Name: measurement of tissue non-heme iron content using a bathophenanthroline-based colorimetric assay
Uploaded: 2022-01-31T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Tissue Non-Heme Iron Content using a Bathophenanthroline-Based Colorimetric Assay at JoVE.com

Este trabajo fue financiado por fondos nacionales a través de FCT-Fundação para a Ciência e a Tecnologia, I.P., en el marco del proyecto UIDB/04293/2020.

Los ratones C57BL/6 fueron comprados comercialmente y los ratones con hepcidina nula (Hamp1−/−) sobre un fondo C57BL/68 fueron un amable regalo de Sophie Vaulont (Institut Cochin, Francia). Los animales fueron alojados en la instalación de animales i3S en condiciones específicas libres de patógenos, en un ambiente controlado por la temperatura y la luz, con libre acceso a chow y agua estándar para roedores. La lubina europea (Dicentrarchus labrax) se compró en...

<ol>
	<li>Muckenthaler, M. U., Rivella, S., Hentze, M. W., Galy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+red+carpet+for+iron+metabolism.">A red carpet for iron metabolism.</a> Cell. 168, 344-361 (2017).</li><li>Pagani, A., Nai, A., Silvestri, L., Camaschella, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepcidin+and+anemia:+A+tight+relationship.">Hepcidin and anemia: A tight relationship.</a> Frontiers in Physiology. 10, 1294 (2019).</li><li>Weiss, G., Ganz, T., Goodnough, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anemia+of+inflammation.">Anemia of inflammation.</a> Blood. 133 (1), 40-50 (2019).</li><li>Altamura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+iron+homeostasis:+Lessons+from+mouse+models.">Regulation of iron homeostasis: Lessons from mouse models.</a> Molecular Aspects of Medicine. 75, 100872 (2020).</li><li>Torrance, J. D., Bothwell, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+measuring+storage+iron+concentrations+in+formalinised+liver+samples.">A simple technique for measuring storage iron concentrations in formalinised liver samples.</a> South African Journal of Medical Sciences. 33 (1), 9-11 (1968).</li><li>Torrence, J. D., Bothwell, T. H., Cook, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+iron+stores.">Tissue iron stores.</a> Methods in Haematology. , 104-109 (1980).</li><li>Rebouche, C. J., Wilcox, C. L., Widness, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microanalysis+of+non-heme+iron+in+animal+tissues.">Microanalysis of non-heme iron in animal tissues.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 58 (3), 239-251 (2004).</li><li>Lesbordes-Brion, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+disruption+of+the+hepcidin+1+gene+results+in+severe+hemochromatosis.">Targeted disruption of the hepcidin 1 gene results in severe hemochromatosis.</a> Blood. 108, 1402-1405 (2006).</li><li>Jumbo-Lucioni, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+genetics+analysis+of+body+weight+and+energy+metabolism+traits+in+Drosophila+melanogaster.">Systems genetics analysis of body weight and energy metabolism traits in Drosophila melanogaster.</a> BMC Genomics. 11, 297 (2010).</li><li>Mandilaras, K., Pathmanathan, T., Missirlis, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iron+Absorption+in+Drosophila+melanogaster.">Iron Absorption in Drosophila melanogaster.</a> Nutrients. 5, 1622-1647 (2013).</li><li>Grundy, M. A., Gorman, N., Sinclair, P. R., Chorney, M. J., Gerhard, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+non-heme+iron+assay+for+animal+tissues.">High-throughput non-heme iron assay for animal tissues.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 59, 195-200 (2004).</li><li>Adrian, W. J., Stevens, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wet+versus+dry+weights+for+heavy+metal+toxicity+determinations+in+duck+liver.">Wet versus dry weights for heavy metal toxicity determinations in duck liver.</a> Journal of Wildlife Diseases. 15, 125-126 (1979).</li></ol>

Se proporciona un protocolo para la medición del contenido de hierro no hemo en tejidos animales, utilizando una adaptación del ensayo colorimétrico basado en batofenantrolina descrito originalmente por Torrance y Bothwell5,6. Los pasos críticos del método son el secado de muestras de tejido; desnaturalización de proteínas y liberación de hierro inorgánico por hidrólisis ácida; reducción del hierro férrico (Fe3+) al estado ferroso (Fe...

El hierro es un micronutriente esencial, necesario para la función de las proteínas involucradas en procesos biológicos cruciales como el transporte de oxígeno, la producción de energía o la síntesis de ADN. Es importante destacar que tanto el exceso de hierro como la deficiencia de hierro son altamente perjudiciales para la salud humana, y los niveles de hierro en los tejidos están finamente regulados. La absorción anormal de hierro en la dieta, las dietas deficientes en hierro, las transfusiones de sangre repetidas y la inflamación crónica son causas comunes de trastornos asociados con el hierro que afectan a miles de millones de personas en todo el mundo1,2,3.
Los modelos animales experimentales de sobrecarga o deficiencia de hierro han sido fundamentales para avanzar en nuestro conocimiento de los mecanismos implicados en la regulación sistémica y celular de la homeostasis del hierro4. A pesar de los progresos sustanciales realizados durante las dos últimas décadas, muchos aspectos clave siguen siendo difíciles de alcanzar. En los próximos años, la medición precisa de los niveles totales de hierro en los tejidos animales seguirá siendo un paso crítico para avanzar en la investigación en el campo de la biología del hierro.
La mayoría de los laboratorios cuantifican el hierro tisular con espectroscopia de absorción atómica (AAS), espectrometría de masas de plasma acoplada inductivamente (ICP-MS) o un ensayo colorimétrico basado en la reacción del hierro no hemo con un reactivo de batofenantrolina. Este último se basa en el método original descrito por Torrance y Bothwell hace más de 50 años5,6. Si bien posteriormente se desarrolló una variación de este método empleando ferrozina como alternativa a la batofenantrolina7, este último sigue siendo el reactivo cromogénico más citado en la literatura.
El método de elección a menudo depende de la experiencia y la infraestructura disponibles. Si bien AAS e ICP-MS son más sensibles, el ensayo colorimétrico sigue siendo ampliamente utilizado porque presenta las siguientes ventajas importantes: i) excluye la contribución de hierro hemo derivado de la hemoglobina contenida en los glóbulos rojos; ii) no requiere habilidades analíticas sofisticadas o equipos altamente costosos; y iii) el ensayo original basado en cubeta se puede adaptar a un formato de microplaca, lo que permite un mayor rendimiento de la muestra. El enfoque colorimétrico presentado en este trabajo se utiliza rutinariamente para cuantificar alteraciones en los niveles de hierro no hemo tisular en una variedad de modelos animales experimentales de sobrecarga o deficiencia de hierro, desde roedores hasta peces y moscas de la fruta. Aquí, se proporciona un protocolo para la medición del contenido de hierro no hemo en los tejidos animales, utilizando un ensayo colorimétrico simple, bien establecido que la mayoría de los laboratorios deberían encontrar fácil de implementar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 well UV transparent plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82.1581.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td>Kern</td>
			<td>ABJ 220-4M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous sodium acetate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bathophenanthroline sulfonate (4,7-Diphenyl-1,10-phenantroline dissulfonic acid)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B1375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice (Mus musculus)</td>
			<td>Charles River Laboratories</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl iron powder, &#8805;99.5%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>44890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable cuvettes in polymethyl methacrylate (PMMA)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>634-0678P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double distilled, sterile water</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>0082479E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microplate reader</td>
			<td>BioTek Instruments</td>
			<td>FLx800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid, 37%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>258148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave digestion oven and white teflon cups</td>
			<td>CEM</td>
			<td>MDS-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitric acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15687290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Binder</td>
			<td>ED115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodent chow</td>
			<td>Harlan Laboratories</td>
			<td>2014S</td>
			<td>Teklad Global 14% Protein Rodent Maintenance Diet containing 175 mg/kg iron</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sea bass (Dicentrarchus labrax)</td>
			<td>Sonrionansa</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sea bass feed</td>
			<td>Skretting</td>
			<td>L-2 Alterna 1P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single beam UV-Vis spectrophotometer</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>UV mini 1240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thioglycolic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100807</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of tissue non-heme iron content using a bathophenanthroline-based colorimetric assay

El hierro es un micronutriente esencial. Tanto la sobrecarga como la deficiencia de hierro son altamente perjudiciales para los seres humanos, y los niveles de hierro en los tejidos están finamente regulados. El uso de modelos animales experimentales de sobrecarga o deficiencia de hierro ha sido fundamental para avanzar en el conocimiento de los mecanismos implicados en la regulación sistémica y celular de la homeostasis del hierro. La medición de los niveles totales de hierro en tejidos animales se realiza comúnmente con espectroscopia de absorción atómica o con un ensayo colorimétrico basado en la reacción del hierro no hemo con un reactivo de batofenolantrolina. Durante muchos años, el ensayo colorimétrico se ha utilizado para la medición del contenido de hierro no hemo en una amplia gama de tejidos animales. A diferencia de la espectroscopia de absorción atómica, excluye la contribución de hierro hemo derivado de la hemoglobina contenida en los glóbulos rojos. Además, no requiere habilidades analíticas sofisticadas ni equipos altamente costosos, y por lo tanto se puede implementar fácilmente en la mayoría de los laboratorios. Finalmente, el ensayo colorimétrico puede basarse en cubetas o adaptarse a un formato de microplaca, lo que permite un mayor rendimiento de la muestra. El presente trabajo proporciona un protocolo bien establecido que es adecuado para la detección de alteraciones en los niveles de hierro tisular en una variedad de modelos animales experimentales de sobrecarga o deficiencia de hierro.

Comparación de cubeta versus microplacas de 96 pocillos La medición del hierro tisular no hemo por reacción con un reactivo de batofenolantrolina descrito originalmente por Torrance y Bothwell5,6 se basa en el uso de un espectrofotómetro para la lectura de la absorbancia. Por lo tanto, los volúmenes empleados en la reacción cromática son compatibles con el tamaño de una cubeta de espectrofotómetro regular. El presente trabajo describe...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Tissue Non-Heme Iron Content using a Bathophenanthroline-Based Colorimetric Assay at JoVE.com

Measurement of Tissue Non-Heme Iron Content using a Bathophenanthroline-Based Colorimetric Assay

Aquí, se proporciona un protocolo para la medición del contenido de hierro no hemo en tejidos animales, utilizando un ensayo colorimétrico simple y bien establecido que se puede implementar fácilmente en la mayoría de los laboratorios.

Medición del contenido de hierro no hemo en tejidos utilizando un ensayo colorimétrico basado en batofenantrolina

Iron is an essential micronutrient. Both iron overload and deficiency are highly detrimental to humans, and tissue iron levels are finely regulated. The ...

Aquí hemos proporcionado un protocolo para medir el contenido no hemo en tejidos animales. Utilizando un ensayo colorimétrico simple y bien establecido que se puede implementar fácilmente en la mayoría de los laboratorios. El ensayo colorimétrico basado en batofenantrolina no requiere habilidades sofisticadas ni equipos altamente costosos y se puede adaptar al formato de microplaca para un mayor rendimiento de la muestra y rentabilidad.Este protocolo es adecuado para detectar alteraciones en los niveles de hierro tisular en una variedad de modelos animales experimentales de sobrecargas de hierro o eficiencia del hierro. Comience cortando una muestra de tejido que pese de 10 a 100 gramos con una cuchilla de bisturí. Péselo con precisión en una balanza analítica sobre un pequeño trozo de parafilm.Use pinzas de plástico para colocar el pedazo de tejido en una placa de 24 pocillos. Déjelo secar en una incubadora estándar a 65 grados centígrados durante 48 horas. Alternativamente, coloque el pedazo de tejido con pinzas de palo en una taza de teflón sin hierro y séquelo en el horno de digestión por microondas del laboratorio.Coloque cada pieza seca de tejido sobre una pequeña pieza de paraforma dentro de una balanza analítica y pésela con precisión. Transfiera cada pieza seca de tejido a un tubo de micro centrífuga de 1,5 mililitros. Agregue una luz de la mezcla ácida al tubo y ciérrelo.Prepare un ácido en blanco de la misma manera, excepto que el tejido se omite aquí. Incubar los tubos a 65 grados centígrados durante 20 horas para digerir el tejido. Después de enfriar a temperatura ambiente, use una micro pipeta equipada con puntas de plástico para transferir 500 microlitros del extracto de ácido transparente a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.Prepare las reacciones de cromógeno directamente en las microplacas de poliestireno transparentes sin tratar de fondo plano de 96 pocillos. Incubado a temperatura ambiente durante 15 minutos. Mida la absorbancia de la muestra en un lector de placas a una longitud de onda de 535 nanómetros contra una referencia de agua desionizada.La determinación del hierro no hemo mediante los ensayos colorimétricos basados en cubeta y microplacas de 96 pocillos se muestran aquí. La correlación entre los niveles de hierro no hemo a base de cubeta y basado en microplacas en 55 muestras de tejido de seis meses de edad macho negro, seis ratones, incluyendo hígado, bazo, corazón, pulmones y médula ósea se muestran aquí. La alta correlación entre las dos metodologías indica que el método basado en microplacas es una alternativa válida al método original basado en cubetas.Finalmente, los niveles de hierro no hemo se cuantificaron con el método basado en microplacas después de la digestión ácida de la muestra derivada de los mismos tejidos con una mezcla de ácido clorhídrico y ácido tricloroacético o ácido clorhídrico solo. La alta correlación muestra que el ácido tricloroacético puede ser emitido por la digestión ácida. La imagen representativa muestra los niveles de hierro no hemo en el hígado, el bazo, el corazón y el páncreas de ratones machos negros de seis tipos salvajes y ratones machos de hepcidina knockout en fondo genético de seis negros medidos con el ensayo colorimétrico basado en batofenolantrolina.La interrupción de la hepcidina conduce a una hemocromatosis como el fenotipo de deposición de hierro con acumulación severa de hierro hepático, pancreático y cardíaco y agotamiento esplénico de hierro. Aquí se muestran los niveles hepáticos de hierro no hemo en lubina europea hembra juvenil después de la modulación experimental del hierro. Los niveles de hierro hepático aumentaron masivamente en animales tratados con hierro.Mientras que la anemia causó una reducción leve en las reservas hepáticas de hierro. Las imágenes representativas muestran los niveles de hierro no hemo en Drosophila de un mes de edad medidos con un ensayo colorimétrico basado en batofenantrolina. Los resultados muestran el contenido de hierro no hemo en cada grupo de 20 moscas o el contenido estimado de hierro de cada mosca.Considerando un peso promedio de 0.64 miligramos por mosca. Al intentar este procedimiento, recuerde limpiar a fondo todo el desgaste del vidrio y no permita que los materiales metálicos de laboratorio entren en contacto con ningún reactivo o solución debido al riesgo de contaminación.

Research

JoVE Journal

Medicine

Accurate and Simple Measurement of the Pro-inflammatory Cytokine IL-1&beta; using a Whole Blood Stimulation Assay

Accurate and Simple Measurement of the Pro-inflammatory Cytokine IL-1&#946; using a Whole Blood Stimulation Assay

La medición precisa y simple de la citoquina pro-inflamatoria IL-1β mediante un análisis de sangre entera estimulación

Inflammatory processes resulting from the secretion of soluble mediators by immune cells, lead to various manifestations in skin, joints and other tissues ...

Investigación

Medicina

Segmentation and Measurement of Fat Volumes in Murine Obesity Models Using X-ray Computed Tomography

La segmentación y la medición de los volúmenes de grasa en modelos murinos de obesidad Usando rayos X de tomografía computarizada

Obesity is associated with increased morbidity and mortality as well as reduced metrics in quality of life.1 Both environmental and genetic factors are ...

Epidural Intracranial Pressure Measurement in Rats Using a Fiber-optic Pressure Transducer

Medición de la presión intracraneal epidural en ratas, utilizando un transductor de presión de fibra óptica

Elevated intracranial pressure (ICP) is a significant problem in several forms of ischemic brain injury including stroke, traumatic brain injury and ...

Transplantation of Pulmonary Valve Using a Mouse Model of Heterotopic Heart Transplantation

El trasplante de la válvula pulmonar Utilizando un modelo de ratón de heterotópico trasplante cardiaco

Tissue engineered heart valves, especially decellularized valves, are starting to gain momentum in clinical use of reconstructive surgery with mixed ...

A High-content In Vitro Pancreatic Islet &#946;-cell Replication Discovery Platform

A High-content In Vitro Pancreatic Islet &#946;-cell Replication Discovery Platform

Un alto contenido<em&gt; In Vitro</em&gt; Islotes pancreáticos de células β plataforma de descubrimiento de replicación

Loss of insulin-producing &#946;-cells is a central feature of diabetes. While a variety of potential replacement therapies are being explored, expansion ...

Absolute Quantification of A&#946;1-42 in CSF Using a Mass Spectrometric Reference Measurement Procedure

La cuantificación absoluta de Aß<sub&gt; 1-42</sub&gt; En el LCR utilizando un procedimiento de medición de referencia de espectrometría de masas

Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disease among the elderly and accounts for 60-80% of all cases of dementia. Currently, the ...

Tracking Superparamagnetic Iron Oxide-labeled Mesenchymal Stem Cells using MRI after Intranasal Delivery in a Traumatic Brain Injury Murine Model

Seguimiento de células madre mesenquimales con etiqueta de óxido de hierro superparamagnético mediante RMN después de la entrega intranasal en un modelo de murino de lesión cerebral traumática

Stem cell-based therapies for brain injuries, such as traumatic brain injury (TBI), are a promising approach for clinical trials. However, technical ...

Segmentation and Linear Measurement for Body Composition Analysis using Slice-O-Matic and Horos

Segmentación y medición lineal para el análisis de la composición corporal utilizando Slice-O-Matic y Horos

Body composition is associated with risk of disease progression and treatment complications in a variety of conditions. Therefore, quantification of ...

Measurement of Tissue Oxygenation Using Near-Infrared Spectroscopy in Patients Undergoing Hemodialysis

Medición de la oxigenación tisular mediante espectroscopia de infrarrojo cercano en pacientes sometidos a hemodiálisis

Near-infrared spectroscopy (NIRS) has recently been applied as a tool to measure regional oxygen saturation (rSO2), a marker of tissue oxygenation, in ...

Human Subcutaneous Adipose Tissue Sampling Using a Mini-Liposuction Technique

Muestreo de tejido adiposo subcutáneo humano mediante una técnica de mini-liposucción

Studies on adipose tissue are useful in understanding metabolic and other conditions. Human subcutaneous adipose tissue is accessible. With appropriate ...