Detta arbete stöddes av Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) genom följande bidrag: infraestructura 226450 till VP-CIO, infraestructura 255277 till V.P. och FORDECYT-PRONACES/194171/2020 till V.H. Vi erkänner stödet från Juvenal Hernández Guevara på CIO i videoskapandet.

Alla beskrivna förfaranden gjordes i enlighet med de lagar och koder som godkänts i den sjunde titeln i förordningen om den allmänna hälsolagen om hälsoforskning från den mexikanska regeringen (NOM-062-ZOO-1999) och i enlighet med rekommendationerna från National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Experimental Animals och godkändes av den institutionella kommittén för bioetik i forskning vid Universidad de Guanajuato och Benemérita Universidad Autónoma de Puebla.
<s...

<ol>
	<li>Palmiter, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lineage+ablation+in+transgenic+mice+by+cell-specific+expression+of+a+toxin+gene.">Cell lineage ablation in transgenic mice by cell-specific expression of a toxin gene.</a> Cell. 50 (3), 435-443 (1987).</li><li>Banerjee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+monoclonal+antibody+against+the+type+II+isotype+of+beta-tubulin.+Preparation+of+isotypically+altered+tubulin.">A monoclonal antibody against the type II isotype of beta-tubulin. Preparation of isotypically altered tubulin.</a> The Journal of Biological Chemistry. 263 (6), 3029-3034 (1988).</li><li>Banerjee, A., Roach, M. C., Trcka, P., Luduena, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+a+monoclonal+antibody+specific+for+the+class+IV+isotype+of+beta-tubulin.+Purification+and+assembly+of+alpha+beta+II,+alpha+beta+III,+and+alpha+beta+IV+tubulin+dimers+from+bovine+brain.">Preparation of a monoclonal antibody specific for the class IV isotype of beta-tubulin. Purification and assembly of alpha beta II, alpha beta III, and alpha beta IV tubulin dimers from bovine brain.</a> The Journal of Biological Chemistry. 267 (8), 5625-5630 (1992).</li><li>Banerjee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+&#946;v+tubulin+in+the+cochlea+and+cultured+cells+with+a+novel+monoclonal+antibody.">Localization of &#946;v tubulin in the cochlea and cultured cells with a novel monoclonal antibody.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 65 (6), 505-514 (2008).</li><li>Cross, A. R., Williams, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinky+microtubules:+Bending+and+breaking+induced+by+fixation+in+vitro+with+glutaraldehyde+and+formaldehyde.">Kinky microtubules: Bending and breaking induced by fixation in vitro with glutaraldehyde and formaldehyde.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 20 (4), 272-278 (1991).</li><li>Van Steenbergen, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+understanding+of+label-free+second+harmonic+imaging+of+microtubules.">Molecular understanding of label-free second harmonic imaging of microtubules.</a> Nature Communications. 10 (1), 3530 (2019).</li><li>Campagnola, P. J., Clark, H. A., Mohler, W. A., Lewis, A., Loew, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Second-harmonic+imaging+microscopy+of+living+cells.">Second-harmonic imaging microscopy of living cells.</a> Journal of Biomedical Optics. 6 (3), 277 (2001).</li><li>Campagnola, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+high-resolution+second-harmonic+generation+imaging+of+endogenous+structural+proteins+in+biological+tissues.">Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues.</a> Biophysical Journal. 82 (1), 493-508 (2002).</li><li>Yu, C. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+microtubule+polarity+in+spindles+with+second-harmonic+generation.">Measuring microtubule polarity in spindles with second-harmonic generation.</a> Biophysical Journal. 106 (8), 1578-1587 (2014).</li><li>Bancelin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+microtubules+polarity+in+mitotic+spindles+in+situ+using+Interferometric+Second+Harmonic+Generation+Microscopy.">Probing microtubules polarity in mitotic spindles in situ using Interferometric Second Harmonic Generation Microscopy.</a> Scientific Reports. 7, 6758 (2017).</li><li>Dombeck, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uniform+polarity+microtubule+assemblies+imaged+in+native+brain+tissue+by+second-harmonic+generation+microscopy.">Uniform polarity microtubule assemblies imaged in native brain tissue by second-harmonic generation microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (12), 7081-7086 (2003).</li><li>Psilodimitrakopoulos, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+the+effective+orientation+of+the+SHG+source+in+primary+cortical+neurons.">Estimation of the effective orientation of the SHG source in primary cortical neurons.</a> Optics Express. 17 (16), 14418 (2009).</li><li>Sharoukhov, D., Bucinca-Cupallari, F., Lim, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+imaging+reveals+cytoskeletal+deficit+predisposing+the+retinal+ganglion+cell+axons+to+atrophy+in+DBA/2J.">Microtubule imaging reveals cytoskeletal deficit predisposing the retinal ganglion cell axons to atrophy in DBA/2J.</a> Investigative Opthalmology &amp; Visual Science. 59 (13), 5292 (2018).</li><li>Alata, M., Piazza, V., Eguibar, J. R., Cortes, C., Hernandez, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H-ABC+tubulinopathy+revealed+by+label-free+second+harmonic+generation+microscopy.">H-ABC tubulinopathy revealed by label-free second harmonic generation microscopy.</a> Scientific Reports. 12, 14417 (2022).</li><li>Duncan, I. D., Lunn, K. F., Holmgren, B., Urba-Holmgren, R., Brignolo-Holmes, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+taiep+rat:+A+myelin+mutant+with+an+associated+oligodendrocyte+microtubular+defect.">The taiep rat: A myelin mutant with an associated oligodendrocyte microtubular defect.</a> Journal of Neurocytology. 21 (12), 870-884 (1992).</li><li>Duncan, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mutation+in+the+Tubb4a+gene+leads+to+microtubule+accumulation+with+hypomyelination+and+demyelination:+Tubb4a+Mutation.">A mutation in the Tubb4a gene leads to microtubule accumulation with hypomyelination and demyelination: Tubb4a Mutation.</a> Annals of Neurology. 81 (5), 690-702 (2017).</li><li>Garduno-Robles, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MRI+features+in+a+rat+model+of+H-ABC+tubulinopathy.">MRI features in a rat model of H-ABC tubulinopathy.</a> Frontiers in Neuroscience. 14, 555 (2020).</li><li>Lopez-Juarez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auditory+impairment+in+H-ABC+tubulinopathy.">Auditory impairment in H-ABC tubulinopathy.</a> Journal of Comparative Neurology. 529 (5), 957-968 (2021).</li><li>Alata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+evaluation+of+cerebellar+signs+of+H-ABC+tubulinopathy+in+a+patient+and+in+the+taiep+model.">Longitudinal evaluation of cerebellar signs of H-ABC tubulinopathy in a patient and in the taiep model.</a> Frontiers in Neurology. 12, 702039 (2021).</li><li>Parodi, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonlinear+optical+microscopy:+From+fundamentals+to+applications+in+live+bioimaging.">Nonlinear optical microscopy: From fundamentals to applications in live bioimaging.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 585363 (2020).</li><li>Lefort, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+biomedical+multiphoton+microscopy+and+its+laser+sources.">A review of biomedical multiphoton microscopy and its laser sources.</a> Journal of Physics D: Applied Physics. 50 (42), 423001 (2017).</li><li>Campagnola, P. J., Loew, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Second-harmonic+imaging+microscopy+for+visualizing+biomolecular+arrays+in+cells,+tissues+and+organisms.">Second-harmonic imaging microscopy for visualizing biomolecular arrays in cells, tissues and organisms.</a> Nature Biotechnology. 21 (11), 1356-1360 (2003).</li><li>vander Knaap, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+syndrome+characterized+by+hypomyelination+with+atrophy+of+the+basal+ganglia+and+cerebellum.">New syndrome characterized by hypomyelination with atrophy of the basal ganglia and cerebellum.</a> American Journal of Neuroradiology. 23 (9), 1466 (2002).</li><li>Stoller, P., Kim, B. -. M., Rubenchik, A. M., Reiser, K. M., Da Silva, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarization-dependent+optical+second-harmonic+imaging+of+a+rat-tail+tendon.">Polarization-dependent optical second-harmonic imaging of a rat-tail tendon.</a> Journal of Biomedical Optics. 7 (2), 205 (2002).</li><li>Brown, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+measurement+of+gene+expression,+angiogenesis+and+physiological+function+in+tumors+using+multiphoton+laser+scanning+microscopy.">In vivo measurement of gene expression, angiogenesis and physiological function in tumors using multiphoton laser scanning microscopy.</a> Nature Medicine. 7 (7), 864-868 (2001).</li><li>Chakraborti, S., Natarajan, K., Curiel, J., Janke, C., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+role+of+the+tubulin+code:+From+the+tubulin+molecule+to+neuronal+function+and+disease.">The emerging role of the tubulin code: From the tubulin molecule to neuronal function and disease.</a> Cytoskeleton. 73 (10), 521-550 (2016).</li></ol>

Författarna har inga konkurrerande ekonomiska intressen.

SHG-mikroskopi är en del av en grupp icke-linjära optiktekniker, som inkluderar tvåfotonexcitationsmikroskopi, tredje harmonisk generationsmikroskopi och koherent anti-Stokes Raman-spridningsmikroskopi, som har bidragit till att utöka utbudet av tillämpningar av konventionell optisk mikroskopi till livsvetenskaperna20.
Specifikt relaterar SHG-mikroskopins huvudsakliga styrka och svaghet till samma tillstånd: signalgeneratorn är icke-centrosymmetrisk<sup class="xr...

Den optiska avbildningen av cytoskelettstrukturer i vävnader och organpreparat är inte en lätt uppgift. Cytoskeletala filament är allestädes närvarande, så om generisk färgning utförs, till exempel mot alfa-tubulin eller beta-aktin eller potentiellt keratin i ett epitelprov, kommer signalen sannolikt att fördelas ganska homogent över hela provet. För att begränsa färgningen till en mer meningsfull delmängd av cellulära komponenter kan man antingen använda transgena möss med riktat uttryck1 eller planera att använda isoformspecifika antikroppar. Även om väldigt få av de senare finns på marknaden (och väldigt få finns alls 2,3,4), kan en transgen djurmodell finnas tillgänglig. Det måste dock förvärvas av labbet och ordentligt inrymmas, med alla kostnader som är involverade i processen. Vissa antikroppar eller kemikalier, till exempel fluoroforkonjugerade läkemedel som falloidin eller paklitaxel, kan vara delvis eller helt oförenliga med användning i levande celler eller vävnader, vilket begränsar deras tillämplighet till endast studier av fasta prover.
När det gäller tubulin måste en ytterligare aspekt beaktas, vilket är polymerens känslighet för fixering. Konventionell kemisk fixering med formaldehyd är känd för att inte vara tillräcklig för att optimalt bevara mikrotubuliens integritet5. Dessutom bekräftar en ny rapport att formaldehydkorsbindning inducerar subtila förändringar i mikrotubuliens ultrastruktur, liknande vad som händer med bindningen av vissa läkemedel eller fysiologiska molekyler som GTP6.
Den direkta visualiseringen av mikrotubuli i ostoppade, ofixerade prover är därför ofta önskvärt. För att uppnå detta är en teknisk lösning andra harmoniska generationens (SHG) mikroskopi7, som bygger på förmågan hos buntar av parallella mikrotubuli att fungera som harmonoforer och att avge frekvensfördubblat ljus när de är ordentligt upplysta med en intensiv, pulserad infraröd laser. Även om en starkare och stabilare andra harmonisk signal kan genereras från kollagen och myosin, som är de enda andra två biologiska materialen som är kända för att kunna frekvensfördubblas, har signalen från tubulin hittills använts mest för att studera mitotiska spindelomläggningar 8,9,10 och axonal mikrotubulimorfologi11,12,13.
I detta arbete introducerar vi en ny användning av SHG-mikroskopi som ett diagnostiskt verktyg för att skilja vävnader i centrala nervsystemet (CNS) som påverkas av tubulin beta 4 A (TUBB4A) tubulinopati från deras friska motsvarigheter14. Några av de mutationer som förekommer i denna övervägande neurala isoform av tubulin, som de som orsakar hypomyelinisering och atrofi av de basala ganglierna och cerebellum (H-ABC), inducerar mikrotubuliöverfyllning i oligodendrocyterna15,16; Cytoskelettförändringarna är i sin tur förknippade med nedströms effekter som dysmyelinisering, med djup försämring av motoriska och sensoriska vägar16,17,18,19. Taiep-murinmodellen som används i detta arbete visar onormalt mikrotubuliinnehåll i oligodendrocyterna och rekapitulerar de flesta sensoriska motoriska symtomen hos H-ABC-patienter17. Protokollet förklarar hur man avbildar strukturer som corpus callosum och lillhjärnan, som vanligtvis är mycket myeliniserade och som påverkas allvarligt hos mänskliga patienter såväl som i taiepråttan 19, för att belysa skillnaderna i SH-signaler mellan friska och mutanta vävnader.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>405/10 nm BrightLine(R) single-band bandpass filter&#160;</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-405/10-25</td>
			<td>32 mm diameter, with housing ring</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black Nylon, Polyurethane-Coated Fabric</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BK5</td>
			<td>5&#39; x 9&#39; (1.5 m x 2.7 m) x 0.005&#34; (0.12 mm) Thick&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blades for vibratome</td>
			<td>any commercial; e.g. Wilkinson Sword</td>
			<td></td>
			<td>&#160;Classic stainless steel double edge razor blades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dishes, 35 mm</td>
			<td>any commercial; e.g. Falcon</td>
			<td>351008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM710NLO AxioObserver Z1</td>
			<td>Inverted microscope, objective used is LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 NA&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooler</td>
			<td>any commercial</td>
			<td></td>
			<td>Any insulated, polystyrene box could work, to mantain the sample at about 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corn stach</td>
			<td>e.g. Maizena</td>
			<td></td>
			<td>From the supermarket</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips #1.5</td>
			<td>any commercial</td>
			<td></td>
			<td>Rectangular</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate glue</td>
			<td>e.g. Loctite</td>
			<td></td>
			<td>To glue the brain to the masking tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>fine science tools</td>
			<td>11412-11</td>
			<td>To manipulate tissue sections by handling from the meninges</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine scissors</td>
			<td>fine science tools</td>
			<td>14370-22</td>
			<td>To cut the skin&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine scissors curved tip</td>
			<td>fine science tools</td>
			<td>14061-09</td>
			<td>To cut along the midline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde 37%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>252549</td>
			<td>To dilute 1:10 in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Friedman Rongeur</td>
			<td>fine science tools</td>
			<td>16000-14</td>
			<td>To cut the bone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel packs</td>
			<td>any commercial</td>
			<td></td>
			<td>Prewarmed to 37 &#176;C, to help mantaining the temperature inside the cooler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipette, modified</td>
			<td>any commercial</td>
			<td></td>
			<td>To transfer the tissue section</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#8242; Balanced Salt solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025-076</td>
			<td>Could be prepared from powders</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kelly hemostats</td>
			<td>fine science tools</td>
			<td>13018-14</td>
			<td>To separate the bone&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masking tape</td>
			<td>any commercial</td>
			<td></td>
			<td>To protect th surface of the specimen plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NDD module, type C</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>000000-1410-101</td>
			<td>To detect the signal, reducing light loss. Housing the 000000-1935-163 filter set with the SP485</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Offset bone nippers</td>
			<td>fine science tools</td>
			<td>16101-10</td>
			<td>To cut the bone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-031</td>
			<td>Could be prepared from powders or tabs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulsed laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Chameleon Vision II</td>
			<td>680&#8211;1080 nm tunable laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>any commercial</td>
			<td></td>
			<td>Straight blade with sharp point</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard pattern forceps</td>
			<td>fine science tools</td>
			<td>11000-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas spring scissors</td>
			<td>fine science tools</td>
			<td>15018-10</td>
			<td>To cut meninges that remain joined to both the slice obtained from vibratome cutting and the section glued to the specimen plate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>any commercial; e.g. Leica</td>
			<td>VT1200</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

label-free non-linear optics for the study of tubulin-dependent defects in central myelin

Den tillfredsställande visualiseringen av cytoskelettkomponenter i hjärnan är utmanande. Den allestädes närvarande fördelningen av nätverken av mikrotubuli, mikrofilament och mellanliggande filament i alla neurala vävnader, tillsammans med variationen i resultaten av fluorescerande proteinfusionsstrategier och deras begränsade tillämplighet på dynamiska studier av antikroppar och läkemedel som kromoforfordon, gör klassiska optiska tillvägagångssätt inte lika effektiva som för andra proteiner. När tubulin behöver studeras är den etikettfria genereringen av andra övertoner ett mycket lämpligt alternativ på grund av molekylens icke-centrosymmetriska organisation. Denna teknik, när den konjugeras till mikroskopi, kan kvalitativt beskriva den volymetriska fördelningen av parallella buntar av mikrotubuli i biologiska prover, med den ytterligare fördelen att arbeta med färska vävnader som är ofixerade och oparfymerade. Detta arbete beskriver hur man avbildar tubulin med en kommersiell andra harmonisk generationens mikroskopiinställning för att markera mikrotubuli i oligodendrocyternas tubulinberikade strukturer, som vid hypomyelinering med atrofi av de basala ganglierna och cerebellum (H-ABC) tubulinopati, en nyligen beskriven myelinstörning.

Bilderna som erhållits med denna metod har en inneboende låg bakgrundsnivå på grund av det mycket begränsade antalet harmonoforer som finns i biologiska vävnader, vilket är en av de betydande fördelarna med metoden.
När fibrerna i corpus callosum avbildas kan fiberliknande korta strukturer och rundade element konsekvent hittas i taiep-hjärnan (figur 3B), medan corpus callosum i kontrollhjärnan visar en mycket mer heterogen och isotrop signal i ...

Watch this Scientific Journal Video about Label-Free Non-Linear Optics for the Study of Tubulin-Dependent Defects in Central Myelin at JoVE.com

Label-Free Non-Linear Optics for the Study of Tubulin-Dependent Defects in Central Myelin

I den här artikeln presenterar vi ett protokoll för att detektera mikrotubulibelastade oligodendrocyter i en modell av tubulinopati genom en enkel, innovativ andra harmonisk generationens mikroskopimetod.

Etikettfri icke-linjär optik för studier av tubulinberoende defekter i centrala Myelin

The satisfactory visualization of cytoskeletal components in the brain is challenging. The ubiquitous distribution of the networks of microtubules, ...

Andra harmoniska generationens avbildning av biologiska prover är en optisk teknik som möjliggör visualisering av icke-centrosymmetriska molekyler och deras sammansättningar utan behov av en tagg eller ett färgämne. Bilderna som genereras med denna metod har låg bakgrund eftersom mycket få biologiska molekyler kan fungera som en harmonal kraft. Detta protokoll beskriver tillämpningen av tekniken för diagnostisk avbildning av Tubulin beta-4A i taiep-djurmodellen.Tubulinopatier beskrivs nyligen sjukdomar. Av denna anledning finns en begränsad mängd information tillgänglig om de grundläggande mekanismerna som ligger till grund för patofysiologin på cellnivå. För att börja, slå på pulslasern för att garantera att den är redo att lasa på en optimal och stadig effektnivå.För att studera tisulär mikrotubuli används 10 till 20% av den tillgängliga lasereffekten, vilket i det beskrivna systemet motsvarar 13 till 26 milliwatt mätt vid målets bakre fokalplan. Innan du bildar, vrid lasern till 810 nanometer. Se sedan till att mikroskopet är Koehler-anpassat till målet som används för andra harmoniska generationen, eller SHG-avbildning.Ta bort oönskade filter från den optiska detekteringsvägen och se till att kondensorns membran är helt öppet och att inget ljus stoppas i onödan. Förbered ett 25x x 0,8 numeriskt bländaroljesänkningsmål med en liten droppe nedsänkningsolja i linsen. Följ stegen som rapporteras i tabellen här, förutom lasereffekten som är mindre än 5% för majsstärkelse.Bild torr majsstärkelse inklämd mellan glasskivor. med SHG-parametrar för att generera SHG-bilder avslöjar de laserpolarisationsriktningen. Ta en bild av glesa majsstärkelsekorn och markera orienteringen av SHG-lobulerna i XY-planet som motsvarar laserpolarisationsorienteringen.För kontroll, ta en annan bild av samma prov som sätter in en halvvågsplatta i den optiska banan för att ändra laserns svängningsriktning. Den resulterande bilden visar roterade SHG-signallobuler. Om du använder ett annat bandpassfilter för SHG:n, se till att det har optimala överföringsegenskaper genom att jämföra bilderna och signalintensiteterna pixel för pixel längs skanningslinjen.Förbered en vibratombuffertbricka fylld med en varm Hanks'Balanced Salt Solution eller HBSS. Fäst hjärnan på provplattan med cyanoakrylatlim via en bit maskeringstejp. Den mest kaudala delen kommer i kontakt med limet så att de användbara koronala sektionerna från den motsatta rostrala delen kan skäras.Överför provplattan till dess magnetiska stöd inuti buffertbrickan. Börja skära 300 till 500 mikron sektioner tills skivorna omfattar hela hjärnytan. Minska sedan sektionens tjocklek till 160 mikron.När en 160 mikron sektion har skurits vid nivån av corpus callosum, återställ den med en modifierad glas Pasteur-pipett med en stor flänsad öppning. Överför sektionen till en ren petriskål med ny varm HBSS eller direkt på täckbladet eller glasbottenskålen för mikroskopi. Placera provet under mikroskopet och placera det på lämpligt sätt under målet genom direkt observation genom kikaren med överfört ljus.Ta bort överskottet av HBSS så att en tunn flytande film täcker hela provet. Kontrollera visuellt vätskefilmen med några minuters mellanrum för att undvika överdriven avdunstning och torkning av provet. Förbered mikroskopsteget för icke-avskandad avbildning, vilket inkluderar att stänga alla dörrar till den mörka inkubationskammaren eller täcka inkubationskammaren med ett svart nylonpolyuretanbelagt tyg.Välj det icke-avkalkade bildläget längs överföringsvägen. På så sätt optimeras fångsten av den svaga SH-signalen från tubulin. Välj sedan målet.Ställ sedan in en lasereffekt med en pixeluppehållstid på 12, 6 mikrosekunder. Ta bilder som inte är större än 512 x 512 pixlar med hastighet fem och i genomsnitt två under en genomsnittlig förvärvstid på 15 sekunder. Ta bilder först med ett 485 nanometer kortpassfilter och lägg i ett andra steg till ett skarpt 405 nanometer bandpassfilter.Skär cerebellum med en skalpell i två halvklot och fixa dem till vibratomstödet vid mittdelen. Avsnitt och bild av lillhjärnan med samma vibratom-, blad- och mikroskopinställningar som beskrivs för hjärnan. När fibrerna i corpus callosum avbildas observeras fiberliknande korta strukturer och rundade element i taiephjärnan.Däremot visar corpus callosum i kontrollhjärnan en mycket mer heterogen och isotrop signal i hela hjärnregionen. Ursprunget till differentialsignalen ligger specifikt i fenomenet Andra harmoniska generationen eftersom tillägg av det smala bandpassfiltret endast minskar den ospecifika signalintensiteten från styrbilderna, samtidigt som man selektivt tar bort denna låga diffusa signal från runt de soma-liknande och de korta långsträckta strukturerna i taiep-bilderna som alltid genererar intensivt SH-ljus. I cerebellär vit substanskontrollvävnad observerades fullständig frånvaro av SH-signal.Purkinje-cellerna är knappt synliga när de använder kortpassfiltret, och de långsträckta och rundade strukturerna kvarstår i SH-bilden från taiep-vävnaden. Ett kritiskt steg för att få den bästa bilden är att skära vävnadssektioner så tunna som möjligt. Dessutom kräver arbete med akuta vävnadssektioner snabba protokoll för att förhindra försämring av vävnaden.Därför är det viktigt att ställa in och kontrollera det optiska systemet i förväg. Andra harmoniska signalen från mikrotubuli är svagare än andra harmonisk signal från stärkelse. Därför måste mer laserkraft användas för avbildning av mikrotubuli.Lasereffekten bör ökas noggrant eftersom, eftersom ett mål med hög numerisk bländare används för avbildning, skulle intensiteten vid provet snabbt öka Med andra harmoniska generationens avbildning identifieras de patologiska förändringarna i den centrala myelinomatiska av den tubulinopatiska modellen snabbt och enkelt. Potentiella tillämpningar av denna teknik inkluderar dess användning för studier av de grundläggande mekanismerna för H-ABC-tubulinopati och för bedömning av farmakologiska terapier för att behandla patienter. På lång sikt har tekniken potential att bli ett kompletterande diagnostiskt verktyg som kan användas intrakraniellt eller på färska biopsier.

label-free-non-linear-optics-for-study-tubulin-dependent-defects

Research

JoVE Journal

Neuroscience

1.8K Views.  Centro de Investigaciones en Óptica A.C. (CIO). Second-Harmonic Generation imaging of biological samples is an optical technique that allows the visualization of non-centrosymmetric molecules and their assemblies without the need of a tag or a dye. The images generated with this method have low background since very few biological molecules could act as a harmonal force. This protocol describes the application of the technique for diagnostic imaging of Tubulin beta-4A in the taiep animal model.Tubulinopathies are recently described ...