Name: measurement of tissue non-heme iron content using a bathophenanthroline-based colorimetric assay
Uploaded: 2022-01-31T14:45:00
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이 작품은 UIDB/04293/2020 프로젝트에 따라 FCT-Fundação para a Ciência e a Tecnologia, I.P.를 통해 National Fund가 자금을 지원했습니다.

C57BL/6 마우스는 상업적으로 구입하였고, C57BL/6 배경8의 헵시딘-널(Hamp1-/-) 마우스는 소피 발론트(프랑스 코친인스티투트)로부터 일종의 선물이었다. 동물들은 표준 설치류 차우와 물에 자유롭게 접근 할 수있는 온도 및 조명 제어 환경에서 특정 병원체가없는 조건 하에서 i3S 동물 시설에 수용되었습니다. 유럽 농어(Dicentrarchus labrax)는 상업용 어류 농장에서 ?...

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	<li>Muckenthaler, M. U., Rivella, S., Hentze, M. W., Galy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+red+carpet+for+iron+metabolism.">A red carpet for iron metabolism.</a> Cell. 168, 344-361 (2017).</li><li>Pagani, A., Nai, A., Silvestri, L., Camaschella, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepcidin+and+anemia:+A+tight+relationship.">Hepcidin and anemia: A tight relationship.</a> Frontiers in Physiology. 10, 1294 (2019).</li><li>Weiss, G., Ganz, T., Goodnough, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anemia+of+inflammation.">Anemia of inflammation.</a> Blood. 133 (1), 40-50 (2019).</li><li>Altamura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+iron+homeostasis:+Lessons+from+mouse+models.">Regulation of iron homeostasis: Lessons from mouse models.</a> Molecular Aspects of Medicine. 75, 100872 (2020).</li><li>Torrance, J. D., Bothwell, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+measuring+storage+iron+concentrations+in+formalinised+liver+samples.">A simple technique for measuring storage iron concentrations in formalinised liver samples.</a> South African Journal of Medical Sciences. 33 (1), 9-11 (1968).</li><li>Torrence, J. D., Bothwell, T. H., Cook, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+iron+stores.">Tissue iron stores.</a> Methods in Haematology. , 104-109 (1980).</li><li>Rebouche, C. J., Wilcox, C. L., Widness, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microanalysis+of+non-heme+iron+in+animal+tissues.">Microanalysis of non-heme iron in animal tissues.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 58 (3), 239-251 (2004).</li><li>Lesbordes-Brion, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+disruption+of+the+hepcidin+1+gene+results+in+severe+hemochromatosis.">Targeted disruption of the hepcidin 1 gene results in severe hemochromatosis.</a> Blood. 108, 1402-1405 (2006).</li><li>Jumbo-Lucioni, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+genetics+analysis+of+body+weight+and+energy+metabolism+traits+in+Drosophila+melanogaster.">Systems genetics analysis of body weight and energy metabolism traits in Drosophila melanogaster.</a> BMC Genomics. 11, 297 (2010).</li><li>Mandilaras, K., Pathmanathan, T., Missirlis, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iron+Absorption+in+Drosophila+melanogaster.">Iron Absorption in Drosophila melanogaster.</a> Nutrients. 5, 1622-1647 (2013).</li><li>Grundy, M. A., Gorman, N., Sinclair, P. R., Chorney, M. J., Gerhard, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+non-heme+iron+assay+for+animal+tissues.">High-throughput non-heme iron assay for animal tissues.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 59, 195-200 (2004).</li><li>Adrian, W. J., Stevens, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wet+versus+dry+weights+for+heavy+metal+toxicity+determinations+in+duck+liver.">Wet versus dry weights for heavy metal toxicity determinations in duck liver.</a> Journal of Wildlife Diseases. 15, 125-126 (1979).</li></ol>

동물 조직에서 헴철 함량의 측정을 위한 프로토콜이 제공되며, 원래 Torrance 및 Bothwell5,6에 의해 기술된 바토페난트롤린-기반 비색 분석법의 적응을 이용한다. 상기 방법의 중요한 단계는 조직 샘플 건조; 단백질 변성 및 산 가수분해에 의한 무기 철의 방출; 환원제 티오글리콜산의 존재 하에 철(Fe3+)철을 철 상태(Fe2+)로 환원시키고, 바토?...

철분은 산소 수송, 에너지 생산 또는 DNA 합성과 같은 중요한 생물학적 과정에 관여하는 단백질의 기능에 필요한 필수 미량 영양소입니다. 중요한 것은 철분 과잉과 철분 결핍 모두 인체 건강에 매우 해롭고 조직 철분 수치가 미세하게 조절된다는 것입니다. 비정상적인식이 철분 흡수, 철분 결핍식이 요법, 반복적 인 수혈 및 만성 염증은 전 세계 수십억 명의 사람들에게 영향을 미치는 철분 관련 장애의 일반적인 원인입니다1,2,3.
철분 과부하 또는 결핍의 실험 동물 모델은 철분 항상성의 전신 및 세포 조절과 관련된 메커니즘에 대한 우리의 지식을 향상시키는 데 도움이되었습니다4. 지난 이십 년 동안 이루어진 상당한 진전에도 불구하고, 많은 주요 측면은 여전히 애매하다. 앞으로 몇 년 동안 동물 조직의 총 철분 수준을 정확하게 측정하는 것은 철 생물학 분야의 연구를 발전시키는 중요한 단계로 남아있을 것입니다.
대부분의 실험실은 원자 흡수 분광법 (AAS), 유도 결합 플라즈마 질량 분광법 (ICP-MS) 또는 비 헴철과 바스토페난트롤린 시약의 반응을 기반으로 한 비색 분석법으로 조직 철분을 정량화합니다. 후자는 50 년 전에 Torrance와 Bothwell이 묘사 한 원래의 방법을 기반으로합니다.5,6. 이 방법의 변형이 바스토페난트롤린7의 대안으로 페로진을 사용하여 개발되었지만, 후자는 문헌에서 가장 널리 인용 된 발색 시약으로 남아 있습니다.
선택 방법은 종종 사용 가능한 전문 지식과 인프라에 달려 있습니다. AAS 및 ICP-MS가 더 민감하지만, 비색 분석은 다음과 같은 중요한 이점을 제시하기 때문에 널리 사용되고 있습니다 : i) 적혈구에 포함 된 헤모글로빈으로부터 유래 된 헴철의 기여를 배제합니다. ii) 정교한 분석 기술이나 고가의 장비가 필요하지 않습니다. iii) 원래의 큐벳-기반 분석은 마이크로플레이트 포맷에 적응될 수 있고, 더 높은 샘플 처리량을 허용한다. 이 연구에서 제시된 비색 접근법은 설치류에서 물고기 및 초파리에 이르기까지 철분 과부하 또는 철분 결핍의 다양한 실험 동물 모델에서 조직 비 헴 철분 수준의 변화를 정량화하는 데 일상적으로 사용됩니다. 여기서, 동물 조직에서 비헴철 함량을 측정하기 위한 프로토콜이 제공되며, 대부분의 실험실에서 구현하기 쉬운 단순하고 잘 확립된 비색 분석을 사용한다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 well UV transparent plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82.1581.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td>Kern</td>
			<td>ABJ 220-4M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous sodium acetate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bathophenanthroline sulfonate (4,7-Diphenyl-1,10-phenantroline dissulfonic acid)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B1375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice (Mus musculus)</td>
			<td>Charles River Laboratories</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl iron powder, &#8805;99.5%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>44890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable cuvettes in polymethyl methacrylate (PMMA)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>634-0678P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double distilled, sterile water</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>0082479E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microplate reader</td>
			<td>BioTek Instruments</td>
			<td>FLx800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid, 37%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>258148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave digestion oven and white teflon cups</td>
			<td>CEM</td>
			<td>MDS-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitric acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15687290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Binder</td>
			<td>ED115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodent chow</td>
			<td>Harlan Laboratories</td>
			<td>2014S</td>
			<td>Teklad Global 14% Protein Rodent Maintenance Diet containing 175 mg/kg iron</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sea bass (Dicentrarchus labrax)</td>
			<td>Sonrionansa</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sea bass feed</td>
			<td>Skretting</td>
			<td>L-2 Alterna 1P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single beam UV-Vis spectrophotometer</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>UV mini 1240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thioglycolic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100807</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of tissue non-heme iron content using a bathophenanthroline-based colorimetric assay

철분은 필수 미량 영양소입니다. 철분 과부하와 결핍 모두 인간에게 매우 해롭고 조직 철분 수치가 미세하게 조절됩니다. 철분 과부하 또는 결핍의 실험 동물 모델의 사용은 철분 항상성의 전신 및 세포 조절과 관련된 메커니즘에 대한 지식을 향상시키는 데 도움이되었습니다. 동물 조직에서 총 철 수준의 측정은 일반적으로 원자 흡수 분광법 또는 비 헴철과 바토페난트롤린 시약의 반응을 기반으로 한 비색 분석으로 수행됩니다. 수년 동안, 비색 분석은 광범위한 동물 조직에서 비헴철 함량의 측정에 사용되어 왔다. 원자 흡수 분광법과는 달리, 적혈구에 포함 된 헤모글로빈에서 유래 한 헴철의 기여를 배제합니다. 또한 정교한 분석 기술이나 고가의 장비가 필요하지 않으므로 대부분의 실험실에서 쉽게 구현할 수 있습니다. 마지막으로, 비색 분석은 큐벳 기반이거나 마이크로플레이트 형식에 맞게 조정될 수 있으므로 더 높은 샘플 처리량이 가능합니다. 본 연구는 철분 과부하 또는 철분 결핍의 다양한 실험 동물 모델에서 조직 철분 수준의 변화를 검출하는데 적합한 잘 확립된 프로토콜을 제공한다.

큐벳 대 96웰 마이크로플레이트 비교 Torrance 및 Bothwell5,6에 의해 원래 기술된 바토페난트롤린 시약과의 반응에 의한 조직 비헴철의 측정은 흡광도 판독을 위한 분광광도계의 사용에 의존한다. 따라서, 염색체 반응에 사용되는 부피는 일반 분광 광도계 큐벳의 크기와 양립 가능하다. 본 연구는 마이크로플레이트 판독기에서 흡광도 측정을 ...

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Measurement of Tissue Non-Heme Iron Content using a Bathophenanthroline-Based Colorimetric Assay

여기서, 동물 조직에서 헴철 함량을 측정하기 위한 프로토콜이 제공되며, 대부분의 실험실에서 쉽게 구현할 수 있는 간단하고 잘 확립된 비색 분석법을 사용한다.

Bathophenanthroline-based Colorimetric Assay를 이용한 조직 비헴철 함량 측정

Iron is an essential micronutrient. Both iron overload and deficiency are highly detrimental to humans, and tissue iron levels are finely regulated. The ...

여기서 우리는 동물 조직에서 헴이 아닌 내용물을 측정하기위한 프로토콜을 제공했습니다. 대부분의 실험실에서 쉽게 구현할 수있는 간단한 잘 정립 된 비색 분석을 사용합니다. Bathophenanthroline 기반 비색 분석은 정교한 기술이나 고가의 장비가 필요하지 않으며 더 높은 샘플 처리량과 비용 효율성을 위해 마이크로 플레이트 형식에 적용 할 수 있습니다.이 프로토콜은 철분 과부하 또는 철 효율의 다양한 실험 동물 모델에서 조직 철 수준의 변화를 검출하는 데 적합합니다. 10 ~ 100 그램의 조직 샘플을 메스 블레이드로 절단하여 시작하십시오. 작은 파라필름 위에 분석 저울로 정확하게 무게를 재십시오.플라스틱 핀셋을 사용하여 티슈 조각을 24 웰 플레이트에 넣으십시오. 표준 인큐베이터에서 섭씨 65도에서 48 시간 동안 말리십시오. 또는 스틱 핀셋을 사용하여 조직의 웨이드 조각을 철이없는 테프론 컵에 넣고 실험실 전자 레인지 소화 오븐에서 건조시킵니다.말린 각 조직 조각을 분석 저울 내부의 작은 파라폼 조각 위에 놓고 정확하게 무게를 재십시오. 건조된 각 조직 조각을 1.5 밀리리터 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 튜브에 산성 혼합물의 불을 넣고 닫으십시오.여기에서 조직이 생략된 것을 제외하고는 동일한 방법으로 산성 블랭크를 준비한다. 튜브를 섭씨 65도에서 20시간 동안 배양하여 조직을 소화시킨다. 실온으로 냉각한 후 플라스틱 팁이 장착된 마이크로 피펫을 사용하여 500 마이크로리터의 맑은 산 추출물을 새로운 1.5 밀리리터 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.평평한 바닥 96-웰, 투명한 처리되지 않은 폴리스티렌 마이크로 플레이트에 염색체 반응을 직접 준비하십시오. 실온에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트 리더에서 535 나노미터의 파장에서 탈이온수 기준치에 대해 샘플 흡광도를 측정한다.큐벳 및 96-웰 마이크로플레이트 기반 비색 검정에 의한 비헴철의 결정이 여기에 제시되어 있다. 간, 비장, 심장, 폐 및 골수를 포함한 여섯 마리의 마우스로부터의 55개 조직 샘플에서 큐벳 기반 및 마이크로플레이트 기반 비헴철 수준 사이의 상관관계가 여기에 제시되어 있다. 두 방법론 사이의 높은 상관 관계는 마이크로 플레이트 기반 방법이 원래의 큐벳 기반 방법에 대한 유효한 대안임을 나타냅니다.마지막으로, 비헴철 수준은 염산과 트리클로로아세트산 또는 염산 단독의 혼합물로 동일한 조직으로부터 유래된 샘플을 산성 소화시킨 후 마이크로플레이트 기반 방법으로 정량하였다. 높은 상관 관계는 트리클로로 아세트산이 산 소화에서 방출 될 수 있음을 보여줍니다. 대표적인 이미지는 바토페난트롤린-기반 비색 분석법으로 측정된 검정 여섯 개의 유전적 배경에서 수컷 검정 여섯 야생형 마우스 및 수컷 헵시딘 녹아웃 마우스의 간, 비장, 심장 및 췌장에서의 비헴철 수준을 보여준다.헵시딘의 파괴는 심한 간, 췌장 및 심장 철분 축적 및 비장 철분 고갈을 가진 철분 침착 표현형과 같은 혈색소 침착으로 이어집니다. 실험적 철 변조에 따른 청소년 여성 유럽 농어에서의 간장 비헴 철 수준이 여기에 도시되어 있다. 간철분 수치는 철분 처리 동물에서 엄청나게 증가했습니다.빈혈은 간 철분 저장소의 경미한 감소를 일으킨 반면. 대표적인 이미지는 Bathophenanthroline-Based Colorimetric Assay로 측정 된 한 달 된 초파리의 비 헴 철 수준을 보여줍니다. 결과는 20 마리의 파리의 각 풀에서 비 헴철 함량 또는 각 파리의 예상 철 함량을 보여줍니다.비행 당 0.64 밀리그램의 평균 체중을 고려합니다. 이 절차를 시도하는 동안 모든 유리 마모를 철저히 청소하고 금속 실험실 재료가 오염 위험으로 인해 시약 또는 용액과 접촉하지 않도록하십시오.

Research

JoVE Journal

Medicine

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연구

의학

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