Name: measurement of tissue non-heme iron content using a bathophenanthroline-based colorimetric assay
Uploaded: 2022-01-31T14:45:00
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この研究は、プロジェクトUIDB/04293/2020の下で、FCT-Fundação para a Ciência e a Tecnologia, I.P.を通じて国家基金によって資金提供されました。

C57BL/6マウスは商業的に購入され、C57BL/6バックグラウンド8のヘプシジンヌル(Hamp1−/−)マウスはソフィー・ヴォーロン(フランス、コーチン研究所)からの親切な贈り物でした。動物は、特定の病原体のない条件下で、温度および光制御された環境下、標準的なげっ歯類のチャウおよび水への自由なアクセスで、i3S動物施設で飼育された。ヨーロッパのスズキ(<em...

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	<li>Muckenthaler, M. U., Rivella, S., Hentze, M. W., Galy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+red+carpet+for+iron+metabolism.">A red carpet for iron metabolism.</a> Cell. 168, 344-361 (2017).</li><li>Pagani, A., Nai, A., Silvestri, L., Camaschella, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepcidin+and+anemia:+A+tight+relationship.">Hepcidin and anemia: A tight relationship.</a> Frontiers in Physiology. 10, 1294 (2019).</li><li>Weiss, G., Ganz, T., Goodnough, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anemia+of+inflammation.">Anemia of inflammation.</a> Blood. 133 (1), 40-50 (2019).</li><li>Altamura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+iron+homeostasis:+Lessons+from+mouse+models.">Regulation of iron homeostasis: Lessons from mouse models.</a> Molecular Aspects of Medicine. 75, 100872 (2020).</li><li>Torrance, J. D., Bothwell, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+measuring+storage+iron+concentrations+in+formalinised+liver+samples.">A simple technique for measuring storage iron concentrations in formalinised liver samples.</a> South African Journal of Medical Sciences. 33 (1), 9-11 (1968).</li><li>Torrence, J. D., Bothwell, T. H., Cook, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+iron+stores.">Tissue iron stores.</a> Methods in Haematology. , 104-109 (1980).</li><li>Rebouche, C. J., Wilcox, C. L., Widness, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microanalysis+of+non-heme+iron+in+animal+tissues.">Microanalysis of non-heme iron in animal tissues.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 58 (3), 239-251 (2004).</li><li>Lesbordes-Brion, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+disruption+of+the+hepcidin+1+gene+results+in+severe+hemochromatosis.">Targeted disruption of the hepcidin 1 gene results in severe hemochromatosis.</a> Blood. 108, 1402-1405 (2006).</li><li>Jumbo-Lucioni, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+genetics+analysis+of+body+weight+and+energy+metabolism+traits+in+Drosophila+melanogaster.">Systems genetics analysis of body weight and energy metabolism traits in Drosophila melanogaster.</a> BMC Genomics. 11, 297 (2010).</li><li>Mandilaras, K., Pathmanathan, T., Missirlis, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iron+Absorption+in+Drosophila+melanogaster.">Iron Absorption in Drosophila melanogaster.</a> Nutrients. 5, 1622-1647 (2013).</li><li>Grundy, M. A., Gorman, N., Sinclair, P. R., Chorney, M. J., Gerhard, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+non-heme+iron+assay+for+animal+tissues.">High-throughput non-heme iron assay for animal tissues.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 59, 195-200 (2004).</li><li>Adrian, W. J., Stevens, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wet+versus+dry+weights+for+heavy+metal+toxicity+determinations+in+duck+liver.">Wet versus dry weights for heavy metal toxicity determinations in duck liver.</a> Journal of Wildlife Diseases. 15, 125-126 (1979).</li></ol>

動物組織中の非ヘム鉄含有量の測定のためのプロトコルが、トーランスおよびBothwell5,6によって最初に記載されたバソフェナントロリンベースの比色アッセイの適応を用いて提供される。この方法の重要なステップは、組織サンプルの乾燥である。酸加水分解によるタンパク質変性および無機鉄の放出;還元剤チオグリコール酸の存在下での第二鉄(<...

鉄は必須微量栄養素であり、酸素輸送、エネルギー生産、DNA合成などの重要な生物学的プロセスに関与するタンパク質の機能に必要です。重要なことに、鉄の過剰と鉄欠乏の両方が人間の健康に非常に有害であり、組織の鉄レベルは細かく調節されています。異常な食事による鉄吸収、鉄欠乏食、反復輸血、慢性炎症は、世界中の何十億人もの人々に影響を与える鉄関連疾患の一般的な原因です1,2,3。
鉄の過負荷または欠乏症の実験動物モデルは、鉄の恒常性の全身および細胞調節に関与するメカニズムに関する我々の知識を進歩させるのに役立ってきた4。過去20年間に達成された実質的な進歩にもかかわらず、多くの重要な側面は依然としてとらえどころのないままです。今後数年間で、動物組織中の総鉄濃度の正確な測定は、鉄生物学分野の研究を進めるための重要なステップであり続けるでしょう。
ほとんどの研究室では、原子吸光分析法(AAS)、誘導結合プラズマ質量分析法(ICP-MS)、または非ヘム鉄とバソフェナントロリン試薬との反応に基づく比色アッセイのいずれかを使用して組織鉄を定量しています。後者は、50年以上前にトーランスとボスウェルによって記述された元の方法に基づいています5,6。この方法の変形は、その後、バソフェナントロリン7の代替としてフェロジンを使用して開発されたが、後者は文献の中で最も広く引用された発色試薬のままである。
選択方法は、多くの場合、利用可能な専門知識とインフラストラクチャによって異なります。AASおよびICP-MSはより感度が高いが、比色アッセイは、以下の重要な利点を提示するため、広く使用されている:i)赤血球に含まれるヘモグロビンに由来するヘム鉄の寄与を除外する。ii)高度な分析スキルや非常に高価な機器を必要としない。iii)元のキュベットベースのアッセイをマイクロプレート形式に適合させることができ、より高いサンプルスループットを可能にする。この研究で提示された比色法は、げっ歯類から魚やショウジョウバエまで、鉄過負荷または鉄欠乏症の様々な実験動物モデルにおける組織非ヘム鉄レベルの変化を定量化するために日常的に使用されている。ここでは、動物組織中の非ヘム鉄含有量を測定するためのプロトコルが、ほとんどの研究室が実装しやすいと感じるべき、シンプルで十分に確立された比色アッセイを使用して提供されています。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 well UV transparent plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82.1581.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td>Kern</td>
			<td>ABJ 220-4M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous sodium acetate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bathophenanthroline sulfonate (4,7-Diphenyl-1,10-phenantroline dissulfonic acid)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B1375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice (Mus musculus)</td>
			<td>Charles River Laboratories</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl iron powder, &#8805;99.5%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>44890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable cuvettes in polymethyl methacrylate (PMMA)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>634-0678P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double distilled, sterile water</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>0082479E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microplate reader</td>
			<td>BioTek Instruments</td>
			<td>FLx800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid, 37%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>258148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave digestion oven and white teflon cups</td>
			<td>CEM</td>
			<td>MDS-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitric acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15687290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Binder</td>
			<td>ED115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodent chow</td>
			<td>Harlan Laboratories</td>
			<td>2014S</td>
			<td>Teklad Global 14% Protein Rodent Maintenance Diet containing 175 mg/kg iron</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sea bass (Dicentrarchus labrax)</td>
			<td>Sonrionansa</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sea bass feed</td>
			<td>Skretting</td>
			<td>L-2 Alterna 1P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single beam UV-Vis spectrophotometer</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>UV mini 1240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thioglycolic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100807</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of tissue non-heme iron content using a bathophenanthroline-based colorimetric assay

鉄は必須の微量栄養素です。鉄の過負荷と欠乏の両方がヒトにとって非常に有害であり、組織の鉄レベルは細かく調節されている。鉄過負荷または欠乏症の実験動物モデルの使用は、鉄恒常性の全身および細胞調節に関与するメカニズムの知識を進歩させるのに役立ってきた。動物組織における総鉄レベルの測定は、一般に、原子吸光分光法または非ヘム鉄とバソフェナントロリン試薬との反応に基づく比色アッセイを用いて行われる。長年にわたり、比色アッセイは、広範囲の動物組織における非ヘム鉄含有量の測定に使用されてきた。原子吸光分光法とは異なり、赤血球に含まれるヘモグロビンに由来するヘム鉄の寄与を除外する。さらに、高度な分析スキルや高価な機器を必要としないため、ほとんどのラボで簡単に実装できます。最後に、比色アッセイはキュベットベースにすることも、マイクロプレート形式に適合させることもできるため、サンプルスループットが向上します。本研究は、鉄過負荷または鉄欠乏症の様々な実験動物モデルにおける組織鉄レベルの変化の検出に適した十分に確立されたプロトコールを提供する。

キュベットと96ウェルマイクロプレートの比較 トーランスおよびBothwell5,6によって最初に記載されたバソフェナントロリン試薬との反応による組織非ヘム鉄の測定は、吸光度読み取りのための分光光度計の使用に依存している。したがって、色原体反応に使用される体積は、通常の分光光度計キュベットのサイズと互換性があります?...

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Measurement of Tissue Non-Heme Iron Content using a Bathophenanthroline-Based Colorimetric Assay

ここでは、動物組織中の非ヘム鉄含有量を測定するためのプロトコルが、ほとんどの実験室で容易に実施できる単純で十分に確立された比色アッセイを使用して提供される。

バソフェナントロリンベースの比色アッセイを用いた組織非ヘム鉄含有量の測定

Iron is an essential micronutrient. Both iron overload and deficiency are highly detrimental to humans, and tissue iron levels are finely regulated. The ...

ここでは、動物組織中の非ヘム含有量を測定するためのプロトコールを提供した。ほとんどの研究室で簡単に実装できるシンプルで確立された比色アッセイを使用します。バソフェナントロリンベースの比色アッセイは、高度なスキルや非常に高価な装置を必要とせず、マイクロプレート形式に適合させてサンプルスループットと費用対効果を高めることができます。このプロトコルは、鉄過負荷または鉄効率の様々な実験動物モデルにおける組織鉄レベルの変化を検出するのに適している。メスの刃で10〜100グラムの重さの組織サンプルを切ることから始めます。パラフィルムの小さな部分の上に分析天秤で正確に計量してください。プラスチックピンセットを使用して、組織片を24ウェルプレートに配置します。65°Cの標準的なインキュベーターで48時間乾燥させます。あるいは、スティックピンセットを使用してウェイド組織片を鉄を含まないテフロンカップに入れ、実験室の電子レンジ消化オーブンで乾燥させる。各乾燥した組織片を分析天秤内のパラフォームの小さな部分の上に置き、正確に計量します。各乾燥組織片を1.5ミリリットルのマイクロ遠心管に移す。酸混合物の照明をチューブに追加し、それを閉じる。ここで組織を省略した以外は同様にして酸ブランクを作製した。チューブを摂氏65度で20時間インキュベートして組織を消化する。室温まで冷却した後、プラスチックチップを取り付けたマイクロピペットを使用して、500マイクロリットルの透明酸抽出物を新しい1.5ミリリットルのマイクロ遠心管に移した。色原体反応を平底96ウェルの透明な未処理ポリスチレンマイクロプレートに直接調製する。室温で15分間インキュベートした。サンプル吸光度をプレートリーダーで波長535ナノメートルで脱イオン水基準に対して測定します。キュベットおよび96ウェルマイクロプレートベースの比色アッセイによる非ヘム鉄の決定がここに示されている。生後6ヶ月の雄の黒人、肝臓、脾臓、心臓、肺および骨髄を含む6匹のマウスからの55の組織サンプルにおけるキュベットベースのおよびマイクロプレートベースの非ヘム鉄レベルとの間の相関をここに示す。2つの方法論間の高い相関関係は、マイクロプレートベースの方法が元のキュベットベースの方法の有効な代替手段であることを示しています。最後に、非ヘム鉄レベルを、塩酸とトリクロロ酢酸の混合物または塩酸単独のいずれかを用いて同じ組織に由来する試料を酸性消化した後、マイクロプレートベースの方法で定量した。高い相関関係は、トリクロロ酢酸が酸消化から放出され得ることを示している。代表的な画像は、バソフェナントロリンベースの比色アッセイで測定された黒6匹の遺伝的背景上の雄の黒6匹野生型マウスおよび雄ヘプシジンノックアウトマウスの肝臓、脾臓、心臓および膵臓における非ヘム鉄レベルを示す。ヘプシジンの破壊は、重度の肝臓、膵臓および心臓の鉄蓄積および脾臓鉄枯渇を伴う鉄沈着表現型のようなヘモクロマトーシスをもたらす。実験的な鉄変調に続く幼い雌のヨーロッパスズキにおける肝臓非ヘム鉄レベルがここに示されている。肝臓の鉄レベルは、鉄処理された動物において大幅に増加した。一方、貧血は肝臓の鉄貯蔵に軽度の減少を引き起こした。代表的な画像は、バソフェナントロリンベースの比色アッセイで測定された生後1ヶ月のショウジョウバエの非ヘム鉄レベルを示す。結果は、20匹のハエの各プールにおける非ヘム鉄含有量または各ハエの推定鉄含有量を示す。フライあたり0.64ミリグラムの平均重量を考慮すると。この手順を試みている間は、すべてのガラスの摩耗を完全にきれいにし、汚染の危険性があるため、金属実験材料が試薬または溶液と接触しないようにすることを忘れないでください。

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