Name: detection of post-replicative gaps accumulation and repair in human cells using the dna fiber assay
Uploaded: 2022-02-03T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Post-Replicative Gaps Accumulation and Repair in Human Cells Using the DNA Fiber Assay at JoVE.com

C.F.M.M. laboratuvarındaki çalışmalar, FAPESP ve Hollanda Bilimsel Araştırma Örgütü (NWO, Hollanda) Uluslararası İşbirliği Araştırması kapsamında Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, São Paulo, Brezilya, Grants #2019/19435-3, #2013/08028-1 ve 2017/05680-0) tarafından desteklenmektedir; Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, Brasília, DF, Brazil, Grants # 308868/2018-8] ve Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal do Ensino Superior (CAPES, Brasília, DF, Brazil, Finance Code 001).

Çalışma insan hücrelerini kullandığından, çalışma São Paulo Üniversitesi Biyomedikal Bilimler Enstitüsü Etik Kurulu tarafından (ICB-USP, onay numarası #48347515.3.00005467) insan örnekleriyle yapılan araştırmalar için onaylanmıştır.
NOT: Burada açıklanan protokoller önceki yayınlarda 14,16,28 gibi küçük değişikliklerle kullanılmıştır. Burada odak noktası, DNA'ya z...

<ol>
	<li>Rupp, W. D., Howard-Flanders, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discontinuities+in+the+DNA+synthesized+in+an+excision-defective+strain+of+Escherichia+coli+following+ultraviolet+irradiation.">Discontinuities in the DNA synthesized in an excision-defective strain of Escherichia coli following ultraviolet irradiation.</a> Journal of Molecular Biology. 31 (2), 291-304 (1968).</li><li>Meneghini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gaps+in+DNA+synthesized+by+ultraviolet+light-irradiated+WI38+human+cells.">Gaps in DNA synthesized by ultraviolet light-irradiated WI38 human cells.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 425 (4), 419-427 (1976).</li><li>Meneghini, R., Cordeiro-Stone, M., Schumacher, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+and+frequency+of+gaps+in+newly+synthesized+DNA+of+xeroderma+pigmentosum+human+cells+irradiated+with+ultraviolet+light.">Size and frequency of gaps in newly synthesized DNA of xeroderma pigmentosum human cells irradiated with ultraviolet light.</a> Biophysical Journal. 33 (1), 81-92 (1981).</li><li>Lopes, M., Foiani, M., Sogo, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+mechanisms+control+chromosome+integrity+after+replication+fork+uncoupling+and+restart+at+irreparable+UV+lesions.">Multiple mechanisms control chromosome integrity after replication fork uncoupling and restart at irreparable UV lesions.</a> Molecular Cell. 21 (1), 15-27 (2006).</li><li>Heller, R. C., Marians, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+fork+reactivation+downstream+of+a+blocked+nascent+leading+strand.">Replication fork reactivation downstream of a blocked nascent leading strand.</a> Nature. 439 (7076), 557-562 (2006).</li><li>Bianchi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PrimPol+bypasses+UV+photoproducts+during+eukaryotic+chromosomal+DNA+replication.">PrimPol bypasses UV photoproducts during eukaryotic chromosomal DNA replication.</a> Molecular Cell. 52 (4), 566-573 (2013).</li><li>Garc&#237;a-G&#243;mez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PrimPol,+an+archaic+primase/polymerase+operating+in+human+cells.">PrimPol, an archaic primase/polymerase operating in human cells.</a> Molecular Cell. 52 (4), 541-553 (2013).</li><li>Mour&#243;n, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repriming+of+DNA+synthesis+at+stalled+replication+forks+by+human+PrimPol.">Repriming of DNA synthesis at stalled replication forks by human PrimPol.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 20 (12), 1383-1389 (2013).</li><li>Wan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hPrimpol1/CCDC111+is+a+human+DNA+primase-polymerase+required+for+the+maintenance+of+genome+integrity.">hPrimpol1/CCDC111 is a human DNA primase-polymerase required for the maintenance of genome integrity.</a> EMBO Reports. 14 (12), 1104-1112 (2013).</li><li>Keen, B. A., Jozwiakowski, S. K., Bailey, L. J., Bianchi, J., Doherty, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+dissection+of+the+domain+architecture+and+catalytic+activities+of+human+PrimPol.">Molecular dissection of the domain architecture and catalytic activities of human PrimPol.</a> Nucleic Acids Research. 42 (9), 5830-5845 (2014).</li><li>Tirman, S., Cybulla, E., Quinet, A., Meroni, A., Vindigni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRIMPOL+ready,+set,+reprime.">PRIMPOL ready, set, reprime.</a> Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 56 (1), 17-30 (2021).</li><li>Quinet, A., Lerner, L. K., Martins, D. J., Menck, C. F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filling+gaps+in+translesion+DNA+synthesis+in+human+cells.">Filling gaps in translesion DNA synthesis in human cells.</a> Mutation Research, Genetic Toxicology Environmental Mutagenesis. 836, 127-142 (2018).</li><li>Ziv, O., Diamant, N., Shachar, S., Hendel, A., Livneh, Z., Bjergb&#230;k, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+measurement+of+translesion+DNA+synthesis+in+mammalian+cells.">Quantitative measurement of translesion DNA synthesis in mammalian cells.</a> DNA Repair Protocols. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). 920, (2012).</li><li>Quinet, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translesion+synthesis+mechanisms+depend+on+the+nature+of+DNA+damage+in+UV-irradiated+human+cells.">Translesion synthesis mechanisms depend on the nature of DNA damage in UV-irradiated human cells.</a> Nucleic Acids Research. 44 (12), 5717-5731 (2016).</li><li>T&#233;cher, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+dynamics:+biases+and+robustness+of+DNA+fiber+analysis.">Replication dynamics: biases and robustness of DNA fiber analysis.</a> Journal of Molecular Biology. 425 (23), 4845-4855 (2013).</li><li>Quinet, A., Carvajal-Maldonado, D., Lemacon, D., Vindigni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+fiber+analysis:+Mind+the+gap.">DNA fiber analysis: Mind the gap.</a> Methods in Enzymology. 591, 55-82 (2017).</li><li>Elvers, I., Johansson, F., Groth, P., Erixon, K., Helleday, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UV+stalled+replication+forks+restart+by+re-priming+in+human+fibroblasts.">UV stalled replication forks restart by re-priming in human fibroblasts.</a> Nucleic Acids Research. 39 (16), 7049-7057 (2011).</li><li>Diamant, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+bypass+operates+in+the+S+and+G2+phases+of+the+cell+cycle+and+exhibits+differential+mutagenicity.">DNA damage bypass operates in the S and G2 phases of the cell cycle and exhibits differential mutagenicity.</a> Nucleic Acids Research. 40 (1), 170-180 (2012).</li><li>Temviriyanukul, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporally+distinct+translesion+synthesis+pathways+for+ultraviolet+light-induced+photoproducts+in+the+mammalian+genome.">Temporally distinct translesion synthesis pathways for ultraviolet light-induced photoproducts in the mammalian genome.</a> DNA Repair. 11 (6), 550-558 (2012).</li><li>Jansen, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redundancy+of+mammalian+Y+family+DNA+polymerases+in+cellular+responses+to+genomic+DNA+lesions+induced+by+ultraviolet+light.">Redundancy of mammalian Y family DNA polymerases in cellular responses to genomic DNA lesions induced by ultraviolet light.</a> Nucleic Acids Research. 42 (17), 11071 (2014).</li><li>Quinet, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap-filling+and+bypass+at+the+replication+fork+are+both+active+mechanisms+for+tolerance+of+low-dose+ultraviolet-induced+DNA+damage+in+the+human+genome.">Gap-filling and bypass at the replication fork are both active mechanisms for tolerance of low-dose ultraviolet-induced DNA damage in the human genome.</a> DNA Repair. 14 (1), 27-38 (2014).</li><li>Callegari, A. J., Clark, E., Pneuman, A., Kelly, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postreplication+gaps+at+UV+lesions+are+signals+for+checkpoint+activation.">Postreplication gaps at UV lesions are signals for checkpoint activation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (18), 8219-8224 (2010).</li><li>Vogt, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+further+properties+of+single-strand-specific+nuclease+from+Aspergillus+oryzae.">Purification and further properties of single-strand-specific nuclease from Aspergillus oryzae.</a> European Journal of Biochemistry. 33 (1), 192-200 (1973).</li><li>Cordeiro-Stone, M., Schumacher, R. I., Meneghini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+replication+fork+in+ultraviolet+light-irradiated+human+cells.">Structure of the replication fork in ultraviolet light-irradiated human cells.</a> Biophysical Journal. 27 (2), 287-300 (1979).</li><li>Lehmann, A. R., Fuchs, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gaps+and+forks+in+DNA+replication:+Rediscovering+old+models.">Gaps and forks in DNA replication: Rediscovering old models.</a> DNA Repair (Amst). 5 (12), 1495-1498 (2006).</li><li>Daigaku, Y., Davies, A. A., Ulrich, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin-dependent+DNA+damage+bypass+is+separable+from+genome+replication.">Ubiquitin-dependent DNA damage bypass is separable from genome replication.</a> Nature. 465 (7300), 951-955 (2010).</li><li>Karras, G. I., Jentsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RAD6+DNA+damage+tolerance+pathway+operates+uncoupled+from+the+replication+fork+and+is+functional+beyond+S+phase.">The RAD6 DNA damage tolerance pathway operates uncoupled from the replication fork and is functional beyond S phase.</a> Cell. 141 (2), 255-267 (2010).</li><li>Tirman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporally+distinct+post-replicative+repair+mechanisms+fill+PRIMPOL-dependent+ssDNA+gaps+in+human+cells.">Temporally distinct post-replicative repair mechanisms fill PRIMPOL-dependent ssDNA gaps in human cells.</a> Molecular Cell. 81 (19), 4026-4040 (2021).</li><li>Cong, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+gaps+are+a+key+determinant+of+PARP+inhibitor+synthetic+lethality+with+BRCA+deficiency.">Replication gaps are a key determinant of PARP inhibitor synthetic lethality with BRCA deficiency.</a> Molecular Cell. 81 (15), 3128-3144 (2021).</li><li>Quinet, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRIMPOL-mediated+adaptive+response+suppresses+replication+fork+reversal+in+BRCA-deficient+cells.">PRIMPOL-mediated adaptive response suppresses replication fork reversal in BRCA-deficient cells.</a> Molecular Cell. 77 (3), 461-474 (2020).</li><li>Jackson, D. A., Pombo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replicon+clusters+are+stable+units+of+chromosome+structure:+evidence+that+nuclear+organization+contributes+to+the+efficient+activation+and+propagation+of+S+phase+in+human+cells.">Replicon clusters are stable units of chromosome structure: evidence that nuclear organization contributes to the efficient activation and propagation of S phase in human cells.</a> The Journal of Cell Biology. 140 (6), 1285-1295 (1998).</li><li>Schwab, R. A., Niedzwiedz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+DNA+replication+in+the+vertebrate+model+system+DT40+using+the+DNA+fiber+technique.">Visualization of DNA replication in the vertebrate model system DT40 using the DNA fiber technique.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (56), e3255 (2011).</li><li>Simoneau, A., Xiong, R., Zou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+trans+cell+cycle+effects+of+PARP+inhibitors+underlie+their+selectivity+toward+BRCA1/2-deficient+cells.">The trans cell cycle effects of PARP inhibitors underlie their selectivity toward BRCA1/2-deficient cells.</a> Genes &amp; Development. 35 (17-18), 1271-1289 (2021).</li><li>Taglialatela, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=REV1-Pol&#950;+maintains+the+viability+of+homologous+recombination-deficient+cancer+cells+through+mutagenic+repair+of+PRIMPOL-dependent+ssDNA+gaps.">REV1-Pol&#950; maintains the viability of homologous recombination-deficient cancer cells through mutagenic repair of PRIMPOL-dependent ssDNA gaps.</a> Molecular Cell. 81 (19), 4008-4025 (2021).</li><li>Lim, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=USP1+Is+required+for+replication+fork+protection+in+BRCA1-deficient+tumors.">USP1 Is required for replication fork protection in BRCA1-deficient tumors.</a> Molecular Cell. 72 (6), 925-941 (2018).</li><li>Peng, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposing+roles+of+FANCJ+and+HLTF+protect+forks+and+restrain+replication+during+stress.">Opposing roles of FANCJ and HLTF protect forks and restrain replication during stress.</a> Cell Reports. 24 (12), 3251-3261 (2018).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA+translocase+FANCM/MHF+promotes+replication+traverse+of+DNA+interstrand+crosslinks.">The DNA translocase FANCM/MHF promotes replication traverse of DNA interstrand crosslinks.</a> Molecular Cell. 52 (3), 434-446 (2013).</li><li>Ding, W., Bishop, M. E., Lyn-Cook, L. E., Davis, K. J., Manjanatha, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+alkaline+comet+assay+and+enzyme-modified+alkaline+comet+assay+for+measuring+DNA+strand+breaks+and+oxidative+DNA+damage+in+rat+liver.">In vivo alkaline comet assay and enzyme-modified alkaline comet assay for measuring DNA strand breaks and oxidative DNA damage in rat liver.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (111), e53833 (2016).</li><li>Lu, Y., Liu, Y., Yang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+in+vitro+DNA+damage+using+comet+assay.">Evaluating in vitro DNA damage using comet assay.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (128), e56450 (2017).</li></ol>

Standart DNA lif tahlil protokolünün kritik adımları önceki bir yayında tartışıldı32. Burada, post-replikatif ssDNA boşluklarının varlığını araştırmak için standart DNA lif testinin modifiye edilmiş versiyonlarını ve başlangıçta14'te tarif edilen boşluk doldurma ile onarımlarını açıklıyoruz. Post-replikatif ssDNA boşluğu varlığı bağlamında, S1 Fiber protokolünde S1 nükleazın kullanılması, büyük olasılıkla, boşluk oluşumu ve...

Seminal çalışmalar, bakteri1 ve insan hücrelerinde DNA'ya zarar veren ajanlarla tedavi üzerine post-replikatif tek sarmallı (ssDNA) boşlukların biriktiğine dair kanıtlar sağlamıştır 2,3. Hasarlı DNA şablonlarının replikasyonu sırasında, DNA sentez makinesi, spesifik translezyon sentezi DNA polimerazları kullanarak veya şablon anahtarlama mekanizmaları yoluyla lezyonları atlayabilir. Alternatif olarak, replizom daha sonra onarılmak üzere geride bir ssDNA boşluğu bırakarak lezyonu atlayabilir. Daha yakın zamanlarda, bir çalışma, genotoksik ajanlarla tedavinin, replikasyon ara ürünlerinin spesifik yapısını görselleştirmek için elektron mikroskobu kullanılarak ökaryotlarda ssDNA boşluklarına yol açtığını açıkça göstermiştir4. Post-replikatif boşlukların bu bölgelerinin oluşumunun başlangıçta DNA replikasyonu2'nin yarı-süreksiz modunun basit bir sonucu olduğu öne sürüldü. Bu durumda, geciken iplikçik üzerindeki bir lezyon bir Okazaki parçasının uzamasını engelleyebilir, ancak çatal ilerlemesi doğal olarak bir ssDNA boşluğunun arkasında kalan aşağıdaki Okazaki parçası tarafından kurtarılır. Bununla birlikte, daha ileri çalışmalar, ilk olarak bakteri5'te gösterildiği gibi, öncü iplikçik üzerinde boşluk oluşumunun da mümkün olduğunu göstermiştir. Ökaryotlarda, primaz aktivitesine sahip benzersiz bir DNA polimeraz olan PRIMPOL'ün, azarlama aktivitesi 6,7,8,9,10,11 yoluyla bir replikasyon bloke edici lezyonun DNA sentezini yeniden başlatabildiği gösterilmiştir. Bu nedenle, PRIMPOL primaz aktivitesi, insan hücrelerinde DNA'ya zarar veren bir ajanla tedavi edildiğinde önde gelen iplikçikte post-replikatif ssDNA boşluklarının oluşumunu açıklayabilir12. Bununla birlikte, bu boşlukların tespiti ve boşluk onarımı, yakın zamana kadar, elektron mikroskobu4 veya plazmid bazlı tahliller13 gibi dolaylı veya zaman alıcı yaklaşımlar gerektiriyordu. İnsan hücrelerindeki boşlukları tespit etmek için ssDNA'ya özgü S1 nükleazın kullanılması, kırk yıldan daha uzun bir süre önce, sakkaroz gradyan teknikleri 2,3 kullanılarak yapılan erken çalışmalarla öncülük etmiştir. Daha yakın zamanlarda, grubumuz DNA lifi ve kuyruklu yıldız tahlilleri14 gibi diğer yöntemleri kullanarak DNA'nın kopyalanmasında (post-replikatif boşluklar) ssDNA'yı tespit etmek için bu nükleazın kullanımını uyguladı. Bu yeni yaklaşımlar, replikatif sonrası boşluklar üzerine yapılan çalışmaların mevcut artışının yolunu açtı. Burada, DNA fiber testi ile replikatif ssDNA boşluklarını tespit etmek için S1 nükleaz kullanma stratejisini açıklıyoruz ve DNA fiber protokolündeki bir diferansiyel etiketleme şemasının bu boşlukların onarımının incelenmesine nasıl izin verebileceğini açıklıyoruz.
DNA lifi testi, giderek artan sayıda laboratuvar tarafından kullanılan ve replikasyon çatalı dinamikleri ve replikasyon stres tepki mekanizmaları hakkında değerli bilgiler sağlayan güçlü bir tekniktir. Kısaca, bu teknik, nükleotid analoglarının (CldU -5-kloro-2'-deoksiüridin- ve IdU -5-iyodo-2'-deoksiüridin gibi) replikasyon DNA'sına sıralı olarak dahil edilmesine dayanmaktadır. Hasattan sonra, hücreler lize edilir ve DNA molekülleri pozitif kaplı bir cam slayt üzerine yayılır. CldU ve IdU daha sonra floresan mikroskopta iki renkli lifler olarak görselleştirilebilen spesifik antikorlar tarafından tespit edilir. Son olarak, IdU ve CldU yollarının uzunlukları, DNA hasarı indüksiyonunun bir sonucu olarak DNA replikasyon dinamiklerindeki herhangi bir değişikliği tanımlamak için ölçülür. Bu teknik, çatal durma, çatal yavaşlama, yeni ortaya çıkan DNA bozulması ve15,16 orijin ateşleme sıklığındaki değişiklikler gibi farklı fenomenleri araştırmak için kullanılabilir.
DNA lifi testinin bir sınırlaması, birkaç kilobazın çözünürlüğüdür. Post-replikatif ssDNA boşlukları yüzlerce baz aralığında olabileceğinden, bu boşlukları doğrudan standart DNA fiber protokolü ile görselleştirmek imkansızdır. Genotoksik ajanlarla tedavi edilen insan hücrelerinde DNA'nın kopyalanmasında ssDNA boşluklarının varlığı daha önce dolaylı olarak ortaya çıkmıştır. Örneğin, ssDNA bağlayıcı proteinin, replikasyon proteini A'nın (RPA) S fazı dışındaki hücrelerde işe alınması veya alkali DNA çözülmesi ile tespit edilen ssDNA oluşumunun DNA lifi testi ile uzun süreli çatal durdurma yokluğu ile birlikte değerlendirildiği gibi ssDNA'nın gözlemlenmesi 12,17,18,19,20,21 ssDNA boşluklarının birikmesine bağlanmıştır. Ek olarak, post-replikatif ssDNA boşlukları, ATR'ye bağımlı bir G2 / M faz kontrol noktasını indükler ve replikasyon zehirleri 18,19,20,21,22 ile muamele edilmiş hücreleri durdurur.
S1 nükleaz, 5'-fosforil mono- veya oligonükleotidleri serbest bırakan tek sarmallı nükleik asitleri bozar ve RNA'ya kıyasla ssDNA'ya 5 kat daha yüksek bir afiniteye sahiptir. Çift sarmallı nükleik asitler (DNA: DNA, DNA: RNA veya RNA: RNA), aşırı yüksek konsantrasyonlarda kullanıldığı durumlar dışında S1 nükleazına karşı dirençlidir. S1 nükleazı ayrıca bir çentik, boşluk, uyumsuzluk veya döngünün neden olduğu tek sarmallı bölgede çift sarmallı DNA'yı parçalar. Bu nedenle S1 nükleazı, ssDNA boşluklarını parçalayabilen ve sonuçta çift sarmallı kırılmalar üretebilen ssDNA'ya özgü bir endonükleazdır23,24. Böylece, DNA fiber protokolüne S1 nükleaz sindirimi için adımlar eklenmesi, dolaylı olarak replikatif sonrası ssDNA boşluklarının tespit edilmesini sağlar. Boşlukların varlığında, DNA yayılmadan önce maruz kalan çekirdeklerin S1 nükleazı ile muamele edilmesi, doğal olarak boşluk14'te bulunan ssDNA'nın S1 bölünmesinin bir sonucu olarak daha kısa yollar üretecektir. Buna göre, yol kısaltması, bu yaklaşımı kullanarak ssDNA boşlukları için okumadır. Standart DNA lif protokolü ile karşılaştırıldığında, S1 nükleaz içeren DNA lifi sadece iki ekstra adım gerektirir: çekirdeklere maruz kalma (hücre geçirgenliği) ve S1 nükleaz ile tedavi. Genotoksik ajanla tedavi edilen ancak S1 nükleazı olmayan örnekler ve genotoksik ajan olmadan S1 nükleazı ile muamele edilen örnekler gibi uygun kontrollerin zorunlu olduğunu belirtmek önemlidir. Analogların dahil edilmesi, S1 tedavisi ve yayılması da dahil olmak üzere protokolün kendisi bir günde gerçekleştirilebilir ve istisnai malzeme gerektirmez. Sadece timidin analogları, saflaştırılmış S1 nükleaz, uygun birincil ve ikincil antikorlar ve bir floresan mikroskop gerektirir. Genel olarak, S1 nükleazını kullanan DNA lifi, nispeten basit bir yaklaşım kullanarak devam eden replikasyon çatallarındaki ssDNA boşluklarını tespit eder.
Replikasyon stres tepki mekanizmalarının bir sonucu olarak oluşan post-replikatif ssDNA boşlukları, boşluk doldurma veya replikasyon sonrası onarım (PRR) adı verilen bir süreçte, translezyon DNA sentezi veya şablon değiştirme dahil olmak üzere farklı mekanizmalarla onarılabilir (veya doldurulabilir)25. Bu süreçler, replikasyondan bağımsız DNA sentezi14,26,27'yi içeren ilerleyen çatalların arkasında gerçekleşir. Bu bulgulara dayanarak, G2 fazındaki boşluk doldurma olaylarını doğrudan14,16,26,28 görselleştirmek için standart DNA lif testinden farklı bir etiketleme şeması gerçekleştirilebilir. Spesifik olarak, bir timidin analoğu, genotoksik tedavi ve replikatif sonrası ssDNA boşluk oluşumu sırasında replikasyon çatalını etiketlemek için kullanılabilirken, başka bir timidin analoğu boşluk doldurma olaylarını etiketlemek için kullanılabilir. Bu protokolde, hücreler 1 saat boyunca genotoksik tedaviden hemen sonra veya eşzamanlı olarak ilk timidin analoğu (örneğin IdU) ile etiketlenir, böylece ortaya çıkan DNA boşluk oluşumu sırasında etiketlenir. Nokodazol, G2 / M'deki hücreleri tutuklamak için 12-24 saat arasında herhangi bir yerde tedaviye eklenir ve aşağıdaki S fazını önler. Nokodazol tedavisinin son 4 saati için, boşluk doldurma sırasında dahil edilecek ortama ikinci bir timidin analoğu (örneğin CldU) eklenir. Daha da önemlisi, bu tahlil sadece G2'deki boşluk doldurma olaylarını tespit etmek için kullanılabilir, çünkü CldU'dan gelen boşluk doldurma sinyali, CldU'nun S fazında DNA'yı çoğaltmaya dahil olması nedeniyle bir sinyalden ayırt edilemez. Bu nedenle, arka plan sinyalini en aza indirmek için, hasar indüksiyonundan sonra CldU birleşmesinin zamanlaması, hücre popülasyonunun çoğunun G2 faz14'e girdiği zamana denk gelmelidir. Bu nedenle, bu zamanlama hücre hattına ve tedavi koşullarına bağlı olarak değişecektir. Bu tahlili kullanmadan önce hücre döngüsü ilerlemesini optimize etmeniz önerilir. Bu timidin analoglarının birlikte boyanması, ssDNA boşlukları oluşturulduğunda genotoksik tedavi sırasında sentezlenen yeni ortaya çıkan DNA'nın (IdU yolları) üstünde boşluk doldurma (PRR) yollarının (CldU yamaları) görselleştirilmesine izin verir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid, Glacial</td>
			<td>Synth</td>
			<td>64-19-7</td>
			<td>Alternatively, BSA - Biosera - REF PM-T1725/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium hydroxide</td>
			<td>Synth</td>
			<td>1336-21-6</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody anti-mouse IgG1 Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11005</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody anti-rat Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21470</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody Mouse anti-BrdU</td>
			<td>Becton Disckson</td>
			<td>347580</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody Rat anti-BrdU</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>&#160;Ab6326</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological security hood</td>
			<td>Pachane</td>
			<td>PA 410</td>
			<td>Use hood present in the laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (Bovine Serum Albumin)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3294</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>179693</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CldU</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>C6891</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cloridric acid</td>
			<td>Synth</td>
			<td>7647-01-0</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Zeiss LSM Series (7, 8 or 9)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass (or coverslips)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>152460</td>
			<td>Alternatively, Olen - Kasvi Cover Glass (24 x 60 mm) - K5-2460</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM - High Glucose</td>
			<td>LGC/Gibco</td>
			<td>BR30211-05/12100046</td>
			<td>Use culture media specific for the cell line used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E5314</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence Microscope Axiovert 200</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12657-029</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forma Series II Water Jacketed CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific 3110</td>
			<td>13-998-074</td>
			<td>Use cell incubator present in the laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide jar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5516</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Idu</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>I7125</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Synth</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>67-56-1</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Denville</td>
			<td>M1021</td>
			<td>Alternatively, Olen - Kasvi Microscope Slides - K5-7105 OR Precision Glass Line - 7105-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS (&#193;cido 3-morfolinopropano 1-sulf&#244;nico)</td>
			<td>Synth</td>
			<td>1132-61-2</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nocodazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31430-18-9</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate Buffer Saline)</td>
			<td>Life Thechnologies</td>
			<td>3002</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold AntiFade Mountant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36930</td>
			<td>Any antifade moutant solution for immunofluorescence could be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S1 nuclease purified from Aspergillus oryzae</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18001-016</td>
			<td>Pre-dilute the S1 nuclease (1/100 - 1/200) in S1 nuclease dilution buffer provided by the manufacturer, aliquote and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0302</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate Trihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>6131-90-4</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Synth</td>
			<td>&#160;7647-14-5</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>57-50-1</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>West Lab Research</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Synth</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200072</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UVC Lamp</td>
			<td>Non Specific</td>
			<td>-</td>
			<td>Essential: emission lenght of 254 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VLX-3W UV Radiometer</td>
			<td>Vilber Loumart</td>
			<td>-</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>557-34-6</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of post-replicative gaps accumulation and repair in human cells using the dna fiber assay

DNA lifi testi, insan hücrelerinde DNA sentezi sırasında dahil edilen nükleotid analoglarının immüno-tespitine dayanan replikasyon çatal dinamiklerinin analizi için basit ve sağlam bir yöntemdir. Bununla birlikte, bu teknik birkaç bin kilobazlık sınırlı bir çözünürlüğe sahiptir. Sonuç olarak, birkaç yüz baz kadar küçük replikatif tek sarmallı DNA (ssDNA) boşlukları standart tahlil ile tespit edilemez. Burada, özellikle ssDNA'yı parçalayan bir enzim olan S1 nükleazını kullanan DNA lifi testinin modifiye edilmiş bir versiyonunu açıklıyoruz. Post-replikatif ssDNA boşluklarının varlığında, S1 nükleazı boşlukları hedefleyecek ve parçalayacak ve devam eden çatallardaki ssDNA boşlukları için bir okuma olarak kullanılabilecek daha kısa yollar üretecektir. Bu post-replikatif ssDNA boşlukları, hasarlı DNA süreksiz olarak çoğaltıldığında oluşur. Genom replikasyonundan ayrılan mekanizmalarla, boşluk doldurma veya replikatif onarım sonrası onarım olarak bilinen bir süreçte onarılabilirler. Boşluk doldurma mekanizmaları S fazından bağımsız DNA sentezini içerdiğinden, DNA lifi etiketleme şemasındaki değişiklikler de boşluk doldurma olaylarını izlemek için kullanılabilir. Toplamda, DNA lifi testinin bu modifikasyonları, insan hücrelerinin genomunda replikatif sonrası boşlukların nasıl oluştuğunu ve doldurulduğunu anlamak için güçlü stratejilerdir.

S1 Fiber testinde, genotoksik bir ajanla yapılan tedavi, replikatif ssDNA boşluklarına yol açarsa, S1 ile tedavi edilen çekirdeklerden elde edilen DNA liflerinin toplam uzunlukları, DNA hasarı ile tedavi edildiğinde, tedavi edilmemiş örneklere ve genotoksik ajanla tedavi edilen ancak S1 bölünmesine sunulmayan örneklere kıyasla daha kısa olacaktır (Şekil 1).
Alternatif olarak, S1 nükleaz ile tedavi, tedavi edilmemiş hücrelere kıyasla DNA lifler...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Post-Replicative Gaps Accumulation and Repair in Human Cells Using the DNA Fiber Assay at JoVE.com

Detection of Post-Replicative Gaps Accumulation and Repair in Human Cells Using the DNA Fiber Assay

Burada, lezyon indüksiyonundan sonra DNA'nın kopyalanmasında tek sarmallı DNA boşluklarını araştırmak için DNA lif testinin iki modifikasyonunu açıklıyoruz. S1 fiber testi, ssDNA'ya özgü S1 endonükleazı kullanarak replikatif sonrası boşlukların tespit edilmesini sağlarken, boşluk doldurma testi, boşluk onarımının görselleştirilmesine ve nicelleştirilmesine izin verir.

DNA Fiber Testi Kullanılarak İnsan Hücrelerinde Replikasyon Sonrası Boşlukların Birikmesi ve Onarımının Tespiti

The DNA fiber assay is a simple and robust method for the analysis of replication fork dynamics, based on the immunodetection of nucleotide analogs that ...

Protokolümüz, hasarlı DNA'da replikasyonun nasıl gerçekleştiğini araştırmak için yeni olanaklar sunar. Teknikler, DNA lezyonunun karşısındaki tek sarmallı DNA boşluklarının oluşumunu ve onarımını tespit edebilir. S1 nükleaz, tek sarmallı DNA'yı parçalara ayırır ve replikatif sonrası boşlukların tespit edilmesini sağlar.Bu yaklaşım ilk olarak 1970'lerde Brezilya'da Dr. Meneghini ve Dr. Cordiero-Stone tarafından kullanılmış ve yakın zamanda DNA lifi testine uyarlanmıştır. Post-replikatif boşlukların oluşumunu ve onarımını incelemek için burada açıklanan tekniği kullanmak, genom bütünlüğünü koruyan DNA onarımı ve replikasyon stres tepkisinin mekanizması hakkında fikir verebilir. Burada açıklanan her iki protokol için, S1 fiber ve boşluk doldurma tahlilleri, Verilerin doğru yorumlanmasını sağlamak için tüm kontrolleri dahil etmek çok önemlidir.Prosedür, laboratuvarımızdan doktora öğrencisi olan Davi J.Martins ve grubumuzda çalışırken daha önce bu teknikleri geliştiren bir işbirlikçi olan Dr. Annabel Quinet tarafından gösterilecektir. Başlangıç olarak, kültür ortamını aspire edin ve hemen hücrelere 20 mikromolar IDU ortamı içeren kültür ortamını ekleyin. Hücreleri tam olarak 20 dakika boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin.Daha sonra, hücreleri önceden ısıtılmış PBS ile iki kez hızlı bir şekilde yıkayın ve metre kare UV-C başına 20 joule ışınlayın. Tedavi edilmemiş hücreleri denetim olarak kullanın. Hemen 200 mikromolar CldU içeren medyayı hücrelere ekleyin ve bunları tam olarak 60 dakika boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin.Bundan sonra, hücreleri önceden ısıtılmış PBS ile iki kez yıkayın ve oda sıcaklığındaki hücre hattına göre iki ila 10 dakika boyunca CSK 100 tamponu ile geçirgenleştirin. CSK geçirgenliğinden sonra, neredeyse hiç sitoplazması olmayan çekirdekler, geçirgenlikten öncekilere kıyasla görülebilir. Çekirdekleri PBS ile yıkamak için PBS'yi her bir kuyucuğun kenarından dikkatlice dökün.Ardından, çekirdekleri S1 tamponu ile yıkayın. S1 tamponundaki çekirdekleri mililitre S1 nükleaz başına 20 ünite ile ve S1 nükleaz olmadan, 37 santigrat derecede 30 dakika boyunca inkübe edin. Ardından, S1 arabelleğini aspire edin ve PBS'ye %0,1 BSA ekleyin.Çekirdekleri kazıyın ve yaklaşık açıklamalı 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Tüpleri her zaman buz üzerinde tutun. Çekirdekleri dört santigrat derecede beş dakika boyunca yaklaşık 4.600 kez G'de santrifüj yapın.PBS'deki peletleri mikrolitre başına yaklaşık 1.500 hücre konsantrasyonunda yeniden askıya alın. Tüpleri buz üzerine yerleştirin ve hemen yayılma protokolü ile DNA lifi hazırlığına geçin. Mikroskop slaytlarına bir karbon kalemle açıklama ekleyin ve bunları bir tepsiye düz bir şekilde yerleştirin.Homojenizasyonu sağlamak için tüpün altına dokunun ve ilgili kızağın üstüne iki mikrolitre hücre ekleyin. Lizis tamponunun altı mikrolitresini ekleyin ve hücreleri yaklaşık beş kez yukarı ve aşağı pipetleyerek lize edin. Pipet ucunu kullanarak damlayı sürgünün dibine doğru hafifçe çekin ve çekirdekleri lize etmek için oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya yatırın.Slaytı yaklaşık 20 ila 40 derece eğin ve damlanın sabit bir düşük hızda slaytın dibine yayılmasına izin verin. Slaytın karanlıkta oda sıcaklığında 10 ila 15 dakika kurumasını bekleyin. Ardından, taze hazırlanmış sabitleme çözeltisini içeren bir kavanoza batırın ve DNA'yı slaytlara sabitlemek için oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin.Slaytları beş dakika boyunca PBS ile iki kez yıkayın ve DNA'yı oda sıcaklığında 40 ila 60 dakika boyunca taze hazırlanmış 2.5 azı dişi kloridik asit ile denatüre edin. Slaytları beş dakika boyunca PBS ile üç kez yıkayın ve daha önce 37 santigrat derecede 30 ila 60 dakika ısıtılmış% 5 BSA ile bloke edin. Slaytlardaki fazla sıvıyı çıkarmak için kağıda hafifçe dokunun.Slaytlara damla damla 30 mikrolitre birincil antikor ekleyin ve üstüne bir kapak kayması yerleştirin. Karanlık, nemli bir odada oda sıcaklığında 1 ila 1,5 saat kuluçkaya yatırın. Slaytları PBS'li bir kavanoza bir ila iki dakika boyunca yerleştirin ve ardından kapak fişlerini dikkatlice çıkarın.PBST ile beş dakika boyunca üç kez bir kavanozda yıkayın ve slaytları PBS'ye yerleştirin. Bir kağıda hafifçe dokunarak fazla sıvıyı çıkarın ve slaytlara damla damla 30 mikrolitre ikincil antikor ekleyin. Üstüne bir kapak kayması yerleştirin.Karanlık ve nemli bir odada oda sıcaklığında 45 ila 60 dakika kuluçkaya yatırın. Slaytları yıkamak ve fazla PBS'yi çıkarmak için adımları bir kez daha tekrarlayın ve kızaklara damla damla 20 mikrolitre montaj reaktifi ekleyin. Üstüne bir kapak kayması yerleştirin ve kabarcıklardan kaçının.Hücrelerin lize edildiği slaytın üst kısmına bir damla daldırma yağı yerleştirin. Yeşil kanalı kullanın ve odağı bulmak için arka plandaki yeşil noktaları arayın. Leica Application Suite yazılımını açın, Al'a tıklayın ve yeşil kanalı seçin.Analizden önce yeşil kanalın ayarlarını yapın. Ardından, kırmızı kanala geçin ve ayarları yapın. Ana lif konsantrasyonunu bulun ve iyi yayılmış, üst üste binmeyen, bireysel lifleri bulmak için kenarlara doğru hareket edin.Resimlerin bölgelerini seçmek ve olası önyargılardan kaçınmak için yalnızca bir kanal kullanın. Bindirme Al simgesine tıklayın ve yazılımı doğru mikroskop büyütmesi için ayarlayın. Yeşil kanalda ve ardından kırmızı kanalda slaytın tamamının yanında slayt başına yaklaşık 15 ila 20 resim çekin.İki kanal artık birleştirilir ve oluşturulan kaplama benzersiz bir klasöre taşınır. Lifleri kırmızı ve yeşil renklerle görmek mümkündür. ImageJ yazılımını açın, beşinci simgeye sol tıklayın, ikinci seçeneği seçin ve ardından Segmentlere Ayrılmış Çizgi aracını seçin.Kırmızı veya yeşil yolun tam yolunu çizmek için sol tıklayın ve çizimi durdurmak için sağ tıklayın. Uzunluğu ölçmek için klavyedeki M düğmesine basın. S1 elyafı için, her bir elyaf için kırmızı ve yeşil yol ölçümlerini takip edin ve farklı resimlerden en az 150 fiberden kırmızı ve yeşil yol uzunluklarını ölçün.Bu temsili görüntülerde bir S1 fiber gösterilmektedir. Kontrol-yeni ortaya çıkan DNA yolu boşluksuz ve S1 nükleaz tarafından bölünmeye karşı geçirimsiz burada gösterilmiştir. S1 nükleazı tarafından parçalanan boşluklar için pozitif DNA yolu, daha kısa bir CldU yolu uzunluğu ile sonuçlandı.Metin makalesinde kapsamlı bir şekilde açıklanan diferansiyel etiketleme şeması, boşluk doldurma olaylarını etiketlemek için gerçekleştirilebilir. Boşluk doldurma testi olarak adlandırılan bu tahlilde, en az bir CldU yaması veya daha az CldU yaması içeren daha uzun IDU izleri, düşük boşluk doldurma yoğunluğuna karşılık gelir. En az bir CldU yaması ile daha kısa IDU yolları ve daha fazla CldU yaması olan daha uzun IDU yolları, yüksek boşluk doldurma yoğunluğuna karşılık gelir.Bu protokolün geçirgenleştirme adımı, S1 nükleazın hasarlı DNA'nın replikasyonu sırasında oluşan boşluklar üzerinde hareket etmesi için çok önemlidir. S1 nükleazı, tedaviden sonra devam eden hasarlı DNA'nın replikasyonu sırasında oluşan boşlukları tespit etmek için kuyruklu yıldız testi protokolünde de kullanılabilir. S1 lif testi, replikatif sonrası boşlukların, özellikle BRCA1 ve 2 genlerinde mutasyon taşıyan meme ve yumurtalık kanserlerinde kanser kırılganlığına neden olabileceği yeni paradigmasının yolunu açtı.

Research

JoVE Journal

Genetics

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Tek Hücre sıralama kullanarak Kopya sayısı Değişmeler Algılama

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Atomic Force Microscopy Investigations of DNA Lesion Recognition in Nucleotide Excision Repair

Nükleotid Eksizyon Onarımında DNA Lezyon Tanınması için Atomik Kuvvet Mikroskopi Araştırmaları

AFM imaging is a powerful technique for the study of protein-DNA interactions. This single molecule method allows the simultaneous resolution of different ...

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

DNA değişiklikler için Immunostaining: Confocal görüntülerin sayısal analiz

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Fare ve insan hematopoetik progenitör hücre tarafından CRISPR/Cas9 yüksek verimli Gene bozulma

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

A Simple, Rapid, and Quantitative Assay to Measure Repair of DNA-protein Crosslinks on Plasmids Transfected into Mammalian Cells

Ölçü birimi üzerinde plazmid DNA-protein Glossar tamiri için basit, hızlı ve nicel tahlil memeli hücre içine Transfected

The purpose of this method is to provide a flexible, rapid, and quantitative technique to examine the kinetics of DNA-protein crosslink (DPC) repair in ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Nadiren de olsa algılama hatası düzeltildi DNA ve RNA sıralama

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Mitokondrial DNA metilasyonu doğru algılanması için metodoloji

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

ATAC-seq Assay with Low Mitochondrial DNA Contamination from Primary Human CD4+ T Lymphocytes

ATAÇ-seq tahlil birincil insan CD4 + T lenfositleri kirlenme düşük mitokondrial DNA ile

ATAC-seq has become a widely used methodology in the study of epigenetics due to its rapid and simple approach to mapping genome-wide accessible ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay Using Micrococcal Nucleases in Mammalian Cells

Mammalin hücrelerinde Micrococcal Nüklenleri kullanarak kromatin Immünopmamitasyon tahlil

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene ...

Use of Frozen Tissue in the Comet Assay for the Evaluation of DNA Damage

DNA Hasarının Değerlendirilmesinde Kuyruklu Yıldız Testinde Donmuş Dokunun Kullanımı

The comet assay is gaining popularity as a means to assess DNA damage in cultured cells and tissues, particularly following exposure to chemicals or other ...