnor med S1-nukleaset före DNA-spridning att generera kortare kanaler som en följd av S1-klyvning av ssDNA som i sig finns vid luckor14. Följaktligen är traktförkortning avläsningen för ssDNA-luckor med hjälp av denna metod. Jämfört med det vanliga DNA-fiberprotokollet kräver DNA-fibern med S1-nukleaset endast två extra steg: kärnexponering (cellpermeabilisering) och behandling med S1-nukleaset. Det är viktigt att notera att lämpliga kontroller är obligatoriska, såsom prover som behandlats med det genotoxiska medlet men utan S1-nukleas och prover som behandlats med S1-nukleas utan genotoxiskt medel. Protokollet i sig, inklusive införlivande av analoger, S1-behandling och spridning, kan utföras på en dag och kräver inte exceptionellt material. Det kräver bara tymidinanalogerna, det renade S1-nukleaset, lämpliga primära och sekundära antikroppar och ett fluorescerande mikroskop. Sammantaget upptäcker DNA-fibern som använder S1-nukleaset ssDNA-luckor på pågående replikationsgafflar med ett relativt enkelt tillvägagångssätt.
De postreplikativa ssDNA-luckorna som bildas som en följd av replikationsspänningsresponsmekanismer kan repareras (eller fyllas) av olika mekanismer, inklusive translesions-DNA-syntes eller mallväxling, i en process som kallas gap-filling eller post-replication repair (PRR)25. Dessa processer sker bakom de framryckande gafflarna, vilket involverar replikationsoberoende DNA-syntes 14,26,27. Baserat på dessa resultat kan ett märkningsschema som skiljer sig från standard DNA-fiberanalysen utföras för att visualisera gapfyllningshändelser i G2-fasen direkt 14,16,26,28. Specifikt kan en tymidinanalog användas för att märka replikationsgaffeln vid tidpunkten för genotoxisk behandling och postreplikativ ssDNA-gapbildning, medan en annan tymidinanalog kan användas för att märka gapfyllande händelser. I detta protokoll märks celler med en första tymidinanalog (till exempel IdU) omedelbart efter eller samtidigt med genotoxisk behandling i 1 timme, så att det framväxande DNA:t märks vid tidpunkten för gapbildning. Nocodazol tillsätts vid behandling för någonstans mellan 12-24 h för att arrestera celler i G2 / M, vilket förhindrar följande S-fas. För de sista 4 timmarna av nocodazolbehandling tillsätts en andra tymidinanalog (till exempel CldU) till mediet som ska införlivas under gapfyllning. Viktigt är att denna analys endast kan användas för att upptäcka gapfyllande händelser i G2 eftersom gapfyllningssignalen från CldU inte kan särskiljas från en signal på grund av CldU-införlivande i replikerande DNA i S-fasen. För att minimera bakgrundssignalen bör därför tidpunkten för CldU-införlivande efter skadeinduktion sammanfalla med när större delen av cellpopulationen går in i G2-fas14. Därför kommer denna tidpunkt att variera beroende på cellinje och behandlingsförhållanden. Optimering av cellcykelprogression innan du använder denna analys rekommenderas. Samfärgning av dessa tymidinanaloger möjliggör visualisering av gapfyllande (PRR) kanaler (CldU-fläckar) ovanpå begynnande DNA (IdU-kanaler) syntetiserade under den genotoxiska behandlingen när ssDNA-luckor genererades.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid, Glacial</td>
			<td>Synth</td>
			<td>64-19-7</td>
			<td>Alternatively, BSA - Biosera - REF PM-T1725/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium hydroxide</td>
			<td>Synth</td>
			<td>1336-21-6</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody anti-mouse IgG1 Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11005</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody anti-rat Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21470</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody Mouse anti-BrdU</td>
			<td>Becton Disckson</td>
			<td>347580</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody Rat anti-BrdU</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>&#160;Ab6326</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological security hood</td>
			<td>Pachane</td>
			<td>PA 410</td>
			<td>Use hood present in the laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (Bovine Serum Albumin)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3294</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>179693</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CldU</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>C6891</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cloridric acid</td>
			<td>Synth</td>
			<td>7647-01-0</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Zeiss LSM Series (7, 8 or 9)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass (or coverslips)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>152460</td>
			<td>Alternatively, Olen - Kasvi Cover Glass (24 x 60 mm) - K5-2460</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM - High Glucose</td>
			<td>LGC/Gibco</td>
			<td>BR30211-05/12100046</td>
			<td>Use culture media specific for the cell line used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E5314</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence Microscope Axiovert 200</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12657-029</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forma Series II Water Jacketed CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific 3110</td>
			<td>13-998-074</td>
			<td>Use cell incubator present in the laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide jar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5516</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Idu</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>I7125</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Synth</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>67-56-1</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Denville</td>
			<td>M1021</td>
			<td>Alternatively, Olen - Kasvi Microscope Slides - K5-7105 OR Precision Glass Line - 7105-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS (&#193;cido 3-morfolinopropano 1-sulf&#244;nico)</td>
			<td>Synth</td>
			<td>1132-61-2</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nocodazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31430-18-9</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate Buffer Saline)</td>
			<td>Life Thechnologies</td>
			<td>3002</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold AntiFade Mountant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36930</td>
			<td>Any antifade moutant solution for immunofluorescence could be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S1 nuclease purified from Aspergillus oryzae</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18001-016</td>
			<td>Pre-dilute the S1 nuclease (1/100 - 1/200) in S1 nuclease dilution buffer provided by the manufacturer, aliquote and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0302</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate Trihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>6131-90-4</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Synth</td>
			<td>&#160;7647-14-5</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>57-50-1</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>West Lab Research</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Synth</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200072</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UVC Lamp</td>
			<td>Non Specific</td>
			<td>-</td>
			<td>Essential: emission lenght of 254 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VLX-3W UV Radiometer</td>
			<td>Vilber Loumart</td>
			<td>-</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>557-34-6</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of post-replicative gaps accumulation and repair in human cells using the dna fiber assay

DNA-fiberanalysen är en enkel och robust metod för analys av replikationsgaffeldynamik, baserat på immunodetektion av nukleotidanaloger som införlivas under DNA-syntes i mänskliga celler. Denna teknik har dock en begränsad upplösning på några tusen kilobaser. Följaktligen kan postreplikativa enkelsträngade DNA -luckor (ssDNA) så små som några hundra baser inte detekteras av standardanalysen. Här beskriver vi en modifierad version av DNA-fiberanalysen som använder S1-nukleaset, ett enzym som specifikt klyver ssDNA. I närvaro av postreplikativa ssDNA-luckor kommer S1-nukleaset att rikta in sig på och klyva luckorna, vilket genererar kortare kanaler som kan användas som avläsning för ssDNA-luckor på pågående gafflar. Dessa postreplikativa ssDNA-luckor bildas när skadat DNA replikeras diskontinuerligt. De kan repareras via mekanismer som är frikopplade från genomreplikation, i en process som kallas gap-filling eller post-replicative repair. Eftersom gapfyllningsmekanismer involverar DNA-syntes oberoende av S-fasen, kan förändringar i DNA-fibermärkningsschemat också användas för att övervaka gap-fyllningshändelser. Sammantaget är dessa modifieringar av DNA-fiberanalysen kraftfulla strategier för att förstå hur postreplikativa luckor bildas och fylls i genomet hos mänskliga celler.

I S1 Fiber-analysen, om behandling med ett genotoxiskt medel leder till postreplikativa ssDNA-luckor, kommer de totala längderna av DNA-fibrer från S1-behandlade kärnor att vara kortare vid behandling med DNA-skador jämfört med obehandlade prover samt prover som behandlades med det genotoxiska medlet men inte skickades till S1-klyvning (figur 1).
Alternativt, om behandling med S1-nukleaset inte signifikant påverkar längden på DNA-fibrer jämfört med obeha...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Post-Replicative Gaps Accumulation and Repair in Human Cells Using the DNA Fiber Assay at JoVE.com

Detection of Post-Replicative Gaps Accumulation and Repair in Human Cells Using the DNA Fiber Assay

Här beskriver vi två modifieringar av DNA-fiberanalysen för att undersöka enkelsträngade DNA-luckor vid replikering av DNA efter lesionsinduktion. S1-fiberanalysen möjliggör detektering av postreplikativa luckor med hjälp av det ssDNA-specifika S1-endonukleaset, medan den gapfyllande analysen möjliggör visualisering och kvantifiering av gapreparation.

Detektion av postreplikativa luckor ackumulering och reparation i mänskliga celler med hjälp av DNA-fiberanalysen

The DNA fiber assay is a simple and robust method for the analysis of replication fork dynamics, based on the immunodetection of nucleotide analogs that ...

Vårt protokoll öppnar nya möjligheter att undersöka hur replikation sker på skadat DNA. Teknikerna kan detektera bildandet och reparationen av enkelsträngade DNA-luckor, mittemot DNA-lesionen. S1-nukleaset klyver det enkelsträngade DNA:t och möjliggör detektering av postreplikativa luckor.Detta tillvägagångssätt användes först av Dr.Meneghini och Dr.Cordiero-Stone på 1970-talet i Brasilien och anpassades nyligen av oss till DNA-fiberanalysen. Att använda tekniken som beskrivs här för att studera bildandet och reparationen av postreplikativa luckor kan ge insikter i mekanismen för DNA-reparation och replikationsstressrespons som upprätthåller genomintegritet. För båda protokollen som beskrivs här, S1-fibern och gapfyllningsanalyserna, Det är viktigt att inkludera alla kontroller för att säkerställa korrekt tolkning av data.Förfarandet kommer att demonstreras av Davi J.Martins, en doktorand från vårt laboratorium, och Dr.Annabel Quinet, en samarbetspartner som tidigare utvecklade dessa tekniker när han arbetade i vår grupp. Till att börja med, aspirera odlingsmediet och lägg omedelbart till odlingsmediet med 20-mikromolar IDU-media till cellerna. Inkubera cellerna vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid i exakt 20 minuter.Tvätta sedan snabbt cellerna med förvärmd PBS två gånger och bestråla dem med 20 joule per meter kvadrat UV-C. Använd obehandlade celler som kontroller. Tillsätt omedelbart mediet med 200 mikromolar CldU till cellerna och inkubera dem vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid i exakt 60 minuter.Tvätta sedan cellerna med förvärmd PBS två gånger och permeabilisera dem med CSK 100-bufferten i två till 10 minuter enligt cellinjen vid rumstemperatur. Efter CSK-permeabilisering kan kärnorna med nästan ingen cytoplasma ses jämfört med dem före permeabiliseringen. Häll försiktigt PBS längs sidan av varje brunn för att tvätta kärnorna med PBS.Tvätta sedan kärnorna med S1-buffert. Inkubera kärnorna i S1-bufferten med 20 enheter per milliliter S1-nukleas och utan S1-nukleas i 30 minuter vid 37 grader Celsius. Aspirera sedan S1-bufferten och tillsätt 0,1% BSA i PBS.Skrapa kärnorna och överför dem till ett ungefär kommenterat 1,5 ml rör. Håll rören på is hela tiden. Centrifugera kärnorna vid cirka 4 600 gånger G i fem minuter vid fyra grader Celsius.Återsuspendera pellets i PBS i en koncentration av cirka 1 500 celler per mikroliter. Placera rören på is och fortsätt omedelbart till DNA-fiberberedning genom att sprida protokollet. Kommentera mikroskopglasen med en kolpenna och placera dem platt på en bricka.Tryck på rörets botten för att säkerställa homogenisering och lägg till två mikroliter av celler på toppen av motsvarande bild. Tillsätt sex mikroliter av lysbufferten och lysera cellerna genom att pipettera upp och ner cirka fem gånger. Använd pipettspetsen för att dra droppen något mot botten av bilden och inkubera i fem minuter vid rumstemperatur för att lysera kärnorna.Luta bilden i cirka 20 till 40 grader och låt droppen spridas till botten av bilden med konstant låg hastighet. Låt bilden torka vid rumstemperatur i mörkret i 10 till 15 minuter. Sänk sedan ner dem i en burk som innehåller den nyberedda fixeringslösningen och inkubera i fem minuter vid rumstemperatur för att fixera DNA på bilderna.Tvätta bilderna med PBS två gånger i fem minuter och denaturera DNA med nyberedd 2,5-molar kloridinsyra i 40 till 60 minuter vid rumstemperatur. Tvätta bilderna med PBS tre gånger i fem minuter och blockera med 5% BSA som tidigare värmts i 30 till 60 minuter vid 37 grader Celsius. Tryck försiktigt på papperet för att ta bort överskottsvätskan från bilderna.Tillsätt 30 mikroliter primära antikroppar till objektglasen droppvis och placera en täckglidning ovanpå. Inkubera i 1 till 1,5 timmar vid rumstemperatur i en mörk, fuktig kammare. Placera bilderna i en burk med PBS i en till två minuter och ta sedan försiktigt bort locklapparna.Tvätta med PBST i en burk tre gånger i fem minuter och placera bilderna i PBS. Ta bort överskottsvätskan genom att försiktigt knacka på ett papper och tillsätt 30 mikroliter av de sekundära antikropparna till bilderna droppvis. Lägg en locklapp ovanpå.Inkubera i 45 till 60 minuter vid rumstemperatur i en mörk och fuktig kammare. Upprepa stegen för att tvätta bilderna och ta bort överskottet av PBS en gång till och tillsätt 20 mikroliter av monteringsreagenset droppvis till bilderna. Lägg en lockglidning ovanpå och undvik bubblor.Placera en droppe nedsänkningsolja nära toppen av bilden där cellerna lyserades. Använd den gröna kanalen och sök på de gröna prickarna i bakgrunden för att hitta fokus. Öppna Leica Application Suite-programvaran, klicka på Skaffa och välj den gröna kanalen.Justera inställningarna för den gröna kanalen före analys. Byt sedan till den röda kanalen och justera inställningarna. Hitta huvudkoncentrationen av fibrer och flytta till kanterna för att hitta de väl spridda, icke-överlappande, enskilda fibrerna.Använd bara en kanal för att välja regioner för bilderna och undvika potentiell partiskhet. Klicka på ikonen Acquire Overlay och justera programvaran för rätt mikroskopförstoring. Ta cirka 15 till 20 bilder per bild tillsammans med hela bilden vid den gröna kanalen och sedan vid den röda kanalen.De två kanalerna slås nu samman och det skapade överlägget flyttas till en unik mapp. Det är möjligt att se fibrerna med röda och gröna färger. Öppna ImageJ-programvaran, vänsterklicka på den femte ikonen, välj det andra alternativet och välj sedan segmenterad linjeverktyg.Vänsterklicka för att rita den exakta banan för det röda eller gröna området och högerklicka för att stoppa ritningen. Tryck på M-knappen på tangentbordet för att mäta längden. För S1-fibern, håll koll på de röda och gröna dragmätningarna för varje fiber och mät röda och gröna draglängder från minst 150 fibrer från olika bilder.En S1-fiber visas i dessa representativa bilder. Kontroll-begynnande DNA-kanal utan luckor och ogenomtränglig för klyvning av S1-nukleaset visas här. DNA-kanalpositivt för luckor klyvda av S1-nukleaset resulterade i en kortare CldU-kanallängd.Ett differentiellt märkningsschema som beskrivs utförligt i textmanuskriptet kan utföras för att märka gap-fyllningshändelser. I denna analys, som heter gap-filling assay, motsvarar längre IDU-spår med minst en CldU-patch eller färre CldU-patchar låg gapfyllningstäthet. Kortare IDU-kanaler, med minst en CldU-lapp, och längre IDU-områden med fler CldU-plåster, motsvarar hög gapfyllningstäthet.Permeabiliseringssteget i detta protokoll är avgörande för att S1-nukleaset ska verka på de luckor som bildas under replikationen av skadat DNA. S1-nukleaset kan också användas i kometanalysprotokollet för att detektera de luckor som bildas under replikationen av skadat DNA som kvarstår efter behandling. S1-fiberanalysen banade väg för det nya paradigmet att postreplikativa luckor kan orsaka cancersårbarhet, särskilt i bröst- och äggstockscancer som bär mutationer i BRCA1- och 2-gener.

Research

JoVE Journal

Genetics

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detektion av Copy Number Ändringar Använda Single Cell Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Atomic Force Microscopy Investigations of DNA Lesion Recognition in Nucleotide Excision Repair

Atomic Force Microscopy Undersökningar av DNA-lesionsigenkänning i Nucleotide Excision Repair

AFM imaging is a powerful technique for the study of protein-DNA interactions. This single molecule method allows the simultaneous resolution of different ...

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

Immunfärgning för DNA ändringar: tillämpad analys av Confocal bilder

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Högeffektiva gen störningar av murina och mänskliga hematopoetiska stamceller av CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

A Simple, Rapid, and Quantitative Assay to Measure Repair of DNA-protein Crosslinks on Plasmids Transfected into Mammalian Cells

En enkel, snabb och kvantitativa analysen till åtgärd reparation av DNA-protein antipyridinantikropp på plasmider transfekterade i däggdjursceller

The purpose of this method is to provide a flexible, rapid, and quantitative technique to examine the kinetics of DNA-protein crosslink (DPC) repair in ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Detektion av sällsynta händelser med fel-korrigerade DNA och RNA-sekvensering

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Metodik för korrekt upptäckt av mitokondrie-DNA metylering

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

ATAC-seq Assay with Low Mitochondrial DNA Contamination from Primary Human CD4+ T Lymphocytes

ATAC-seq Assay med låg Mitokondrie-DNA kontaminering från primära humana CD4 + T-lymfocyter

ATAC-seq has become a widely used methodology in the study of epigenetics due to its rapid and simple approach to mapping genome-wide accessible ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay Using Micrococcal Nucleases in Mammalian Cells

Kromatin immunoprecipitation analys med hjälp av Micrococcal nukleaser i däggdjursceller

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene ...

Use of Frozen Tissue in the Comet Assay for the Evaluation of DNA Damage

Användning av fryst vävnad i kometanalysen för utvärdering av DNA-skador

The comet assay is gaining popularity as a means to assess DNA damage in cultured cells and tissues, particularly following exposure to chemicals or other ...