乳がんは、米国で最も蔓延しているがんであり、米国の女性にとってがん関連死因の第2位です。現在の予防アプローチは限られており、さまざまな有害な副作用が伴います。一次予防のための新しい介入が必要である。我々は、乳癌予防のためにエタノール系アブレーション液をマウス乳腺上皮に経口送達する方法を開発した。
乳首開口部に直接注射すると、管木を裏打ちする上皮細胞を標的とし、側副組織損傷を最小限に抑えることができます。この方法は、酸化タンタルナノ粒子を高解像度造影剤として用いる同時生体内イメージングを可能にする。この方法は、他のX線造影剤および異なる化学的または熱的アブレーション溶液による様々な予防的処置と共に使用するために適合され得る。
画像誘導乳癌予防のこの方法に関与する最初のステップは、実験室で調製されたスクラロースゲルカップを利用したカルプロフェンの経口投与を介して拡張抗炎症治療を誘導することである。私たちは、注射する乳首の周囲の領域から毛皮を除去するために脱毛クリームを使用して動物を準備する。次に、立体鏡の助けを借りて管内注射を行い、針挿入のための乳首の開口部を最適に位置特定して視覚化する。
溶液の送達後、動物をマイクロCTまたは蛍光透視法によって画像化し、注射がどれほど成功したかを決定する。マイクロCTスキャンを処理して、注入された乳管樹の3D再構成を作成し、成功した充填やその他の測定基準をさらに分析することができます。まず、必要な濃度でカルプロフェンを準備する。
0.5mLを注入し、カップあたり1mgの最終用量を達成するために、mLあたり2mgの作業溶液を作る。あなたはより良いカップのスクラロースに薬物の完全な混合を確認するために混合物に滅菌食用色素を加えることができます。次に、カップを摂氏60度の水浴に15分間入れます。
カップを取り出し、汚染の可能性を最小限に抑えるためにそれらを乾燥させます。70%エタノールまたはエタノールワイプを使用して、カップの蓋の表面をきれいにし、乾燥させます。シリンジを使用して、蓋から必要量のカルプロフェン溶液を注入する。
この場合、望ましい結果を得るために500マイクロリットルを注入する必要があります。針の穴の上にステッカーを貼り、カップを15秒間振ってから、さらに15秒間渦巻きます。濃い青の塊を探して、カップに均質な混合がないか確認してください。
カップはその後、最大1ヶ月間冷蔵することができます。動物の調製は、管内処置の2〜3日前に行われるべきである。イソフルランを使用して動物を麻酔することから始めます。
麻酔したマウスを、イソフルランを送達し続ける鼻錐形に移す。ノーズコーンにいる間にマウスにアイ潤滑剤を塗布し、マウスを背中に置きます。綿の先端をあけたアプリケーターを使用して、注射する予定の乳腺の領域に脱毛クリームを塗布します。
アプリケーターを目的の部分で動物の皮膚を横切って上下にこすって、毛皮のより迅速な緩みを助けます。皮膚を燃やさないように、クリームをできるだけ短い時間マウスに残すことが重要です。塗布の10〜30秒後、クリームを完全に除去するためにガーゼに温水を使用してください。
きれいなガーゼで皮膚を乾燥させる前に、2〜4回のすすぎを使用して完全に除去してください。毛皮の除去の領域をチェックして、良好な視認性と乳首へのアクセスを確認してください。必要に応じて脱毛処置を繰り返します。
麻酔から回復するために、温暖化パッド上の清潔な回復ケージにマウスを置きます。回復後に自宅のケージでマウスを準備するために1つのカルプロフェンカップを与えます。あなたは再びイソフルラン麻酔を使って動物を麻酔することから始め、それが完全に誘発されたらマウスを鼻円錐形に動かします。
注射のために動物を背中に置く前に、目の潤滑剤が塗布されます。注射される乳腺の近くの脚をテープで留めておくと便利ですが、必要ではありません。針の取り外し後に一部がこぼれた場合に備えて、所望の量の注射液に1マイクロリットルを加えたシリンジを準備する。
注射の直前に溶液の自由な流れについて針をテストするために、追加の体積で充填することが有用であり得る。複数の乳腺を注射する場合、利用可能な場合は複数の注射器をプレフィルする時間を節約できます。解決策が座ったままにしたときに目詰まりを起こしやすい場合は、これを早すぎないように注意してください。
可能であれば、先端の細かい鉗子を使って目に見える死んだ皮膚を取り除き、乳首を準備します。乳首の開口部を塞いでおらず、引っ張りにくい場合は、すべての古い皮膚を取り除く必要はありません。これは時々死んだ肌があまりにもきつく生きている肌に貼り付けられている場合、乳首に怪我や腫れを引き起こす可能性があります。
針の斜めが見えるように、細かい先端の鉗子の指導の助けを借りて、針を乳首の開口部に挿入します。乳首の長さや硬さによっては、針を導きながら乳首を押さえることができない場合があります。針を乳首に導くのではなく、鉗子が乳首を針の上に引き上げることができるように、針で乳首を操作する必要がある場合があります。
針のベベルが乳首とメインダクトで完全に囲まれたら、ゆっくりと溶液を注入し始めます。所望の速度は、毎分約40マイクロリットルである。管状樹木への損傷を防ぐために、これ以上の速さで注入しないでください。
注射が完了したら、30秒待ってから、鉗子の助けを借りて乳首から針を取り外します。これにより、乳首からの漏れが最小限に抑えられます。注射が失敗した兆候がないか領域を評価します。
ドーム型の外観は、脂肪パッド注射またはその領域への外傷を示し得る。溶液に色素が含まれている場合、またはここで見られるように注射部位でのドームを慎重に探している場合、脂肪パッドへの注射が発生していることがしばしば可能です。同様の方法で実験に必要な残りの乳腺を注射し、注射量と漏れの発生率に注意してください。
マウスの一部の領域は、手の配置がぎこちない、呼吸の干渉などの問題により、注射が困難な場合があります。たとえば、右利きの注射器は、ここで見られるマウスの右上の腺を注射するのに最も難しい可能性があります。これらは肺への接近のためにより動きます、そしてそれは表面に手首を休めるのを邪魔して動物の体と良い手の配置を見つけることは難しいかもしれません。
ノーズコーンが許せば、マウスの位置を変える方が簡単だと感じる人もいるかもしれません。エタノール含有溶液を注入するときは、全身性アルコール中毒を避けるために注意が必要である。これには、1回のセッションでどれだけのエタノールを注入できるかを知り、その効果を打ち消すために手順中にスクロース含有溶液IPを投与する必要があります。
管内処置の後、動物は加熱パッド上の清潔なケージに回収されるか、または充填された管状樹木の画像化のためにマイクロCTシステムに移動され得る。マウスは、イメージングセッション後にも回復する必要があります。注射した動物をマイクロCT系に移動させた後、画像撮影中に麻酔を維持するためにイソフルランを投与し続ける。
画像化される部位の近くの脚をテーピングすることによって、画像化位置を標準化することは有用であり得る。例えば、後肢を伸長した位置にテーピングすると、脚の骨が注射された腺の視界を妨げるのを防ぐことができる。前足を上向きに伸ばした位置にテーピングすることは、同様に上腺を見るのを助けることができます。
また、マウスの腹部を横切るテーピングが、下腺の呼吸アーチファクトの減少に役立つことも発見しました。管状樹木の視覚化に許容されるスキャンパラメータは多数あります。これらのスキャンから生じる放射線量が、特定の系統のマウスの放射線限度を超えないように、常に注意が必要である。
放射線の投与は、より長い露光時間で画像を取得するのではなく、透視法を見て送達の成功を指摘することによって大幅に削減することができます。当社の標準スキャンパラメータは、2分間の短い標準スキャンのみを取得する場合、繰り返しイメージングに許容されます。14分までの高解像度の長いスキャンは、安楽死前の終末処置として許容されます。
これらのより長いスキャンは、動物に放射線病を引き起こす可能性があるため、縦断的研究には受け入れられません。この動物に、腺4および9において対照的に100ミリモルの酸化タンタルを含むエタノール溶液を注射した。現在の取得は、注入された下部腺の14分間の高解像度スキャンです。
動物の透視検査では、注射溶液内のコントラストによって管状樹木の構造が強調されているのを見ることができます。私たちが使用するマイクロCTシステムには、正式な分析なしで注射の成功を評価するための迅速なレンディションの作成を可能にするソフトウェアが組み込まれています。この機能には、合理的な信号対ノイズリダクションを可能にするシンプルなコントラストスライダがあります。
これらのレンディションの制限は、同じ信号しきい値が画像全体に適用されることです。これにより、食事中の鉄など、明らかに管の木の一部ではない明るい信号がレンディションに残るようになります。より高度な解析ソフトウェアを使用して、関心のある領域のセグメンテーションを可能にする、より正式なレンディションを作成できます。
唯一の乳管ツリーのレンダリングを最適にするには、乳房脂肪パッドをセグメント化してさらに画像処理することをお勧めします。このプロセスでは、動物の完全な厚さ全体にわたって脂肪パッドの境界をトレースするラインが必要です。3 番目のスライスをすべてトレースしてオブジェクトを伝播するだけで、ダクト全体をキャプチャするのに十分であることがわかりました。
これは主観的なプロセスである可能性があり、スキャンを分析するすべての個人から同様の出力を保証するために、トレースに関するラボ標準を遵守する必要があります。解剖学に精通していることは、どの領域を含めるべきかについての判断の呼びかけに役立ちます。トレースを伝播した後、レンディションを一定の範囲内でスレッショルドして、乳腺内に含まれるコントラストのみを表示することができます。
これは、ダクトツリー内の解決策であり、すぐ近くにある漏れでなければなりません。300〜3,000HUの範囲は、酸化タンタル含有溶液の場合に良好に機能する傾向がある。完全に処理されたレンディションの例は、ここでは複数の側面で見ることができます。
マイクロCTで動物の向きによっては、画像の上部に動物の頭を持つ直感的な解剖学的位置決めを表現するために、解析ソフトウェアでDICOMファイルの向きを変える必要があるかもしれません。また、毎回同様の方法で画像を回転させるように注意を払わないと、どの腺が表示されているかを判断するのが難しい場合があります。体積や長さなどのさらなる測定は、ダクタルツリーの再構築を作成したら行うことができます。
この手順による送達の成功の検証は、ここで説明するように3DマイクロCTレンディションだけでなく、カーミンミョウバンで強調表示された管状ツリー全体と重なり合う注入されたエバンスブルーのデュアルステインホールマウントによっても実証できます。3D共焦点顕微鏡は、e-カドヘリンで染色された透明な腺の管木のアーキテクチャを強調することができます。系統からひずみ、マウスからマウスへの変動性および乳首の解剖学的構造は、腺を注射することを多かれ少なかれ困難にする可能性があります。
これは、握りやすさのために高いプロファイルを備えた注射に理想的な乳首の例です。このような低いプロファイルの乳首は、正常にカニューレするのがより困難になる可能性があります。これらの違いは、ここで見られるような外傷やドーム型のない注射を成功させる可能性が高くなったり、この脂肪パッド注射のドーム型の外観によって示されるように失敗する可能性が高くなります。
乳がん予防に関しては、現在、主に2つの戦術が採用されています。第一の、用心深い待機は、真の介入を伴わない。この経路を追求する個人は、癌形成が起こっていることを示す乳房組織内のしこりについて定期的に監視される。
病気の検出は、治療を促すでしょう。予防的乳房切除術は、乳癌が周囲の間質とともに発生する可能性のあるすべての上皮細胞を除去する、より侵襲的な処置である。この手術は重篤な有害な副作用を有する可能性があり、疾患のリスクが低いまたは中等度の個人のための予防的選択肢として選択されることはめったにない。
我々のアプローチは、乳房管樹に直接アブレーション溶液を注入することによる局所上皮アブレーションを含む。この方法は、付随的損害を軽減し、疾患の重篤なリスクにない個人にとってより魅力的な選択肢となる可能性が高い。注射後の即時イメージングのためのコントラストの追加により、これを診療所に容易に翻訳することもできます。
