4.1K Views
•
13:43 min
•
April 1st, 2022
DOI :
April 1st, 2022
•0:10
Introduction
1:03
Method Overview
1:52
Extended Anti-Inflammatory Treatment
2:53
Preoperative Preparation
4:01
Intraductal Injection
7:20
micro-CT Imaging
9:32
Image Analysis
11:02
Results
11:57
Conclusion
Transcript
Brystkreft er den mest utbredte kreftformen og den nest ledende årsaken til kreftrelatert død for kvinner i USA. Nåværende forebyggingsmetoder er begrenset og kommer med en rekke bivirkninger. Nye tiltak for primærforebygging er nødvendig. Vi har utviklet en metode for intraductal levering av en etanolbasert ablativ løsning på musens pattedyrepilesi for forebygging av brystkreft.
Injeksjon direkte inn i brystvorteåpningen gjør det mulig å målrette epitelceller som fôrer kanaltreet med minimal sikkerhetsvevsskade. Denne metoden muliggjør samtidig in vivo-avbildning ved hjelp av tantaloksid nanopartikler som et høyoppløselig kontrastmiddel. Denne metoden kan tilpasses for bruk med andre røntgenkontrastmidler og ulike forebyggende behandlinger med ulike kjemiske eller termiske ablative løsninger.
Det første trinnet som er involvert i denne metoden for bildestyrt brystkreftforebygging er å indusere utvidet antiinflammatorisk behandling gjennom oral dosering av karprofen ved hjelp av sucralose gel kopper tilberedt i laboratoriet. Vi forbereder dyret ved å bruke depilatorisk krem for å fjerne pelsen fra området rundt brystvorten som skal injiseres. Deretter utføres intraductal injeksjoner ved hjelp av et stereoskop for best å finne og visualisere åpningen av brystvorten for nålinnsetting.
Etter levering av løsningen blir dyr avbildet av mikro-CT eller fluoroskopi for å bestemme hvor vellykkede injeksjonene var. Mikro-CT-skanninger kan behandles for å lage 3D-rekonstruksjoner av det injiserte pattedyrkanaltreet for videre analyse av vellykket fylling og andre beregninger. For det første, forbered carprofen ved nødvendig konsentrasjon.
Vi lager en arbeidsløsning på to mg per ml for å injisere 0,5 ml og oppnå en sluttdose på en mg per kopp. Du kan legge steril matfarge til blandingen for bedre å bekrefte full blanding av stoffet i koppens sucralose. Deretter legger du koppene i et vannbad ved 60 grader Celsius i 15 minutter.
Fjern koppene og tørk dem av for å minimere muligheten for forurensning. Bruk 70% etanol- eller etanolservietter for å rengjøre overflaten av kopplokket og la det tørke. Bruk en sprøyte til å injisere nødvendig mengde karprofenoppløsning gjennom lokket.
I dette tilfellet må vi injisere 500 mikroliter for ønsket resultat. Plasser et klistremerke over hullet fra nålen og rist koppen i 15 sekunder før du virveler i ytterligere 15 sekunder. Kontroller koppen for homogen blanding ved å lete etter klumper av mørk blå.
Kopper kan deretter kjøles ned i opptil en måned. Forberedelse av dyret bør skje to til tre dager før intraductal prosedyre. Begynn med å bedøve dyret ved hjelp av isofluran.
Overfør bedøvet mus til en nesekegle som fortsetter å levere isofluran. Påfør øyesmøremiddel på musen mens du er ved nesekjeglen, og plasser deretter musen på ryggen. Bruk en bomullsspisset applikator for å bruke depilatorisk krem på området av brystkjertlene du planlegger å injisere.
Gni applikatoren opp og ned over dyrets hud i ønsket område for å hjelpe til med raskere løsning av pelsen. Det er viktig å la kremen stå på musen i så lite tid som mulig for å unngå å brenne huden. Etter 10 til 30 sekunders påføring, bruk varmt vann på gasbind for å fjerne kremen helt.
Bruk to til fire skyllinger for å sikre fullstendig fjerning før du tørker huden med ren gasbind. Kontroller områdene for pelsfjerning for å bekrefte god synlighet og tilgang til brystvorten. Gjenta depilatorisk prosedyre om nødvendig.
Plasser musen i et rent gjenopprettingsbur på en oppvarmingspute for å gjenopprette fra anestesi. Gi en carprofen kopp for å forberede mus i hjemmeburet etter utvinning. Du vil igjen begynne med bedøvelse av dyret ved hjelp av isofluranbedøvelse og flytte musen til en nesekjegle når den er fullt indusert.
Øyesmøremiddel vil bli påført før du legger dyret på ryggen for injeksjoner. Det kan være nyttig å tape ned bena i nærheten av brystkjertlene som vil bli injisert, men er ikke nødvendig. Forbered sprøyten med ønsket injeksjonsvolum pluss en mikroliter i tilfelle noen søler ut etter at nålen er fjernet.
Det kan være nyttig å fylle med ekstra volum for å teste nålen for fri flyt av oppløsningen umiddelbart før injeksjon. Hvis du injiserer mer enn en brystkjertel, kan det spare tid til å forhåndsfylle flere sprøyter hvis tilgjengelig. Pass på at du ikke gjør dette for tidlig hvis løsningen er tilbøyelig til tilstopping når du blir igjen å sitte.
Forbered brystvorten ved å fjerne synlig død hud ved hjelp av fine tipped tang hvis mulig. Det er ikke nødvendig å fjerne all død hud hvis den ikke blokkerer brystvorteåpningen, og den er motstandsdyktig mot tugging. Dette kan noen ganger forårsake skade og hevelse i brystvorten hvis død hud er festet til levende hud for tett.
Med nålens skråkant synlig, sett nålen inn i brystvortens åpning med veiledningshjelp fra de fine tippede tangene. Avhengig av brystvortens lengde og fasthet, kan det ikke alltid være mulig å holde brystvorten mens du styrer i nålen. Det er noen ganger nødvendig å manøvrere brystvorten med nålen for å tillate tang å trekke brystvorten opp over nålen i stedet for å lede nålen ned i brystvorten.
Når nålekanten er helt omgitt av brystvorten og i hovedkanalen, begynner du sakte å injisere løsningen. Ønsket hastighet er ca. 40 mikroliter per minutt. Unngå å injisere raskere enn dette for å forhindre mulig skade på kanaltreet.
Etter fullstendig injeksjon, vent i 30 sekunder før du fjerner nålen fra brystvorten med hjelp fra tangene. Dette vil minimere eventuell lekkasje fra brystvorten. Vurder området for tegn på en mislykket injeksjon.
Et kuppelformet utseende kan indikere en fettputeinjeksjon eller traumer til området. Det er ofte mulig å se at en injeksjon i fettputen oppstår hvis løsningen inneholder fargestoff eller hvis du leter nøye etter doming på injeksjonsstedet som det kan ses her. Fortsett å injisere de gjenværende brystkjertlene som kreves for eksperimentet ditt på lignende måte, og legg merke til injeksjonsvolumer og eventuelle forekomster av lekkasje.
Noen områder av musen kan være vanskeligere å injisere på grunn av problemer som vanskelig håndplassering eller pusteforstyrrelser. For eksempel vil en høyrehendt injektor sannsynligvis ha vanskeligst for å injisere kjertlene på musens øvre høyre side sett her. Disse beveger seg mer på grunn av nærhet til lungene, og det kan være vanskelig å finne god håndplassering med dyrets kropp i veien for å hvile håndleddet på overflaten.
Noen kan synes det er lettere å omplassere musen hvis nesekjeglen tillater det. Ved injeksjon av en etanolholdig oppløsning må det utvises forsiktighet for å unngå systemisk alkoholforgiftning. Dette krever å vite hvor mye etanol som kan injiseres i en økt og administrere sukroseholdig løsning IP under prosedyren for å motvirke effektene.
Etter intraductal prosedyre kan dyr gjenvinnes i et rent bur på en varmepute eller flyttes til mikro-CT-systemet for avbildning av fylte kanaltrær. Musen bør også gjenopprettes etter en hvilken som helst bildeøkt. Etter å ha flyttet det injiserte dyret til mikro-CT-systemet, fortsett å administrere isofluran for å opprettholde anestesi under avbildning.
Det kan være nyttig å standardisere bildeposisjon ved å teipe ned bena i nærheten av stedet som skal avbildes. For eksempel kan det å tappe bakbenene ned i utvidet stilling hindre beinet på beina i å hindre utsikten over de injiserte kjertlene. Å tappe forbenene i en oppover utvidet stilling kan på samme måte hjelpe til med å se de øvre kjertlene.
Vi har også funnet ut at teiping over musens underliv kan bidra til reduksjon av pusteartefakt for underkjertlene. Det er mange akseptable skanneparametere for visualisering av kanaltreet. Det bør alltid utvises forsiktighet for å sikre at strålingsdosen som følge av disse skanningene ikke overskrider strålingsgrensene for en gitt stamme av mus.
Strålingsdosering kan reduseres kraftig ved å se fluoroskopi og merke leveringssuksess i stedet for å skaffe bilder med lengre eksponeringstid. Våre standard skanneparametere er akseptable for gjentatt bildebehandling hvis vi bare anskaffer korte to-minutters standard skanninger. Lengre skanninger med høyere oppløsning på opptil 14 minutter godtas som terminal prosedyre før eutanasi.
Disse lengre skanningene er ikke akseptable for langsgående studier, da de kan forårsake strålingssykdom hos dyret. Dette dyret ble injisert med en etanolløsning som inneholder 100 millimolar tantaloksidkontrast i kjertler fire og ni. Det nåværende oppkjøpet er en 14-minutters høyoppløselig skanning av de injiserte nedre kjertlene.
Fluoroskopi av dyret gjør at vi kan se at kanaltrearkitekturen blir fremhevet av kontrasten i injeksjonsløsningen. Mikro-CT-systemet vi bruker har innebygd programvare som gjør det mulig å lage raske gjengivelser for å vurdere suksessen til injeksjon uten formell analyse. Denne funksjonen har en enkel glidebryter for kontrast som gir rimelig reduksjon fra signal til støy.
Begrensningen for disse gjengivelsene er at de samme signalterskler brukes på hele bildet. Dette gjør at lyse signaler som tydeligvis ikke er en del av kanaltreet, som jern i dietten, forblir i gjengivelsen. Bedre formelle gjengivelser kan gjøres ved hjelp av mer sofistikert analyseprogramvare som tillater segmentering av interesseområdet.
For å få den beste gjengivelsen av det eneste kanaltreet, anbefaler vi å segmentere ut mammaryfettputen for videre bildebehandling. Denne prosessen krever linjesporing av grensene til fettputen gjennom hele tykkelsen på dyret. Vi har funnet ut at sporing av hvert tredje stykke og forplantning av objektet er tilstrekkelig til å fange hele kanalen.
Dette kan være en subjektiv prosess, som krever overholdelse av laboratoriestandarder for sporing for å sikre lignende utdata fra alle individer som analyserer skanninger. Kjennskap til anatomi kan hjelpe med dommersamtaler om hvilke områder som skal inkluderes. Etter å ha forplantet spor, er det da mulig å terskele gjengivelsen innenfor et bestemt område for å vise bare kontrasten i brystkjertelen.
Dette bør være løsningen i kanaltreet, samt eventuell lekkasje i umiddelbar nærhet. En rekkevidde på 300 til 3000 HU har en tendens til å fungere godt når det gjelder tantaloksidholdige løsninger. Et eksempel på en fullstendig behandlet gjengivelse kan ses her i flere aspekter.
Avhengig av hvordan dyret er orientert i mikro-CT, kan det være nødvendig å reorientere DICOM-filer i analyseprogramvaren for å representere intuitiv anatomisk posisjonering med dyrets hode øverst i bildet. Det kan også være vanskelig å avgjøre hvilken kjertel som blir sett hvis du ikke passer på å rotere bildet på lignende måte hver gang. Ytterligere målinger som volum eller lengde kan gjøres når du har opprettet en rekonstruksjon av kanaltreet.
Validering for vellykket levering gjennom denne prosedyren kan ikke bare demonstreres av 3D mikro-CT-gjengivelser som beskrevet her, men også gjennom dual-stain hele fester med injisert Evans blå overlappende hele kanaltreet uthevet med karmin alum. 3D konfokal mikroskopi kan markere arkitekturen til kanaltreet i en ryddet kjertel farget med e-kadherin. Belastning-til-belastning og mus-til-mus variasjon og brystvorte anatomi kan gjøre det mer eller mindre vanskelig å injisere kjertler.
Dette er et eksempel på en ideell brystvorte til injeksjon med høy profil for enkel griping. Brystvorter med lavere profiler, som denne, kan være vanskeligere å kanylere vellykket. Disse forskjellene kan gjøre det mer sannsynlig å oppnå en vellykket injeksjon uten traumer eller doming som sett her eller mer sannsynlig å være mislykket som vist ved kuppelformet utseende av denne fett pad injeksjon.
Når det gjelder forebygging av brystkreft, er det for tiden to hovedtaktikker som brukes. Den første, årvåkne ventingen, innebærer ingen sann intervensjon. Personer som forfølger denne banen overvåkes regelmessig for eventuelle klumper i brystvevet som indikerer at kreftdannelse forekommer.
Sykdomsdeteksjon vil da føre til behandling. Profylaktisk mastektomi er en mer invasiv prosedyre som fjerner alle epitelceller hvorfra brystkreft kan oppstå sammen med det omkringliggende stroma. Denne operasjonen kan ha alvorlige bivirkninger og er sjelden valgt som et profylaktisk alternativ for personer med lav eller moderat risiko for sykdom.
Vår tilnærming innebærer lokal epitelal ablasjon gjennom injeksjon av en ablativ løsning direkte inn i pattedyrets kanaltre. Denne metoden reduserer sikkerhetsskader og vil sannsynligvis være et mer tiltalende alternativ for personer som ikke har alvorlig risiko for sykdom. Tillegg av kontrast for umiddelbar bildebehandling etter injeksjon gjør også dette lett oversettbar til klinikken.
En metode for intraduktiv injeksjon av reagenser for en etanolbasert ablativ løsning på musens brystkanaltre for in vivo-avbildning og forebygging av brystkreft er beskrevet. Injeksjon direkte inn i brystvorteåpningen gjør det mulig å målrette pattedyr epitelceller med minimal sikkerhetsvevsskade.
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved