Name: measurement of tissue non-heme iron content using a bathophenanthroline-based colorimetric assay
Uploaded: 2022-01-31T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Tissue Non-Heme Iron Content using a Bathophenanthroline-Based Colorimetric Assay at JoVE.com

Detta arbete finansierades av nationella fonder genom FCT-Fundação para a Ciência e a Tecnologia, I.P., under projektet UIDB/04293/2020.

C57BL/6 möss köptes kommersiellt och hepcidin-null (Hamp1−/−) möss på en C57BL/6 bakgrund8 var en snäll gåva från Sophie Vaulont (Institut Cochin, Frankrike). Djur hölls på i3S djuranläggning under specifika patogenfria förhållanden, i en temperatur- och ljuskontrollerad miljö, med fri tillgång till standard gnagare chow och vatten. Europeisk havsabborre (Dicentrarchus labrax) köptes från en kommersiell fiskodling och inhystes på ICBAS djuranläggn...

<ol>
	<li>Muckenthaler, M. U., Rivella, S., Hentze, M. W., Galy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+red+carpet+for+iron+metabolism.">A red carpet for iron metabolism.</a> Cell. 168, 344-361 (2017).</li><li>Pagani, A., Nai, A., Silvestri, L., Camaschella, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepcidin+and+anemia:+A+tight+relationship.">Hepcidin and anemia: A tight relationship.</a> Frontiers in Physiology. 10, 1294 (2019).</li><li>Weiss, G., Ganz, T., Goodnough, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anemia+of+inflammation.">Anemia of inflammation.</a> Blood. 133 (1), 40-50 (2019).</li><li>Altamura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+iron+homeostasis:+Lessons+from+mouse+models.">Regulation of iron homeostasis: Lessons from mouse models.</a> Molecular Aspects of Medicine. 75, 100872 (2020).</li><li>Torrance, J. D., Bothwell, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+measuring+storage+iron+concentrations+in+formalinised+liver+samples.">A simple technique for measuring storage iron concentrations in formalinised liver samples.</a> South African Journal of Medical Sciences. 33 (1), 9-11 (1968).</li><li>Torrence, J. D., Bothwell, T. H., Cook, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+iron+stores.">Tissue iron stores.</a> Methods in Haematology. , 104-109 (1980).</li><li>Rebouche, C. J., Wilcox, C. L., Widness, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microanalysis+of+non-heme+iron+in+animal+tissues.">Microanalysis of non-heme iron in animal tissues.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 58 (3), 239-251 (2004).</li><li>Lesbordes-Brion, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+disruption+of+the+hepcidin+1+gene+results+in+severe+hemochromatosis.">Targeted disruption of the hepcidin 1 gene results in severe hemochromatosis.</a> Blood. 108, 1402-1405 (2006).</li><li>Jumbo-Lucioni, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+genetics+analysis+of+body+weight+and+energy+metabolism+traits+in+Drosophila+melanogaster.">Systems genetics analysis of body weight and energy metabolism traits in Drosophila melanogaster.</a> BMC Genomics. 11, 297 (2010).</li><li>Mandilaras, K., Pathmanathan, T., Missirlis, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iron+Absorption+in+Drosophila+melanogaster.">Iron Absorption in Drosophila melanogaster.</a> Nutrients. 5, 1622-1647 (2013).</li><li>Grundy, M. A., Gorman, N., Sinclair, P. R., Chorney, M. J., Gerhard, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+non-heme+iron+assay+for+animal+tissues.">High-throughput non-heme iron assay for animal tissues.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 59, 195-200 (2004).</li><li>Adrian, W. J., Stevens, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wet+versus+dry+weights+for+heavy+metal+toxicity+determinations+in+duck+liver.">Wet versus dry weights for heavy metal toxicity determinations in duck liver.</a> Journal of Wildlife Diseases. 15, 125-126 (1979).</li></ol>

Ett protokoll för mätning av icke-heme järnhalten i djurvävnader tillhandahålls, med hjälp av en anpassning av bathophenanthroline-baserade kolorimetrisk analys som ursprungligen beskrevs av Torrance och Bothwell5,6. De kritiska stegen i metoden är vävnadstorkning; Protein denaturering och frisättning av oorganiskt järn genom syrahydrolys; Reduktion av järn (Fe3+) till järntillståndet (Fe2+) i närvaro av reduktionsmedlet tioogl...

Järn är ett viktigt mikronäringsmannat som krävs för funktionen hos proteiner som är involverade i viktiga biologiska processer som syretransport, energiproduktion eller DNA-syntes. Viktigt är att både järnöverskott och järnbrist är mycket skadliga för människors hälsa, och vävnadsjärnnivåerna är fint reglerade. Onormal järnabsorption via kosten, järnbrist, upprepade blodtransfusioner och kronisk inflammation är vanliga orsaker till järnrelaterade sjukdomar som påverkar miljarder människor över hela världen1,2,3.
Experimentella djurmodeller av järnöverbelastning eller brist har varit avgörande för att öka vår kunskap om de mekanismer som är involverade i systemisk och cellulär reglering av järnhomeostas4. Trots de betydande framsteg som gjorts under de senaste två decennierna är många viktiga aspekter fortfarande svårfångade. Under de kommande åren kommer den exakta mätningen av totala järnnivåer i djurvävnader att förbli ett kritiskt steg för att främja forskningen inom järnbiologiområdet.
De flesta laboratorier kvantifierar vävnadsjärn med antingen atomabsorptionsspektroskopi (AAS), induktivt kopplad plasmamasspektrometri (ICP-MS) eller en kolorimetrisk analys baserad på reaktionen av icke-heme järn med en bathophenanthroline reagens. Den senare är baserad på den ursprungliga metoden som beskrevs av Torrance och Bothwell för över 50 år sedan5,6. Medan en variation av denna metod senare utvecklades med ferrozin som ett alternativ till bathophenanthroline7, den senare är fortfarande den mest citerade chromogenic reagens i litteraturen.
Valmetoden beror ofta på tillgänglig expertis och infrastruktur. Medan AAS och ICP-MS är känsligare, är den kolorimetriska analysen fortfarande allmänt använd eftersom den ger följande viktiga fördelar: i) det utesluter bidraget från heme järn som härrör från hemoglobin som finns i röda blodkroppar; ii) Det kräver inte sofistikerade analytiska färdigheter eller mycket dyr utrustning. iii) Den ursprungliga cuvettebaserade analysen kan anpassas till ett mikroplattaformat, vilket möjliggör högre provgenomströmning. Det kolorimetriska tillvägagångssätt som presenteras i detta arbete används rutinmässigt för att kvantifiera förändringar i vävnadsjärnnivåer i en mängd olika experimentella djurmodeller av järnöverbelastning eller järnbrist, från gnagare till fisk och fruktfluga. Här tillhandahålls ett protokoll för mätning av icke-heme järnhalten i djurvävnader, med hjälp av en enkel, väletablerad, kolorimetrisk analys som de flesta laboratorier bör hitta lätt att genomföra.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 well UV transparent plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82.1581.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td>Kern</td>
			<td>ABJ 220-4M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous sodium acetate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bathophenanthroline sulfonate (4,7-Diphenyl-1,10-phenantroline dissulfonic acid)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B1375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice (Mus musculus)</td>
			<td>Charles River Laboratories</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl iron powder, &#8805;99.5%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>44890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable cuvettes in polymethyl methacrylate (PMMA)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>634-0678P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double distilled, sterile water</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>0082479E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microplate reader</td>
			<td>BioTek Instruments</td>
			<td>FLx800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid, 37%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>258148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave digestion oven and white teflon cups</td>
			<td>CEM</td>
			<td>MDS-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitric acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15687290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Binder</td>
			<td>ED115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodent chow</td>
			<td>Harlan Laboratories</td>
			<td>2014S</td>
			<td>Teklad Global 14% Protein Rodent Maintenance Diet containing 175 mg/kg iron</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sea bass (Dicentrarchus labrax)</td>
			<td>Sonrionansa</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sea bass feed</td>
			<td>Skretting</td>
			<td>L-2 Alterna 1P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single beam UV-Vis spectrophotometer</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>UV mini 1240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thioglycolic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100807</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of tissue non-heme iron content using a bathophenanthroline-based colorimetric assay

Järn är ett viktigt mikronäringsmannat. Både järnöverbelastning och brist är mycket skadliga för människor, och vävnadsjärnnivåerna är fint reglerade. Användningen av experimentella djurmodeller av järnöverbelastning eller brist har varit avgörande för att öka kunskapen om de mekanismer som är involverade i systemisk och cellulär reglering av järnhomeostas. Mätningen av totala järnnivåer i djurvävnader utförs vanligen med atomabsorptionsspektroskopi eller med en kolorimetrisk analys baserad på reaktionen av icke-heme järn med ett bathophenanthroline reagens. Under många år har kolorimetrisk analys använts för mätning av icke-heme järnhalten i ett brett spektrum av djurvävnader. Till skillnad från atomabsorptionsspektroskopi utesluter det bidraget från heme järn som härrör från hemoglobin som finns i röda blodkroppar. Dessutom kräver det inte sofistikerade analytiska färdigheter eller mycket dyr utrustning, och kan därför enkelt implementeras i de flesta laboratorier. Slutligen kan den kolorimetriska analysen antingen vara cuvette-baserad eller anpassad till ett mikroplate-format, vilket möjliggör högre provgenomströmning. Det nuvarande arbetet ger ett väletablerat protokoll som lämpar sig för detektion av förändringar i vävnadsjärnnivåer i en mängd olika experimentella djurmodeller av järnöverbelastning eller järnbrist.

Cuvette kontra 96-brunns mikroplatta jämförelse Mätningen av vävnads icke-heme järn genom reaktion med en bathophenanthroline reagens ursprungligen beskrivs av Torrance och Bothwell5,6 bygger på användning av en spektrofotometer för absorbansavläsning. Därför är de volymer som används i kromogenreaktionen kompatibla med storleken på en vanlig spektrofotometer cuvette. Detta arbete beskriver en metod anpassning där kromogen reakt...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Tissue Non-Heme Iron Content using a Bathophenanthroline-Based Colorimetric Assay at JoVE.com

Measurement of Tissue Non-Heme Iron Content using a Bathophenanthroline-Based Colorimetric Assay

Här tillhandahålls ett protokoll för mätning av icke-heme järnhalten i djurvävnader, med hjälp av en enkel, väletablerad kolorimetrisk analys som enkelt kan implementeras i de flesta laboratorier.

Mätning av vävnadsinnehåll utan heme järn med hjälp av en Bathophenanthroline-baserad kolorimetrisk analys

Iron is an essential micronutrient. Both iron overload and deficiency are highly detrimental to humans, and tissue iron levels are finely regulated. The ...

Här har vi tillhandahållit ett protokoll för mätning av icke-Heme-innehållet i djurvävnader. Med hjälp av en enkel väletablerad kolorimetrisk analys som enkelt kan implementeras i de flesta laboratorier. Bathophenanthroline-baserade kolorimetrisk analys kräver inte sofistikerade färdigheter eller mycket dyr utrustning och kan anpassas till mikroplattaformat för högre provgenomströmning och kostnadseffektivitet.Detta protokoll är lämpligt för att upptäcka förändringar i vävnadsjärnnivåer i en mängd olika experimentella djurmodeller av järnöverbelastningar eller järneffektivitet. Börja med att skära ett vävnadsprov som väger 10 till 100 gram med ett skalpellblad. Väg den noggrant i en analytisk balans över en liten bit parafilm.Använd pincett av plast för att placera vävnadsbiten i en 24-brunnsplatta. Låt det torka på en standardinkubator vid 65 grader celsius i 48 timmar. Alternativt kan du placera vaddbiten med stick pincett i en järnfri Teflonkopp och torka den i laboratorie mikrovågsugnens matsmältningsugn.Placera varje torkad bit vävnad över en liten bit paraform inuti en analytisk balans och väg den noggrant. Överför varje torkad bit vävnad till ett 1,5 ml mikrocentrifugerrör. Tillsätt en tänd syrablandning till röret och stäng den.Förbered en syra tom på samma sätt förutom att vävnaden utelämnas här. Inkubera rören vid 65 grader celsius i 20 timmar för att smälta vävnaden. Efter kylning till rumstemperatur använd en mikropipett utrustad med plastspetsar för att överföra 500 mikroliter av klarsyraextraktet till ett nytt 1,5 milliliter mikrocentrifugerrör.Förbered kromogenreaktioner direkt i den platta botten 96-väl, klara obehandlade polystyren mikroplattor. Inkuberad rumstemperatur i 15 minuter. Mät provabsorbent i en plattläsare vid en våglängd på 535 nanometer mot en avjoniserad vattenreferens.Bestämning av icke-heme järn av cuvette och 96-well microplate baserade kolorimetriska analyser visas här. Korrelationen mellan cuvettebaserad och mikroplatta baserad icke-heme järnnivåer i 55 vävnad prover från sex månader gamla manliga svart, sex möss, inklusive lever, mjälte, hjärta, lungor och benmärg visas här. Den höga korrelationen mellan de två metoderna tyder på att den mikroplattabaserade metoden är ett giltigt alternativ till den ursprungliga cuvettebaserade metoden.Slutligen kvantifierades icke-heme järnnivåer med den mikroplatta baserade metoden efter sur rötning av prov som härrör från samma vävnader med antingen en blandning av saltsyra och trikloreättisk syra eller saltsyra ensam. Den höga korrelationen visar att trikloracetic syra kan avges från syra matsmältningen. Den representativa bilden visar icke-heme järnnivåer i lever, mjälte, hjärta och bukspottkörteln av manliga svarta sex vilda typ möss och han han hepcidin knockout möss på svart sex genetisk bakgrund mätt med Bathophenanthroline-baserade Colorimetric Assay.Störningen av hepcidin leder till en hemochromatosis som järn deposition fenotyp med allvarliga lever, bukspottskörteln och hjärt järn ackumulering och splenic järn utarmning. Leverjärnnivåer utan heme i juvenil kvinnlig europeisk havsabborre efter experimentell järnmodulering visas här. Leverjärnnivåerna ökade kraftigt hos järnbehandlade djur.Medan anemi orsakade en mild minskning av lever järnlagren. De representativa bilderna visar icke-heme järnnivåer i en månad gammal Drosophila mätt med en Bathophenanthroline-baserad kolimetrisk analys. Resultaten visar järnhalten i varje pool med 20 flugor eller den uppskattade järnhalten i varje fluga.Med tanke på en genomsnittlig vikt på 0,64 milligram per fluga. När du försöker denna procedur kom ihåg att noggrant rengöra allt glasslitage och låt inte de metalliska laboratoriematerialen komma i kontakt med något reagens eller lösning på grund av risken för kontaminering.

Research

JoVE Journal

Medicine

Accurate and Simple Measurement of the Pro-inflammatory Cytokine IL-1&beta; using a Whole Blood Stimulation Assay

Accurate and Simple Measurement of the Pro-inflammatory Cytokine IL-1&#946; using a Whole Blood Stimulation Assay

Noggrann och enkel mätning av pro-inflammatoriska cytokin IL-1β med hjälp av en hel analys Blood stimulering

Inflammatory processes resulting from the secretion of soluble mediators by immune cells, lead to various manifestations in skin, joints and other tissues ...

Segmentation and Measurement of Fat Volumes in Murine Obesity Models Using X-ray Computed Tomography

Segmentering och Mätning av FAT-volymer i murina fetma modeller med hjälp av X-ray datortomografi

Obesity is associated with increased morbidity and mortality as well as reduced metrics in quality of life.1 Both environmental and genetic factors are ...

Epidural Intracranial Pressure Measurement in Rats Using a Fiber-optic Pressure Transducer

Epidural Intrakraniell tryckmätning i råttor Använda en fiberoptisk Tryckgivarpaket

Elevated intracranial pressure (ICP) is a significant problem in several forms of ischemic brain injury including stroke, traumatic brain injury and ...

Transplantation of Pulmonary Valve Using a Mouse Model of Heterotopic Heart Transplantation

Transplantation av pulmonell ventil med hjälp av en musmodell av Heterotopisk hjärttransplantation

Tissue engineered heart valves, especially decellularized valves, are starting to gain momentum in clinical use of reconstructive surgery with mixed ...

A High-content In Vitro Pancreatic Islet &#946;-cell Replication Discovery Platform

A High-content In Vitro Pancreatic Islet &#946;-cell Replication Discovery Platform

En hög halt<em&gt; In Vitro</em&gt; Pancreatic Islet β-cell replikering Discovery Platform

Loss of insulin-producing &#946;-cells is a central feature of diabetes. While a variety of potential replacement therapies are being explored, expansion ...

Absolute Quantification of A&#946;1-42 in CSF Using a Mass Spectrometric Reference Measurement Procedure

Absolut kvantifiering av A-beta<sub&gt; 1-42</sub&gt; I CSF med hjälp av en Masspektrometrisk Reference Measurement ordningen

Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disease among the elderly and accounts for 60-80% of all cases of dementia. Currently, the ...

Tracking Superparamagnetic Iron Oxide-labeled Mesenchymal Stem Cells using MRI after Intranasal Delivery in a Traumatic Brain Injury Murine Model

Spårning superparamagnetiska järnoxid-märkta mesenkymala stamceller med MRT efter intranasal leverans i en traumatisk hjärnskada murin modell

Stem cell-based therapies for brain injuries, such as traumatic brain injury (TBI), are a promising approach for clinical trials. However, technical ...

Segmentation and Linear Measurement for Body Composition Analysis using Slice-O-Matic and Horos

Segmentering och linjär mätning för kroppssammansättningsanalys med slice-O-Matic och Horos

Body composition is associated with risk of disease progression and treatment complications in a variety of conditions. Therefore, quantification of ...

Measurement of Tissue Oxygenation Using Near-Infrared Spectroscopy in Patients Undergoing Hemodialysis

Mätning av vävnadssyresättning med hjälp av nära infraröd spektroskopi hos patienter som genomgår hemodialys

Near-infrared spectroscopy (NIRS) has recently been applied as a tool to measure regional oxygen saturation (rSO2), a marker of tissue oxygenation, in ...

Human Subcutaneous Adipose Tissue Sampling Using a Mini-Liposuction Technique

Humant subkutant fettvävnadsprovtagning med hjälp av en minifettsugningsteknik

Studies on adipose tissue are useful in understanding metabolic and other conditions. Human subcutaneous adipose tissue is accessible. With appropriate ...