4.1K Views
•
13:43 min
•
April 1st, 2022
DOI :
April 1st, 2022
•0:10
Introduction
1:03
Method Overview
1:52
Extended Anti-Inflammatory Treatment
2:53
Preoperative Preparation
4:01
Intraductal Injection
7:20
micro-CT Imaging
9:32
Image Analysis
11:02
Results
11:57
Conclusion
Transcript
Borstkanker is de meest voorkomende kanker en de tweede belangrijkste oorzaak van kankergerelateerde sterfte voor vrouwen in de VS. De huidige preventiebenaderingen zijn beperkt en komen met een verscheidenheid aan nadelige bijwerkingen. Nieuwe interventies voor primaire preventie zijn nodig. We hebben een methode ontwikkeld voor intraductale toediening van een op ethanol gebaseerde ablatieve oplossing aan de borstepithelia van muizen voor de preventie van borstkanker.
Injectie direct in de tepelopening maakt het mogelijk om epitheelcellen die de ductale boom bekleden te richten met minimale nevenweefselschade. Deze methode maakt gelijktijdige in vivo beeldvorming mogelijk met behulp van tantaaloxide nanodeeltjes als contrastmiddel met hoge resolutie. Deze methode kan worden aangepast voor gebruik met andere röntgencontrastmiddelen en verschillende preventieve behandelingen met verschillende chemische of thermische ablatieve oplossingen.
De eerste stap die betrokken is bij deze methode van beeldgeleide borstkankerpreventie is het induceren van uitgebreide ontstekingsremmende behandeling door orale dosering van carprofen met behulp van sucralose-gelcups bereid in het laboratorium. We bereiden het dier voor door ontharingscrème te gebruiken om de vacht te verwijderen uit het gebied rond de tepels die moeten worden geïnjecteerd. Vervolgens worden intraductale injecties uitgevoerd met behulp van een stereoscoop om de opening van de tepel voor het inbrengen van de naald het beste te lokaliseren en te visualiseren.
Na toediening van de oplossing worden dieren in beeld gebracht door micro-CT of fluoroscopie om te bepalen hoe succesvol de injecties waren. Micro-CT-scans kunnen worden verwerkt om 3D-reconstructies van de geïnjecteerde borstvormige ductale boom te maken voor verdere analyse van succesvolle vulling en andere metrieken. Bereid eerst carprofen voor met de vereiste concentratie.
We maken een werkoplossing van twee mg per ml om 0,5 ml te injecteren en een uiteindelijke dosis van één mg per kopje te bereiken. U kunt steriele voedselkleurstof aan het mengsel toevoegen om de volledige menging van het medicijn in de sucralose van de beker beter te bevestigen. Plaats vervolgens de kopjes in een waterbad bij 60 graden Celsius gedurende 15 minuten.
Verwijder de bekers en droog ze af om de kans op besmetting te minimaliseren. Gebruik 70% ethanol of ethanol doekjes om het oppervlak van het bekerdeksel schoon te maken en te laten drogen. Gebruik een spuit om de benodigde hoeveelheid carprofenoplossing door het deksel te injecteren.
In dit geval moeten we 500 microliter injecteren voor het gewenste resultaat. Plaats een sticker over het gat van de naald en schud de beker gedurende 15 seconden voordat je nog eens 15 seconden vortext. Controleer de beker op homogeen mengen door te zoeken naar klonten donkerblauw.
Bekers kunnen dan maximaal een maand worden gekoeld. De voorbereiding van het dier moet twee tot drie dagen vóór de intraductale procedure plaatsvinden. Begin met het verdoven van het dier met isofluraan.
Breng de verdoofde muis over op een neuskegel die isofluraan blijft afgeven. Breng oogsmeermiddel aan op de muis terwijl je bij de neuskegel zit en plaats de muis vervolgens op zijn rug. Gebruik een applicator met katoenen punt om ontharingscrème aan te brengen op het gebied van de borstklieren die u van plan bent te injecteren.
Wrijf de applicator op en neer over de huid van het dier in het gewenste gebied om te helpen bij het sneller losmaken van de vacht. Het is belangrijk om de crème zo min mogelijk op de muis te laten zitten om te voorkomen dat de huid verbrandt. Gebruik na 10 tot 30 seconden na het aanbrengen warm water op gaas om de crème volledig te verwijderen.
Gebruik twee tot vier spoelingen om volledige verwijdering te garanderen voordat u de huid droogt met schoon gaas. Controleer de gebieden waar de vacht wordt verwijderd om een goede zichtbaarheid en toegang tot de tepels te bevestigen. Herhaal indien nodig de ontharingsprocedure.
Plaats de muis in een schone herstelkooi op een opwarmkussen om te herstellen van anesthesie. Geef één carprofenbeker om muizen in hun thuiskooi voor te bereiden na herstel. U begint opnieuw met het verdoven van het dier met behulp van isofluraan-anesthesie en verplaatst de muis naar een neuskegel zodra deze volledig is geïnduceerd.
Oogglijmiddel zal worden aangebracht voordat het dier op zijn rug wordt geplaatst voor injecties. Het kan nuttig zijn om de benen af te plakken in de buurt van de borstklieren die worden geïnjecteerd, maar is niet nodig. Bereid de spuit voor met het gewenste volume injectieoplossing plus één microliter voor het geval er na het verwijderen van de naald wat uitlekt.
Het kan nuttig zijn om te vullen met extra volume om de naald te testen op vrije doorstroming van de oplossing onmiddellijk voorafgaand aan de injectie. Als u meer dan één borstklier injecteert, kan dit tijd besparen om meerdere spuiten voor te vullen, indien beschikbaar. Zorg ervoor dat u dit niet te vroeg doet als de oplossing gevoelig is voor verstopping wanneer u blijft zitten.
Bereid de tepel voor door eventuele zichtbare dode huid te verwijderen met een fijne tang. Het is niet nodig om alle dode huid te verwijderen als deze de tepelopening niet blokkeert en bestand is tegen trekken. Dit kan soms letsel en zwelling aan de tepel veroorzaken als dode huid te strak op de levende huid wordt aangebracht.
Met de schuine kant van de naald zichtbaar, steekt u de naald in de opening van de tepel met begeleidingshulp van de fijne pendop. Afhankelijk van de lengte en stevigheid van de tepel, is het mogelijk dat het niet altijd mogelijk is om de tepel vast te houden terwijl de naald wordt geleid. Het is soms nodig om de tepel met de naald te manoeuvreren zodat de tang de tepel over de naald omhoog kan trekken in plaats van de naald naar beneden in de tepel te leiden.
Zodra de naaldafschuining volledig is omgeven door de tepel en in het hoofdkanaal, begint u langzaam met het injecteren van de oplossing. De gewenste snelheid is ongeveer 40 microliter per minuut. Injecteer niet sneller dan dit om mogelijke schade aan de ductale boom te voorkomen.
Wacht na volledige injectie 30 seconden voordat u de naald uit de tepel haalt met hulp van de tang. Dit minimaliseert eventuele lekkage uit de tepel. Beoordeel het gebied op tekenen van een mislukte injectie.
Een koepelvormig uiterlijk kan wijzen op een vetkusseninjectie of trauma aan het gebied. Het is vaak mogelijk om te zien dat er een injectie in het vetkussen optreedt als de oplossing kleurstof bevat of als u zorgvuldig op zoek bent naar doming op de injectieplaats, zoals hier te zien is. Ga verder met het injecteren van de resterende borstklieren die nodig zijn voor uw experiment op dezelfde manier, waarbij u injectievolumes en eventuele lekkages opmerkt.
Sommige delen van de muis kunnen moeilijker te injecteren zijn vanwege problemen zoals onhandige handplaatsing of ademhalingsstoornissen. Een rechtshandige injector zal bijvoorbeeld waarschijnlijk de moeilijkste tijd hebben om de klieren aan de rechterbovenkant van de muis te injecteren. Deze bewegen meer vanwege de nabijheid van de longen en het kan moeilijk zijn om een goede handplaatsing met het lichaam van het dier te vinden in de manier waarop de pols op het oppervlak rust.
Sommigen vinden het misschien gemakkelijker om de muis te verplaatsen als de neuskegel dit toelaat. Bij het injecteren van een ethanolbevattende oplossing moet ervoor worden gezorgd dat systemische alcoholintoxicatie wordt voorkomen. Dit vereist dat u weet hoeveel ethanol in één sessie kan worden geïnjecteerd en dat sucrose-bevattende oplossing IP tijdens de procedure wordt toegediend om de effecten tegen te gaan.
Na de intraductale procedure kunnen dieren worden teruggevonden in een schone kooi op een verwarmingskussen of worden verplaatst naar het micro-CT-systeem voor beeldvorming van gevulde ductale bomen. De muis moet ook worden hersteld na een beeldbewerkingssessie. Nadat u het geïnjecteerde dier naar het micro-CT-systeem hebt verplaatst, blijft u isofluraan toedienen om de anesthesie tijdens de beeldvorming te behouden.
Het kan nuttig zijn om de beeldvormingspositie te standaardiseren door de benen in de buurt van de te fotograferen site af te plakken. Als u bijvoorbeeld de achterpoten in een verlengde positie afplakt, kan het bot van de benen het zicht op de geïnjecteerde klieren niet belemmeren. Het tapen van de voorpoten in een opwaartse verlengde positie kan op dezelfde manier helpen bij het bekijken van de bovenste klieren.
We hebben ook ontdekt dat taping over de buik van de muis kan helpen bij het verminderen van ademhalingsartefacten voor de onderste klieren. Er zijn veel acceptabele scanparameters voor visualisatie van de ductale boom. Er moet altijd voor worden gezorgd dat de stralingsdosis als gevolg van deze scans de stralingslimieten voor een bepaalde muizenstam niet overschrijdt.
Stralingsdosering kan sterk worden verminderd door fluoroscopie te bekijken en succes van de levering op te merken in plaats van beelden te verkrijgen met langere belichtingstijden. Onze standaard scanparameters zijn acceptabel voor herhaalde beeldvorming als u slechts korte standaardscans van twee minuten krijgt. Langere scans met een hogere resolutie tot 14 minuten zijn acceptabel als terminale procedure vóór euthanasie.
Deze langere scans zijn niet acceptabel voor longitudinale studies omdat ze stralingsziekte bij het dier kunnen veroorzaken. Dit dier werd geïnjecteerd met een ethanoloplossing met 100 millimolair tantaaloxidecontrast in de klieren vier en negen. De huidige aanwinst is een 14 minuten durende hoge resolutie scan van de geïnjecteerde onderste klieren.
Fluoroscopie van het dier stelt ons in staat om te zien dat de ductale boomarchitectuur wordt benadrukt door het contrast in de injectieoplossing. Het micro-CT-systeem dat we gebruiken, heeft ingebouwde software waarmee snelle uitvoeringen kunnen worden gemaakt om het succes van injectie te beoordelen zonder formele analyse. Deze functie heeft een eenvoudige contrastschuifregelaar die een redelijke signaal-ruisonderdrukking mogelijk maakt.
De beperking van deze weergaven is dat dezelfde signaaldrempels worden toegepast op het hele beeld. Hierdoor kunnen heldere signalen die duidelijk geen deel uitmaken van de ductale boom, zoals ijzer in de voeding, in de weergave blijven. Betere formele weergaven kunnen worden gemaakt met behulp van meer geavanceerde analysesoftware die segmentatie van het interessegebied mogelijk maakt.
Om de beste weergave van de zoolvormige boom te krijgen, raden we aan om het borstvetkussen te segmenteren voor verdere beeldverwerking. Dit proces vereist lijn die de grenzen van het vetkussen over de volledige dikte van het dier volgt. We hebben ontdekt dat het traceren van elke derde plak en het verspreiden van het object voldoende is om het geheel van het kanaal vast te leggen.
Dit kan een subjectief proces zijn, dat naleving van laboratoriumnormen voor tracering vereist om vergelijkbare output te garanderen van alle personen die scans analyseren. Bekendheid met anatomie kan helpen bij het beoordelen van oproepen over welke gebieden moeten worden opgenomen. Na het vermeerderen van sporen is het dan mogelijk om de weergave binnen een bepaald bereik te brengen om alleen het contrast in de borstklier weer te geven.
Dit moet de oplossing zijn in de ductale boom, evenals eventuele lekkage in de directe omgeving. Een bereik van 300 tot 3.000 HU werkt meestal goed in het geval van tantaaloxide-bevattende oplossingen. Een voorbeeld van een volledig bewerkte weergave is hier in meerdere aspecten te zien.
Afhankelijk van hoe het dier is georiënteerd in de micro-CT, kan het nodig zijn om DICOM-bestanden in de analysesoftware te heroriënteren om intuïtieve anatomische positionering weer te geven met het hoofd van het dier bovenaan het beeld. Het kan ook moeilijk zijn om te bepalen welke klier wordt bekeken als u er niet voor zorgt dat u het beeld elke keer op dezelfde manier roteert. Verdere metingen zoals volume of lengte kunnen worden gedaan nadat u een reconstructie van de ductale boom hebt gemaakt.
Validatie voor succesvolle levering via deze procedure kan niet alleen worden aangetoond door 3D micro-CT-uitvoeringen zoals hier beschreven, maar ook door hele mounts met dubbele vlekken met geïnjecteerd Evans-blauw dat de hele ductale boom overlapt met karmijnaluin. 3D confocale microscopie kan de architectuur van de ductale boom benadrukken in een opgeruimde klier gekleurd met e-cadherine. Strain-to-strain en muis-tot-muis variabiliteit en tepelanatomie kunnen het min of meer moeilijk maken om klieren te injecteren.
Dit is een voorbeeld van een ideale tepel voor injectie met een hoog profiel voor het gemak van grijpen. Tepels met lagere profielen, zoals deze, kunnen moeilijker succesvol te cannuleren zijn. Deze verschillen kunnen het waarschijnlijker maken om een succesvolle injectie te bereiken zonder trauma of doming zoals hier te zien of meer kans om niet succesvol te zijn, zoals blijkt uit het koepelvormige uiterlijk van deze vetkusseninjectie.
Als het gaat om de preventie van borstkanker, zijn er momenteel twee hoofdtactieken die worden gebruikt. Het eerste, waakzaam wachten, houdt geen echte interventie in. Personen die dit pad volgen, worden regelmatig gecontroleerd op knobbels in hun borstweefsel die erop zouden wijzen dat er kankervorming optreedt.
Ziektedetectie zou dan de behandeling in gang zetten. Profylactische mastectomie is een meer invasieve procedure die alle epitheelcellen verwijdert waaruit borstkanker kan ontstaan, samen met het omliggende stroma. Deze operatie kan ernstige nadelige bijwerkingen hebben en wordt zelden geselecteerd als een profylactische optie voor personen met een laag of matig risico op ziekte.
Onze aanpak omvat lokale epitheliale ablatie door injectie van een ablatieve oplossing rechtstreeks in de borst ductale boom. Deze methode vermindert nevenschade en zou waarschijnlijk een aantrekkelijkere optie zijn voor personen die geen ernstig risico op ziekte lopen. De toevoeging van contrast voor onmiddellijke beeldvorming na injectie maakt dit ook gemakkelijk te vertalen naar de kliniek.
Een methode van intraductale injectie van reagentia voor een op ethanol gebaseerde ablatieve oplossing in de mamma-ductale boom van muizen voor in vivo beeldvorming en preventie van borstkanker wordt beschreven. Injectie direct in de tepelopening maakt het mogelijk om borstepitheelcellen te richten met minimale collaterale weefselschade.
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved